Адсорбция хитозаном из вешенки обыкновенной Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli и ионов тяжелых металлов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.011.4+544.723.21 http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-11-70-75

АДСОРБЦИЯ ХИТОЗАНОМ ИЗ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS, ESCHERICHIA COLI И ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Раевских В.М., Ельчанинова С.А., Гартман О.Р. ФГБОУВО «Алтайский государственный медицинский университет», г. Барнаул, Российская Федерация Аннотация. Природный биополимер хитозан (полиМ-аце-тил-1,4-Ь-0-глюкопиранозамин) используется в производстве различных лекарственных средств. Разработан способ получения этого биополимера из вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) и показано, что полученный хитозан сходен по химическому составу к хитозану из панцирей ракообразных. Цель исследования - оценка сорбционной способности хи-тозана из вешенки обыкновенной по отношению к ионам тяжелых металлов, стафилококку эпидермальному (Staphylococcus epidermidis) и кишечной палочке (Escherichia coli). Результаты. Концентрация катионов цинка, свинца, меди, кадмия и марганца в водных растворах (0,5; 1,0; 5,0; 10,0 от предельно допустимых концентраций по ГОСТР 5123298 Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества) снижалась после экспозиции с хитозаном (1 г на 1 л) на протяжении 10-ти минут на 5096%. Снижение концентрации было наибольшим для ионов цинка, свинца и кадмия. Экспозиция хитозана как с E. mli, так и со S. epidermidis приводила к уменьшению колониеоб-разующих единиц этих бактерий в водных взвесях этих бактерий на 98-100% через 24 часа. Ключевые слова: хитозан, вешенка обыкновенная, адсорбция, тяжелые металлы, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli ADSORPTION OF CHITOSAN FROM OYSTER MUSHROOM STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS, ESCHERICHIA COLI AND HEAVY METAL IONS Raevskikh V.M., Elchaninova S. A., Gartman O.R. Altai state medical university, Barnaul, Russian Federation Annotation. Natural biopolymer chitosan (poly-N-acetyl-1,4-b-D-glucopyranose) used in the production of various medicines. A method for producing this biopolymer from oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) was developed and it was shown that the resulting chitosan is similar in chemical composition to chitosan from the shells of crustaceans. The aim of the study was to assess the sorption capacity of chi-tosan from oyster mushroom in relation to heavy metal ions, Staphylococcus epidermis and Escherichia coli. Results. The concentration of zinc, lead, copper, cadmium and manganese cations in aqueous solutions (0.5, 1.0, 5.0, 10.0 of the maximum permissible concentrations according to GOST R 51232-98 Drinking water. General requirements for organization and quality control methods) decreased after exposure to chitosan (1 gper 1 l) for 10 minutes by 50-96%. The decrease in concentration was greatest for zinc, lead and cadmium ions. Exposure of chitosan with both E. coli and S. epidermidis resulted in reduction of colony-forming units in aqueous suspensions of these bacteria by 98-100% after 24 hours. Conclusion. Оyster mushroom chitosan has a high sorption capacity against zinc, lead, manganese, copper and cadmium cations, as well as S. epidermidis and E. coli. This makes it possible to predict the effective use of this natural anionic biopolymer as a component of pharmaceutical products, as well as filtration systems for drinking water purification along with chitosan from the shells of crustaceans. Key words: chitosan, oyster mushroom, adsorption, heavy metals, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Chitosan in Molecularly-Imprinted Polymers: Current and Future Prospects / L. Xu [et al.] // Int J Mol Sci. 2015. V. 16(8). Р. 1832818347. doi: 10.3390/ijms160818328 [2] Chitosan as a starting material for wound healing applications / V. Patrulea [et al.] // Eur J Pharm Biopharm. 2015. V. 97(Pt B). Р. 417-426. doi: 10.1016 [3] Chitin, chitosan, and its derivatives for wound healing: old and new materials / K. Azuma [et al.] // Funct Biomater. 2015. V. 6(1). Р. 104-142. doi: 10.3390 [4] Макромолекулярные системы и нанокомпозиты на основе n-сукцинилхитозана и наночастиц серебра / В.А. Александрова REFERENCES [1] Xu L., Huang Y.A., Zhu Q.J., Ye C. Chitosan in Molecularly-Imprinted Polymers: Current and Future Prospects. Int J Mol Sci. 2015;16(8): 18328-18347. Available from: doi: 10.3390/ijms160818328. [2] Patrulea V., Ostafe V., Borchard G., Jordan O. Chitosan as a starting material for wound healing applications. Eur J Pharm Bio-pharm. 2015;97(Pt B): 417-426. Available from: doi: 10.1016. [3] Azuma K., Izumi R., Osaki T., Ifuku S., Morimoto M., Saimoto H., et al. Chitin, chitosan, and its derivatives for wound healing: old and new materials. J Funct Biomater. 2015;6(1): 104-142. Available from: doi: 10.3390.

и др.] // Известия Академии наук. Серия химическая. 2018. № 4. С. 757-761. doi: 10.1007/s11172-018-2133-4

[5] Production and evaluation of dry alginate-chitosan microcapsules as an enteric delivery vehicle for probiotic bacteria / M.T. Cook [et al.] // Biomacromolecules. 2011. V. 12(7). Р. 2834-2840. doi: 10.1021/bm200576h

[6] Критченков А.С., Andranovits S., Скорик Ю.А. Хитозан и его производные: векторы в генной терапии // Успехи хи-мии.2017. 86:3. С. 231-239 doi: 10.1070

[7] Гидрогелевые наночастицы конъюгата хитозана и фолиевой кислоты с метансульфонатом иматиниба / М.Э. Лозовская [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. 2018. Т. 52, № 2. С. 22-27. doi:10.30906/0023-1134-2018-52-2-22-27

[8] Оценка функциональной активности специфического противохолерного энтеросорбента / М.В. Овчинникова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. № 2. С. 83-86. doi:10.21055/0370-1069-2015-2-83-86

[9] Хитозан - перспективный материал для выделения и концентрирования радионуклидов из природных и техногенных сред / А.Н. Велешко [и др.] // Экологические системы и приборы. 2013. № 11. С. 8-15.

[10] Тарановская Е.А., Собгайда Н.А., Маркина Д.В. Сорбцион-ные материалы на основе хитозана для очистки стоков от ионов тяжелых металлов // Экология и промышленность России. 2016. Т. 20, № 5. С. 34-39. DOI: 10.18412/1816-03952016-5-34-39

[11] Hirano S. Chitin biotechnology applications // Biotechnol Annu Rev. 1996. V. 2. Р.237-258. doi: 10.1016/s1387-2656(08)70012-7

[12] Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов / Е.П. Феофилова [и др.] // Прикл.биохимия и микробиология. 1980. Т. 24. С. 377-381.

[13] Способ получения хитозана: пат. 2117673 Рос. Федерация. № 95121269/04 / Иванов А.В., Гартман О.Р., Цветкова А.В., Полторацкая Е.Б.; заявл. 26.12.1995; опубл. 20.08.1998

[14] Influence of manufacturing variables on the characteristics and effectiveness of chitosan products. Chemical composition, viscosity and molecular weight distribution of chitosan products / W.A. Bough [et al.] // Biotechonol. And Bioeng, 1978. V. 20(12). P.1931-1943. doi:10.1002/bit.260201208

[15] Контроль производства химических волокон / под ред. А.Б. Пакшвера, А.А. Конкина. М.: Химия, 1967. 205 с.

[16] Общая фармакопейная статья. Определение белка. 0ФС.1.2.3.0012.15// Государственная фармакопея Российской Федерации. Изд.XIII. Т. 1.

[17] Ермаченко Л.А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарно - гигиенических исследованиях / под ред. Л.Г. Подуновой. М.: Чувашия, 1997. 208 с.

[18] ГОСТ Р 51232-98. Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества. М.: ФГУП Стандар-тинформ, 2010.18 с.

[19] Comparison of the activity of four chitosan derivatives in reducing initial adherence of oral bacteria onto tooth surfaces / H. Sano [et al.] // Bull.Tokyo Dent.Coll. 2001. V. 42: Р. 243-249. doi:10.2209

Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl.

Environ. Microbiol. 2000. V. 69(2). P. 261-265. doi: 10.1128

[4] Alexandrova V.A., Revina A.A., Busev S.A., Sadykova V.S. Macromolecular systems and nanocomposites based on N-suc-cinylchitosan and silver nanoparticles. Russian Chemical Bulle-tin.2018.4: 757-761. Available from: doi: 10.1007/s11172-018-2133-4.

[5] Cook M.T., Tzortzis G., Charalampopoulos D., Khutoryanskiy V.V. Production and evaluation of dry alginate-chitosan microcapsules as an enteric delivery vehicle for probiotic bacteria. Bi-omacromolecules. 2011;12(7): 2834-2840. Available from: doi: 10.1021/bm200576h.

[6] Kritchenkov A.S., Andranovits S., Skorik Y.A. «Chitosan and its derivatives: vectors in gene therapy». RUSS CHEM REV. 2017; 86(3): 231-239. Available from: doi:10.1070.

[7] Lozovskaya ME, Kulikovskaya VI, Ignatovich ZhV, Koroleva EV, Agabekov VE. Hydrogel Nanoparticles of Chitosan-Folic-Acid Conjugate with Imatinib Methanesulfonate. Pharmaceutical Chemistry Journa.l. 2018;52(2): 127-132. Available from: doi: 10.1007/s11094-018-1777-6.

[8] Ovchinnikova M.V., Islyaeva M.N., Nikolaev V.G., Bardakhivskaya K.I., Nikiforov A.K. Evaluation of the Functional Activity of the Specific Anticholeraic Enterosorbent. Problems of especially dangerous infections. 2015;2: 83-86. Available from: doi:10.21055/0370-1069-2015-2-83-86.

[9] Veleshko A.N., Veleshko I.E., Rumyantseva E.V., Dmitrieva N.A. Chitosan: perspictive material for separation and concen-trationradionuclides from environmental and industrial solutions. Environmental systems and devices. 2013;11: 8-15.

[10] Taranovska E.A., Sobgayda N.A., Markina D.V. Sorption materials based on chitosan for wastewater treatment from ions of heavy metals. Ecology and industry of Russia. 2016; 20(5): 3439. Available from: doi: 10.18412/1816-0395-2016-5-34-39.

[11] Hirano S. Chitin biotechnology applications. Biotechnol Annu Rev. 1996;2: 237-58. Available from: doi: 10.1016/s1387-2656(08)70012-7.

[12] Feofilova E.P., Tereshina V.M., Ivanova N.I., Genin Y.V., Go-pepgauz F.L. Comparative investigation of the physicochemical properties of chitin from crustaceans and some microscopic fungi. Applied Biochemistry and Microbiology.1980; 24: 377381.

[13] Method of chitosan preparing. Ivanov A.V., Gartman O.R., Tsvetkova A.V., Poltoratskaja E.B. The patent for invention RUS 2117673. № 95121269/04

[14] Bough W.A., Salter W.L., Wu ACM, Perkins B.E. Influence of manufacturing variables on the characteristics and effectiveness of chitosan products. Chemical composition, viscosity and molecular weight distribution of chitosan products. Biotechonol. And Bioeng. 1978; 20(12): 1931-1943. Available from: doi:10.1002/bit.260201208.

[15] Control of production of chemical fibers /ed Pakshver B.A., Kon-kin A.A. Moscow: Chemistry; 1967. 205 p.

[16] FFS.1.2.3.0012.15 Determination of protein. General Pharmacopoeia monograph.

[17] Ermachenko A.L. Atomic absorption analysis in sanitary - and-hygienic researches. Ed. by L.G. Podunova. Moscow: the Chuvash Republic; 1997. 208 p.

[18] GOST R 51232-98 Drinking water. General requirements for organization and quality control methods. Moscow: Standartinform Publ; 2010. 18 p.

[19] Sano H., Shibasaki R., Takaesu Y., Matsukubo T. Comparison of the activity of four chitosan derivatives in reducing initial adherence of oral bacteria onto tooth surfaces. Bull.Tokyo Dent.Coll. 2001; 42: 243-249. Available from: doi:10.2209.

[20] Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 69(2): 261-265. Available from: doi: 10.1128.

Введение. В настоящее время в производстве различных лекарственных средств все более широкое применение находит природный биополимер хитозан (поли-Ы-ацетил-1,4-Ъ-Э-глюкопиранозамин). Это обусловлено тем, что хитозан и его производные обладают хорошей биосовместимостью с тканями живых организмов, биодеградируемостью, неиммуногенными и выраженными сорбционными свойствами [1]. Интенсивно исследуется возможность использования хито-зана и его производных для раневых покрытий с различными иммобилизованными фармацевтическими субстанциями [2-4], микрокапсулирования пробиоти-ков для повышения их выживаемости в желудочно-кишечном тракте [5], в качестве векторов для доставки нуклеиновых кислот в генной терапии [6], структурных компонентов нано- и микроконтейнеров для биологически активных веществ (полимерная матрица), обеспечивающих целенаправленную их доставку и/или пролонгированное высвобождение [7].

Одно из традиционных направлений использования хитозана не только в медицине, но и в очистке питьевой воды из подземных источников и открытых водоемов от примесей основано на его способности как полианиона адсорбировать ионы металлов, в том числе их радиоактивные изотопы, а также органические вещества (бактериальные токсины, продукты гниения белков и др.) за счет образования водородных и гидрофобных связей [8-10].

Хитозан получают деацетилированием хитина. Наиболее масштабным традиционным сырьевым источником для получения хитина являются панцири ракообразных [11]. Это сырье имеет ряд недостатков, среди которых особую обеспокоенность вызывает загрязненность тяжелыми металлами и ядовитыми отходами производств. В то же время установлено, что хитин из грибов, в частности, из вешенки обыкновенной (Р1еш^ш ostreatus) сходен по своим физико-химическим свойствам с хитином ракообразных [12]. Следовательно, вешенка обыкновенная вполне может служить сырьем для получения хитина и его производных.

Преимуществом этого сырья по сравнению с традиционным является возможность искусственного круглогодичного выращивания вешенки при относительно низкой себестоимости. Кроме того, для производства хитина могут быть использованы обломки шляпок, обрезки ножек вешенки, которые составляют около 30% собираемого урожая грибов. Ранее нами с соавторами была разработан способ получения из грибов рода Ве-шенка хитозана с высокой степенью деацетилирования и высокой степенью полимеризации [13]. Представлялось актуальным изучение свойств полученного этим способом хитозана, лежащих в основе наиболее востребованных развивающихся направлений использования в медицине и фармации.

Цель исследования - оценка сорбционной способности хитозана из вешенки обыкновенной по отношению к ионам тяжелых металлов, стафилококку эпи-дермальному (Staphylococcus epidermidis) и кишечной палочке (Escherichia coli).

Материалы и методы исследования. Использованный в исследовании препарат хитозана из ве-шенки обыкновенной соответствовал обшепринятым характеристикам качества: степень его деацетилирова-ния была 92,4%, зольность - менее 0,1%, вязкость -16,7 дл/г. Хитозан представлял собой светло-желтый, мелкий порошок, без запаха, растворимый в 2% уксусной кислоте. По результатам элементного анализа и абсорбция светового излучения в инфракрасной области спектра хитозан из вешенки обыкновенной имел такое же соотношение углерода, водорода и азота (43,6%, 6,5%, 7,1% соответственно), как и хитозан из краба камчатского (43,7%, 6,4%, 7,4% соответственно).

Степень дезацетилирования хитозана определяли методом кондуктометрического титрования [14]; вязкость растворов хитозана методом вискозиметрии с использованием модифицированного вискозиметра Уб-белоде при 298 К; зольность сжиганием образца [15]; белок биуретовым методом [16]. Спектры поглощения хитина и хитозана в инфракрасной области регистрировали на спектрофотометре Specord (Analytik Jena AG, ФРГ).

В исследовании адсорбции ионов тяжелых металлов хитозаном концентрацию ионов металлов в водных растворах определяли методом атомно-абсорбци-онной спектрометрии [17] на спектрометре Квант (Кортэк, Россия). Использовали водные растворы катионов цинка, свинца, меди, кадмия и марганца, приготовленные по ГОСТ Р 51232-98 [18] из прецизионных стандартных растворов солей. Исходные концентрации катионов в растворах были равны 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 от предельно допустимых концентраций (ПДК). В соответствии с ГОСТ Р 51232-98 ПДК в питьевой воде для катионов цинка, свинца, меди, кадмия и марганца составляют 5,0; 0,03; 1,0; 0,001 и 0,1 мг/л соответственно. Адсорбцию оценивали через 10 минут после внесения хитозана в раствор (1 г на 1 л). Данное время экспозиции было основано на результатах предварительно проведенных нами экспериментов, которые показали, что адсорбционное равновесие во всем исследованном диапазоне концентраций катионов металлов в экспериментальной модели наступает в течение 10 мин.

В эксперименте по оценке антибактериальной активности хитозана использовали суточную культуру стафилококка эпидермального (Staphylococcus epidermidis) и кишечной палочки (Escherichia coli) -представителей наиболее распространенной условно патогенной флоры. Штаммы этих микроорганизмов

были выделены из фекалий и отделяемого влагалища пациентов, не имеющих клинических признаков заболеваний (практически здоровых людей). Взвесь бактерий в физиологическом растворе (0,9% NaCl) выдерживали при комнатной температуре при периодическом перемешивании с хитозаном и без него (соответственно опыт и контроль). Хитозан добавляли в количестве 1 г на 1 л взвеси микроорганизмов.

Через 5, 24 и 48 часов экспозиции из опытной и контрольной проб делали мерные высевы на чашки с мя-сопептонным агаром. Через 2 суток культивирования при 370С в аэробных условиях оценивали количество колонии образующих единиц (КОЕ).

Статистический анализ выполнен в программе Sta-tistica v. 6.0 (StatSoft Inc., США). Множественные межгрупповые различия оценивали по критерию Краскела-Уоллиса, парные межгрупповые различия - по критерию Манна-Уитни, корреляции - по критерию Спир-мена (rs) с критическим уровнем значимости для всех критериев р <0,05. Результаты представлены в виде медианы с указанием 95% доверительного интервала.

Результаты исследования и их обсуждение. Экспериментальные данные по сорбции катионов тяжелых металлов представлены на рисунке 1, из которого видно, что после экспозиции хитозана с водными растворами исследованных катионов металлов концентрация последних существенно снижалась.

Снижение было особенно значительным для ионов цинка, свинца и кадмия. Даже при исходных концентрациях этих катионов в 5-10 раз превышающих ПДК после сорбции их оставалось меньше, чем допустимо стандартами для питьевой воды (менее 1 ПДК, менее 5,0; 0,03; 0,001 мг/л для цинка, свинца, кадмия соответственно). Это может свидетельствовать о более высокой селективности хитозана к ионам цинка, свинца и кадмия, чем меди и марганца.

Наблюдалось повышение процента адсорбции с увеличением исходной концентрации ионов свинца, цинка, марганца и меди (по критерию Краскела-Уол-лиса р=0,021, р=0,009, р=0,011, р=0,038 соответственно).

Соотношение исходной концентрации и ПДК

Ц инг —♦—Свинец —Л.— Марганец —О—Медь —О—Кадмий

Рис. 1. Адсорбция хитозаном из гриба вешенка обыкновенная катионов металлов из водных растворов

При исследовании антибактериальной активности установлено, что экспозиция хитозана как с Е. со И, так и со 8. ер1с1епшси5 приводила к значительному

уменьшению количества бактерий относительно контрольных проб на протяжении всего времени эксперимента (рис. 2, 3).

Время экспозиции

I-1 без хитозан а с хмтозан ом —уменьш ениеКОЕ

Рис. 2. Влияние хитозана из вешенки обыкновенной на содержание КОЕ во взвеси Escherichia coli

Примечание: на этом и следующих рисунках * - p <0,05; ** - p <0,01; *** - p <0,001 по критерию Манна-Уитни; + - p <0,05; + + - p <0,01; + + + - p <0,001 по критерию Краскела-Уоллиса.

о ^

а

а

(Л Ш

= О

8 * о и с

s

и

16000 14000 12000 10000 S000 6000 -4000 -3000 -о

I—I

5 час 24 час

Еремя экспозиции

100 -- 90 ВО -- 70 60 50 -- 40 -- 30 20 10 о

I &ез кнтозана

I с хитозаном

■ уменьшение КОЕ

Рис. 3. Влияние хитозана из вешенки обыкновенной на содержание КОЕ во взвеси Staphylococcus epidermidis

Это позволяет заключить, что хитозан из вешенки обыкновенной обладает выраженной антибактериальной активностью, продемонстрированной многочисленными исследованиями и для хитозана из морских ракообразных [19, 20].

Выявлялись некоторые особенности влияния хитозана на исследованные микроорганизмы. Так, в эксперименте с E. соЬ в контрольной пробе отмечался рост бактерий. При этом, в опытной пробе наблюдалось подавление роста, выраженность которого увеличивалась с увеличением времени экспозиции (см. рис. 2). Аналогичные данные были получены Rhoades J., Roller

S. (2000) при оценке антибактериальной активности хитозана из краба камчатского [20].

Механизм выявленного феномена может быть связан как с бактерицидным эффектом хитозана, так и с адсорбцией им микроорганизмов. На вклад адсорбции в антибактериальное действие хитозана указывают результаты исследования зависимости антибактериальной активности полимера от количества микроорганизмов в инкубационной среде. Как видно из рисунка 4, с увеличением концентрации бактерий в пробе процент уменьшения КОЕ растет.

^^ без хитозана с хитозаном -*-уыеньшенне КОЕ

Рис. 4. Зависимость антибактериальной активности хитозана из вешенки обыкновенной от содержания КОЕ во

взвеси Escherichia coli при 5-ти часовой экспозиции

Эта кинетическая особенность, как известно, | типична для адсорбционных процессов. Отметим, что

данная закономерность отмечалась на протяжении всех временных интервалов, о чем свидетельствовали коэффициенты корреляции между концентрацией бактерий в контроле и процентом их уменьшения при экспозиции с хитозаном (для 5 часов r=0,38, p<0,05; для 24 часов r=0,46, p<0,01; для 48 часов r=0,68, p<0,001).

На адсорбционный механизм антибактериальной активности хитозана указывают и данные Sano H. et al. (2001), согласно которым при взаимодействии этого полисахарида с микроорганизмами во взвеси не появлялось каких-либо компонентов бактериальных клеток, т.е. не происходило разрушения последних [19].

Особенностью результатов экспериментов со стафилококком является резкое уменьшение количества КОЕ в контрольной пробе на протяжении суток, что, вероятно, связано с гибелью бактерий. Однако, антибактериальный эффект хитозана проявлялся как при 5-ти часовой, так и при 24-х часовой экспозиции (рис. 5). При 5-ти часовой экпозиции, так же, как и в случае с Е. соИ, отмечалась положительная корреляция между концентрацией бактерий в контроле и процентом их уменьшения в опыте (г=0,36, р <0,05) (рис. 5).

^^ ;:-ез хитозана : хитозаном

уменьшение КОЕ

Рис. 5. Зависимость антибактериальной активности хитозана из вешенки обыкновенной от содержания КОЕ во взвеси Staphylococcus epidermidis при 5-ти часовой экспозиции

Заключение. Хитозан, полученный из вешенки обыкновенной, обладает высокой сорбционной способностью в отношении катионов цинка, свинца, марганца, меди и кадмия, а также Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli. Это позволяет прогнозировать его эффективное использование как природного анионного биополимера в составе лекарственных

средств, а также в фильтрационных системах для очистки питьевой воды наряду с хитозаном из панцирей ракообразных.

Информация о конфликте интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.