УДК 617.51/.53-006.61:576.322:577.2
Актинсвязывающие белки системного кровотока при раке гортани: связь с циркулирующими опухолевыми клетками и клетками иммунной системы
Г. В. Какурина*, М. Н. Стахеева, И. А. Бахронов, Е. Е. Середа, О. В. Черемисина, Е. Л. Чойнзонов, И. В. Кондакова
Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский
медицинский центр РАН, Томск, 634050 Россия
*E-mail: kakurinagv@oncology.tomsk.ru
Поступила в редакцию 13.04.2021
Принята к печати 30.07.2021
DOI: 10.32607/actanaturae.11413
РЕФЕРАТ Рассмотрена перспективность использования актинсвязывающих белков (АСБ), циркулирующих в системном кровотоке, в качестве дополнительных прогностических факторов опухолевого заболевания. Оценка связи циркулирующих АСБ с их возможными клеточными источниками в системном кровотоке поможет определить их диагностическую ценность. С этой целью уровень АСБ, циркулирующих в кровотоке, сопоставлен с количеством АСБ в лейкоцитах и опухолевых клетках (ЦОК), циркулирующих в крови больных высокоагрессивным плоскоклеточным раком гортани. Уровень циркулирующих АСБ (кофилина (CFL1), профилина (PFN1), эзрина (EZR), фасцина (FSCN1) и белка 1, ассоциированного с аденилилциклазой (CAP1)) определяли с использованием иммуноферментного анализа. Экспрессию АСБ в клеточных пулах анализировали методом проточной цитофлуориметрии. В сыворотке крови больных раком гортани наиболее представлены белки FSCN1 и EZR. Лейкоциты и ЦОК различались уровнем экспрессии АСБ. Лейкоциты были в основном представлены пулами CAP1+ и FSCN1+, ЦОК - субпопуляциями CAP1+, FSCN1+ и EZR+. Уровень FSCN1 в сыворотке коррелировал с количеством лейкоцитов FSCN1+ и CFL1+. Возможно, уровень EZR в циркуляции связан с его экспрессией в ЦОК, а уровень CFL1 и PFN1 поддерживается их экспрессией лейкоцитами. Источником FSCN1 и САР1 в крови могут быть как ЦОК, так и лейкоциты. Выявленные закономерности могут быть обусловлены тканевой специфичностью плоскоклеточного рака гортани и/или отражать иммунный ответ на опухолевый рост в целом.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА актинсвязывающие белки, циркулирующие опухолевые клетки, лейкоциты, плоскоклеточный рак гортани.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ РГ - плоскоклеточный рак гортани; АСБ - актинсвязывающие белки; ЦОК -циркулирующие опухолевые клетки; САР1 - белок 1, ассоциированный с аденилилциклазой; CFL1 -кофилин 1; PFN1 - профилин 1; EZR - эзрин; FSCN1 - фасцин 1.
ВВЕДЕНИЕ
Основной причиной смертности онкологических больных считается метастазирование. Изучение биологических процессов, связанных с метаста-зированием, важно для поиска прогностических маркеров опухолевой прогрессии [1]. Активно ведутся исследования по профилированию протео-ма сыворотки/плазмы крови онкологических больных с помощью масс-спектрометрических методов.
Плоскоклеточный рак гортани (РГ) - один из агрессивных типов рака, что делает его хорошей моделью для изучения механизмов метастазирования [2-4]. Ранее мы выявили различия в составе про-теома сыворотки крови больных РГ и здоровых доноров, а также связь нескольких функционально различных белков, в том числе актинсвязы-вающего белка САР1 (белок 1, ассоциированный c аденилилциклазой) [4], с метастазированием РГ.
Актинсвязывающие белки (АСБ) координируют перестройку актинового цитоскелета, которая тесно связана с метастазированием. Достаточно широко исследуется уровень АСБ в опухолях [5-7], АСБ, циркулирующие в системном кровотоке (цАСБ), изучены недостаточно. Ранее обнаружено изменение сывороточных уровней САР1, профилина 1 и фасцина 1 у больных РГ со стадией T3-4N0-1M0 по сравнению с T1N0M0 [8]. Уровень цАСБ в системном кровотоке, вероятно, может поддерживаться несколькими источниками, в том числе иммунными и циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК). Связь между цАСБ и их возможными клеточными источниками в системном кровотоке практически не изучена. Поэтому в настоящей работе уровень цАСБ в сыворотке крови сопоставлен с их экспрессией в популяциях лейкоцитов и ЦОК системного кровотока с целью определения связи между этими показателями. В качестве модели агрессивного типа опухоли с высокой вероятностью метастазирования использовали образцы периферической крови больных РГ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материал и характеристика групп
В исследование вошли 13 больных РГ, стадии T2-4N0-2M0 (T2-4N0M0 - четыре человека, T2-4N1-2M0 - девять), с морфологически верифицированным диагнозом, которые не получали противоопухолевого лечения. Средний возраст больных составил 57 (52-63) лет. Сыворотку крови для имму-ноферментного анализа получали по утвержденному протоколу и хранили при -80°C. При проведении проточной цитофлуориметрии использовали образцы свежесобранной крови. Все манипуляции проведены при условии добровольного участия и конфиденциальности в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 года. Исследование разрешено этическим комитетом НИИ онкологии ТНИМЦ. Все участники исследования подписали информированное согласие.
Методы исследования
Анализ цАСБ периферической крови проводили с помощью иммуноферментного метода на микропланшетном ридере Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции к наборам. Использовали наборы ELISA (Cloud-Clone Corp.): CAP1 (SEB349Hu), PFN1 (SEC233Hu), CFL1 (SEB559Hu), FSCN1 (EB757Hu), EZR (SEB297Hu).
Экспрессию АСБ в лейкоцитах и ЦОК анализировали методом проточной цитофлуориметрии на цитофлуориметре BD FACS Canto II (BD, США). Общий пул лейкоцитов и популяции ЦОК идентифицировали, используя мечение клеток крови специфичными флуоресцентными маркерами CD45 (AF700 (BD)) и EpCAM (PerCPCy5.5 (BD)) соответственно. Экспрессию АСБ в клеточных пулах оценивали с использованием моноклональных антител мыши против эзрина (pY353) человека, конъюги-рованных с AF488 (BD); поликлональных антител кролика против CFL1 человека, конъюгированных с АРС (Cloud-Clone Corp); поликлональных антител кролика против PFN1 человека, конъюгированных с АF647 (Cloud-Clone Corp); поликлональных антител кролика против FSCN1 человека, конъюгированных с РЕ (Biorbyt); неконъюгированных моноклональных антител кролика против САР1 человека (Abcam, Великобритания); козьих антител против антител кролика, конъюгированных с AF488 (Abcam) в качестве вторых антител для САР1. Стратегия гейтирования включала этапы разделения клеток крови на CD45+ клетки (лейкоциты) и CD45- клетки. Из гейта CD45+ лейкоцитов выделяли гейты САР1+, EZR+, PFN1+, CFL1+, FSCN1+ клеток и определяли их количество в процентах от общего пула лейкоцитов. Из гейта CD45- клеток выделяли CD326 (EpCAM)+ клетки, принимая их за циркулирующие опухолевые клетки, из ЦОК CD326 (EpCAM)+ последовательно выделяли названные выше популяции и оценивали их количество в пуле ЦОК. Результаты выражали как % CD45+ и EpCAM+ клеток, экспрессирующих указанные АСБ.
Статистический анализ
Данные обрабатывали с помощью программы IBM SPSS Statistics 22.0. Существование связи и ее силу оценивали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). Результаты представлены в виде Ме (Q1; Q3), где Ме - медиана, Q1 и Q3 - нижний и верхний квартили. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью иммуноферментного анализа мы определили содержание цАСБ в сыворотке крови больных РГ. Наибольшими были уровни FSCN1 и EZR, медианы которых составили 1.8 (0.43-8.1) и 2.1 (1.69-2.56) нг/мл соответственно, наименьшими - САР1, затем PFN1 и CFL1, медианы которых составили 0.11 (0.08-1.15), 0.28 (0.23-0.38) и 0.78 (0.63-1.14) нг/мл соответственно. Разброс со-
13
12
s m 11
0
a * 10
s X 9
0 8
a
0 m 7
.0 и 6
-г 5
a)
on
га a 4
ю 0 3
2
1
10
20
30
40 EZR
50 60 FSCN1 CFL1
70 80 CAP1 PFN1
90
100%
Рис. 1. Уровни циркулирующих актинсвязывающих белков в сыворотке крови больных плоскоклеточным раком гортани. По оси ординат -образцы сыворотки крови,взятые у больных РГ, по оси абсцисс -относительное количество актинсвя-зывающих белков, в % от суммарного содержания цАСБ, принятого за 100%
0
Patient Z, sample
sample
о :
о ■
CD45+CFL1+ cells о
о С S : gs . о s о
о о -
О;
-
sample
CD45+PFN1 + cells
103 104 Cofillin APC-A
,03 104 105 AF647 Profilin APC-A
103
Fascin PE
103 104 AF488 CAP1 FITC-A
03 104 AF488 Ezrin FITC-A
Рис. 2. Относительное количество лейкоцитов, экспрессирующих актинсвязывающие белки СD45+, у больных раком гортани. А - гейты CD45- и СD45+ клеток периферической крови. Гистограммы содержания актинсвязывающих белков в CD45+ клетках: Б - уровень СD45+ клеток, содержащих CFL1; В - уровень PFN1-содержащих CD45+ клеток; Г - уровень FSCN1 -содержащих CD45+ клеток; Д - уровень САР1 -экспрессирующих и Е - уровень EZR-содержащих CD45+ клеток
Б
В
держания каждого из этих белков в сыворотке крови больных РГ представлен на рис. 1.
Далее определено содержание АСБ в пулах ЦОК (CD45-CD326+) и лейкоцитов (CD45+CD326-) в цельной крови больных РГ. На представленной выборке больных РГ показано, что медиана уровня ЦОК CD45-CD326+ составила 0.006 (0.00-0.1) %
от всех клеточных элементов крови (на 50000 клеток крови). Выявлены различия в относительном содержании всех АСБ в популяциях ЦОК CD45-CD326+ и CD45+ лейкоцитов (рис. 2, 3).
Относительное количество CD45-CD326+ ЦОК и CD45+ лейкоцитов, экспрессирующих АСБ, у больных РГ представлено в таблице. У больных РГ ЦОК
Patient Z, sample
<u "С
U
Iл
CD45+ CD326- cells
?6- cells
CD45+ CD326+ cell
CD45-CD326+ cells
T—г TT ITl
sample
CD45- CD326+ CFL1 + cells
-1—гптгп I-1—г ■- г T
"П 104
sample
С □
О
U
CD45- CD326+ PFN1+ ce
С □
О
и
sample
Г
Cofillin APC-A
sample
"Г"'1 ............—' ' "I
103 104 105
AF647 Profilin APC-A
102 1 03 1 04 Fascin PE
AF488 CAP1 FITC-A
03 104 105 AF488 Ezrin FITC-A
Б
В
CD45- CD32(
FSCN1+ cel
Рис. 3. Относительное количество содержащих актинсвязывающие белки опухолевых клеток (CD45-CD326+), циркулирующих в периферической крови больных раком гортани. А - гейт CD45-СD326+ клеток (ЦОК) периферической крови. Гистограммы содержания актинсвязывающих белков в ЦОК: Б - уровень ЦОК, содержащих CFL1; В - уровень PFN1-содержащих ЦОК; Г - уровень FSCN1-содержащих ЦОК; Д - уровень САР1-экспрессирующих и Е - уровень EZR-содержащих ЦОК
CD45-CD326+ в основном представлены субпопуляциями FSCN1+ и САР1+, медиана которых составила 91.8 (87.2-100) и 87.0 (61.5-100) % соответственно. Снижено содержание ЦОК CD45-CD326+, экспрес-сирующих PFN1 и CFL1: 0.2 (0.0-0.5) и 0.3 (0.0-0.5) % соответственно. Популяция CD45+ лейкоцитов представлена в основном CAP1+ и FSCN1+ клетками: 45.3 (4.6-55.3) и 34.5 (31.3-72.1) % соответственно. Понижено содержание субпопуляции EZR+ CD45+ лейкоцитов, доля которой составила 0.3 (0.14-0.91) %. EZR экспрессировался в основном ЦОК - 51.5 (39.3-85.4) %.
Анализ взаимосвязей уровня цАСБ и количества клеточных субпопуляций, экспрессирующих соответствующий белок, выявил связи средней силы. Так, уровень циркулирующего FSCN1 коррелировал с количеством FSCN+ и CFL1+ субпопуляциями CD45+ лейкоцитов (г = 0.7; p = 0.03). Также в кровотоке больных РГ выявлены связи между изучаемыми пулами, экспрессирующими АСБ. Отмечена отрицательная связь между пулом CD45-CD326+ лейкоцитов, содержащих FSCN+, и CD45+ лейкоцитами, содержащими FSCN+ (г= -0.7; p = 0.01)
Уровень актинсвязывающих белков (АСБ) в сыворотке крови, относительное количество CD45-CD326+ циркулирующих опухолевых клеток и CD45+ лейкоцитов, экспрессирующих актинсвязывающие белки, у больных плоскоклеточным раком гортани
цАСБ Лейкоциты, CD45+, % ЦОК, CD45-CD326+, % Сыворотка крови, нг/мл
EZR 0.6 (0.3-1.0) 51.5 (39.3-85.4) 1.2 (0.9-1.7)
FSCN1 34.5 (31.3-72.1) 91.8 (87.2-100) 1.5 (0.8-2.2)
CFL1 12.0 (8.5-39.1) 0.3 (0.0-0.5) 0.5 (0.3-0.6)
CAP1 45.3 (4.6-55.3) 87.0 (61.5-100) 0.10 (0.06-0.14)
PFN1 5.7 (4.0-13.2) 0.2 (0.0-0.5) 0.2 (0.1-0.4)
и CFL1+ (г = -0.7; р = 0.03). Обнаружена положительная связь между САР1+ CD326+ и САР1 + CD45+ (г = 0.7; р = 0.02). На уровне лейкоцитарного пула выявлена связь между EZR+ и CFL1+ CD45+ лейкоцитами.
В настоящей работе показано, что содержание белков FSCN1 и EZR в системном кровотоке больных РГ было выше, чем других цАСБ. Установлено, что лейкоциты и ЦОК в периферической крови различаются экспрессией АСБ. Выявлена связь между сывороточным уровнем FSCN1 и количеством FSCN- и CFLl-содержащих CD45+ лейкоцитов. Отмечено, что в обеих клеточных популяциях была увеличена экспрессия САР1 и FSCN1. Однако отмечены выраженные различия в содержании этих белков в ЦОК и лейкоцитах. Если практически все ЦОК содержали САР1 и FSCN1, то доля CAP1 + и FSCN1+ лейкоцитов была ниже в 2 и 3 раза соответственно. В популяции CD45+ лейкоцитов практически отсутствовали клетки, содержащие EZR, в то время как доля EZR+ CD326+ составляла 51.5% от пула ЦОК. CFL1 и PFN1 содержались в лейкоцитах, но практически отсутствовали в ЦОК. Таким образом, опухолевые клетки, циркулирующие в крови больных РГ, могут экспрессировать несколько АСБ - EZR, CAP1 и FSCN1.
Сопоставляя результаты проточной цитофлуо-риметрии и иммуноферментного анализа, можно предположить, что присутствие EZR в циркуляции может быть связано с его наличием в ЦОК. Уровень циркулирующих в крови CFL1 и PFN1 поддерживается, вероятно, экспрессией этих белков лейкоцитами. Сывороточный уровень FSCN1 и САР1 может быть связан как с ЦОК, так и с лейкоцитами.
Участие АСБ в патогенезе опухолевых заболеваний изучено в основном, исходя из результатов определения их тканевого уровня [7, 9, 10]. В качестве прогностического маркера опухолей
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гапонова А.В., Родин С., Мазина А.А., Волчков П.В. // Acta Naturae. 2020. Т. 12. № 3(46). С. 4-23. doi: 10.32607/ actanaturae.11010
2. Bhawal R., Oberg A.L., Zhang S., Kohli M. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. № 9. P. 2428. doi:10.3390/cancers12092428
3. Gasparri R., Sedda G., Noberini R., Bonaldi T., Spaggiari L. // Proteomics Clin. Appl. 2020. V. 14. № 5. P. 1900138. doi: 10.1002/prca.201900138
4. Какурина Г.В., Кондакова И.В., Черемисина О.В. Шишкин Д.А., Чойнзонов Е.Л.// Бюл. эксп. биол. и мед. 2015. Т. 160. № 11. С. 648-651.
5. Gross S.R. // Cell Adh Migr. 2013. V. 7. № 2. P. 199-213. doi: 10.4161/cam.23176
6. Liu H., Cui J., Zhang Y., Niu M., Xue X., Yin H., Tang Y., Dai L., Dai F., Guo Y., et al.// IUBMB Life. 2019. V. 71. № 11.
головы и шеи предложено использовать уровни фасцина в тканях опухолей этой локализации [https://www.proteinatlas.org; 11]. Итак, опубликованы результаты изучения АСБ в тканях новообразований, в которых наиболее вероятным и основным источником этих белков являются опухолевые клетки. Значение цАСБ при патологических состояниях, в том числе и при опухолях, изучено крайне мало. Например, показано, что внеклеточный гельзолин (pGSN) расщепляет актин, который может высвобождаться при повреждении клеток [12]. Вероятно, АСБ, изученные в представленной работе, также функционально активны в сыворотке крови, что может стать предметом следующих исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе впервые получены данные о связи функционально различных АСБ, циркулирующих в системном кровотоке, с популяциями ЦОК и иммунных клеток, экспрессирующих соответствующие белки при раке гортани. Выявленные связи и различия в содержании АСБ в ЦОК и лейкоцитах могут быть связаны как со специфичностью опухоли этой локализации, так и/или отражать иммунный ответ организма на опухолевый рост в целом. Для окончательных выводов необходимо продолжение работы с увеличением количества больных РГ и включением дополнительных клини-ко-морфологических параметров.
Работа поддержана грантом РФФИ № 20-015-00151.
P. 1771-1784. doi: 10.1002/iub.2121
7. Kakurina G.V., Kolegova E.S., Kondakova I.V. // Biochemistry (Moscow). 2018. V. 83. № 1. Р. 45-53.
8. Какурина Г.В., Шашова Е.Е., Черемисина О.В., Чойнзонов Е.Л., Кондакова И.В. // Сибирский онкологический журн. 2020. Т. 19. № 4. С. 88-93.
9. Coumans J.V.F., Davey R.J., Moens P.D.J. // Biophys. Rev. 2018. V. 10. № 5. Р. 1323-1335.
10. Izdebska M., Zielinska W., Grzanka D., Gagat M. // BioMed. Res. Int. 2018. V. 2018. P. 4578373. doi: 10.1155/2018/4578373
11. Papaspyrou K., Brochhausen C., Schmidtmann I., Fruth K., Gouveris H., Kirckpatrick J., Mann W., Brieger J.// Oncol. Lett. 2014. V. 7(6). P. 2041-2046.
12. Piktel E., Levental I., Durnas B., Janmey P.A., Bucki R. // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. № 9. P. 2516.