CC BY
7DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-37-41 УДК 582.282.23:611.34
Для цитирования: Прокопьев В.В., Руденко А.В., Сафьянова Т.В., Емельянова И.В., Звездкина Г.С. Адгезивная активность аскомицетных и базидиомицетных дрожжей микобиома кишечника. 2023; 25 (3): 37-41. DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-37-41
For citation: Prokoniev V.V.. Rudenko A.V.. Safvanova T.V.. Еше1уапоуа I.V.. Zvezdkina G.S. Adhesive activity of ascomvcete and basidiomy-cete yeasts of the intestinal mycobiome. Problems in Medical Mycology. 2023; 25 (3): 37-41. (In Russ). DOI: 10.24412/1999-6780-2023-3-37-41
АДГЕЗИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ACKO-МИЦЕТНЫХ И БАЗИДИОМИЦЕТНЫХ ДРОЖЖЕЙ МИКОБИОМА КИШЕЧНИКА
^Прокопьев В.В. (доцент, врач-бактериолог)*, 1 Руденко A.B. (зав. учебными лабораториями), Сафьянова Т.В. (зав. кафедрой), Емельянова И.В. (врач-бактериолог), 33вездкина Г.С. (зав. лаб.)
'Алтайский государственный медицинский университет (кафедра эпидемиологии, микробиологии и вирусологии); 2000 КДЛ «Здоровье»; 2Краевая клиническая больница, Барнаул, Россия
С появлением масс-спектрометрии и NGS-технологий количество публикаций, посвященных исследованию микробиоты кишечника, увеличилось многократно. В то же время работ по изучению грибкового компонента микробиоты кишечника человека - микобиома кишечника существенно меньше. При бактериологическом исследовании кала пациентов с патологией кишечника и у здоровых людей, проходящих плановый медицинский осмотр, были выделены аскомицетные (Pichia kudriavzevii, Pichia kluyveri, Geotrichum candidum, Wickerhamiella pararugosa, Brettanomyces bruxellensis) и бази-диомицетные (Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon asahii) дрожжи. В настоящей работе проведена оценка адгезивной активности выделенных дрожжей на буккальном эпителии человека по сравнению с Candia albicans, также полученной из кишечника. В ходе исследования обнаружено, что грибы рода Candida обладали наибольшими показателями индекса адгезии и процента участвующих в адгезии эпителиоцитов. Высокая адгезивная активность также отмечена у R. mucilaginosa, B. bruxellensis. Адгезия P. kudriavzevii, P. kluyverii, W. pararugosa была существенно ниже. T. asahii и G. candidum адгезию на буккальных эпи-телиоцитах не проявляли.
Ключевые слова: адгезивная активность, микобиом кишечника, аскомицетные дрожжи, базидиомицетные дрожжи
* Контактное лицо: Прокопьев Василий Валерьевич, e-mail: vasily78@mail.ru
ADHESIVE ACTIVITY OF ASCOMY-CETE AND BASIDIOMYCETE YEASTS OF THE INTESTINAL MYCOBIOME
1,2Prokopiev V.V. (associate professor, bacteriologist), Rudenko A.V. (head of teaching laboratory), ^afyanova T.V. (head of department), 3Emelyanova I.V. (bacteriologist), 3Zvezdkina G.S. (head of the laboratory)
1 Altai State Medical University (Department of Epidemiology, Microbiology and Virology); 2LLC CDL "Health"; Regional Clinical Hospital, Barnaul, Russia
With the advent of mass spectrometry and NGS technologies, the number of studies devoted to the study of the intestinal microbiota has increased many times. At the same time, there are significantly fewer works on the study of thefUngal component of the human intestine - the human mycobiome. In a bacteriological study of the faeces of patients with intestinal pathology and in healthy people undergoing a routine medical examination, ascomycete (Pichia kudriavzevii, Pichia kluyveri, Geotrichum candidum, Wickerhamiella pararugosa, Brettanomyces bruxellensis) and basidiomycete (Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon asahii) yeasts were isolated. In thepre-sent work, the adhesive activity of isolated yeasts on human buccal epithelium was evaluated in comparison with Candia albicans, also isolated from intestine. As a result of the study, it was found that fungi of the genus Candida had the highest index of adhesion and the percentage of epitheliocytes involved in adhesion. High adhesive activity was also noted in R. mucilaginosa and B. bruxellensis. Adhesion of P. kudriavzevii, P. kluyverii, W. pararugosa was significantly lower. T. asahii and G. candidum did not show adhesion to buccal epithelio-cytes.
Key words: adhesive activity, intestinal mycobiome, as-comycetes yeast, basidiomycetes yeast
ВВЕДЕНИЕ
За последние десять лет количество работ, посвященных исследованию микробиоты кишечника, увеличилось более чем в десять раз. Это стало возможным благодаря появлению мощного молекуляр-но-биологического инструментария, а именно: се-квенирования и масс-спектрометрии. Методы мета-
геномики позволили изучать некультивируемые организмы. Большинство публикаций по видовому составу микробиоты кишечника связано с идентификацией бактерий по 16S РНК. Несмотря на наличие у микромицетов схожего метода идентификации по последовательностям внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS1,2) и гена 18S РНК [1], работ по микобиому кишечника существенно меньше [2]. Широкие возможности секвенирования всё же не позволяют в полной мере оценить фенотипические проявления изучаемых генов, а, соответственно, и роль найденных микроорганизмов в их взаимодействии с организмом человека.
Использование масс-спектрометрии, ограниченное только культивируемыми микроорганизмами, также расширило наши знания относительно этиологического разнообразия микроорганизмов кишечника. В то же время наличие точно идентифицированных культур даёт более широкие возможности их исследования и определения роли в симбиотических отношениях с организмом человека.
Несмотря на ограниченное количество работ, посвященных исследованию микромицетов кишечника, становится очевидным факт существенного влияния микроскопических грибов на человека [3].
Адгезия является одним из основных факторов вирулентности всех патогенных микроорганизмов на начальных этапах инфекционного процесса. Только после прикрепления на клетках организма хозяина патогены начинают колонизацию, что в свою очередь делает их более защищенными от иммунных механизмов организма хозяина и способствует дальнейшей инвазии [4].
В нашей работе мы сравнили хорошо изученную адгезивную активность Candida albicans [5, 6] с адгезивной активностью других, редко встречающихся аскомицетных (Pichia kudriavzevii, Pichia kluyveri, Geotrichum candidum, Wickerhamiella pararugosa, Brettanomyces bruxellensis) и базидиомицет-ных (Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon asahii) дрожжей, выделенных из кишечника человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучали базидомицетные дрожжи R. mucilagi-nosa (19 штаммов), T. asahii (2) и аскомицетные дрожжи C. albicans (7), G. candidum (19), P. kudriavzevii (6), B. bruxellensis (2), P. kluyveri (1) и W. pararugosa (1). Все штаммы были получены при бактериологическом исследовании кала пациентов с патологией желудочно-кишечного тракта и из кала здоровых людей, проходящих плановый медицинский осмотр.
Кал засевали на среду Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (0,4 г/л) и инкубировали при 35 °С в течение 72 часов, далее чашки в течение недели инкубировали при температуре 25 °С.
Идентификацию дрожжей проводили на основе их морфологических, биохимических и культураль-ных свойств при помощи «Atlas of Clinical Fungi» de Hoog GS et al., 4th ed. (2020) и интернет ресурса www.clinicalfungi.org.
Для более точной идентификации дрожжей, отличных от грибов рода Candida, применяли масс-спектрометр Microflex, производитель - Bruker Daltonik GmbH & Co. KG (Германия), с уникальным программным обеспечением MALDI Biotyper, содержащим референтскую базу данных (более 2500 видов микроорганизмов и 7800 штаммов).
В качестве субстрата для адгезии использовали буккальные эпителиоциты, полученные от здоровых не курящих доноров 18-20 лет, взятые утром, натощак, с внутренней поверхности щеки. Материал забирали цитощеткой после предварительного тщательного полоскания ротовой полости забуферен-ным физиологическим раствором (ЗФР). Эпителиоциты дважды отмывали физиологическим раствором (40 g ,5 мин) и готовили взвесь с концентрацией 10б кл/мл.
Штаммы грибов, выращенные на среде Сабуро в течение 48-72 часов, ресуспендировали в физиологическом растворе хлорида натрия. При помощи Densi-La-Meter II (Erba Group, EU) суспензии доводили до оптической плотности, равной 1,0 МакФарланда для Candida, Rhodotorula, Pichia, Brettanomyces, Wickerhamiella, 1,5 - для Geotrichum и 2,5 -для Trichosporon, что соответствовало 107 КОЕ/мл (рассчитано при помощи камеры Горяева).
Оценку адгезии в системе «микромицет - буккальные эпителиоциты» проводили следующим образом: равные объемы (по 50 мкл) взвеси эпителио-цитов и исследуемых грибов в концентрации 105 КОЕ/мл инкубировали в течение 30 минут при 37°С в ЗФР, встряхивая каждые 5 мин. После инкубации эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от непри-крепившихся грибов (40 г, 5 мин). Оставшийся осадок ресуспендировали в 100 мкл ЗФР и подсчитывали прикрепившиеся клетки грибов к буккальному эпителию в камере Горяева. Определяли индекс адгезии, т.е. среднее количество микромицетов в пересчете на один эпителиоцит и процент участвующих в адгезии эпителиоцитов (учитывали 100 клеток).
Анализ и статистическую обработку данных осуществляли при помощи расчёта критерия Стью-дента с поправкой Бонферрони для множественного сравнения с контрольной группой р<0,05. Оценку корреляции выполняли при помощи расчёта коэффициента корреляции Пирсона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, полученные в ходе работы, достоверно свидетельствуют (p<0,05) об уровне в адгезивной активности R. micilaginosa, P. kudriavzevii и G. can-
didum относительно C. albicans. Количество штаммов (T. asahii - 2 штамма, B. bruxellensis - 2, P. kluyveri - 1 и W. pararugosa - 1) не дает возможности провести достоверный статистический анализ, но, в некоторой степени, позволяют судить об адгезивной активности изученных микроорганизмов.
Исследованные нами параметры - индекс адгезии и процент участвующих в адгезии эпителиоци-тов показали, что коэффициент корреляции Спирме-на (р) равен 1,0, т.е. связь между параметрами -прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока -функциональная.
На рисунке 1 видно, что грибы рода Candida обладают наибольшим индексом адгезии среди всех исследуемых микромицетов.
Рис. 1. Индекс адгезии дрожжеподобных грибов мико-биома человека.
Нами не отмечено разницы между индексом адгезии аскомицетных и базидиомицетных дрожжей.
На рисунке 2 представлена диаграмма процента участвующих в адгезии эпителиоцитов.
Рис. 2. Процент адгезии дрожжеподобных грибов мико-биома человека.
Роль грибов рода Candida в патологии человека общепринята и не вызывает сомнений. Роль других микромицетов, исследованных в нашей работе, менее очевидна и требует изучения.
R. mucilaginosa рассматривается как условно-патогенный гриб. В то же время в последние десятилетия отмечен рост заболеваний, вызванных данным патогеном. Данный микроорганизм преимущественно связан с фунгемией, поражением центральной нервной системы и катетер-ассоциированными инфекциями [7]. Несмотря на нередкие случаи нахождения этих грибов в кишечнике [8, 9], их роль в патологии желудочно-кишечного тракта не до конца выяснена. Относительно высокие показатели индекса адгезии и процента участвующих в адгезии эпи-телиоцитов подтверждают патогенный потенциал этого микроорганизма и его возможное участие в патологии желудочно-кишечного тракта.
P. kudriavzevii - телеморф Candida krusei способна вызывать фунгемию [10], перитонит [11] и прочую патологию. С другой стороны, в ряде работ описаны пробиотические свойства данного микроорганизма [12, 13]. Показанные в настоящей работе адгезивные свойства этого аскомицета могут быть использованы как для мутуалистических, так и для антагонистических взаимоотношений с организмом человека. Роль P. kluyveri ещё менее очевидна, хотя случаи заболевания, вызванные данным микроорганизмом, описаны [14].
Литературных данных о патологии, связанной с B. bruxellensis, нами не обнаружено, и выделение этих грибов из стула человека, возможно, связано с тран-зиторным носительством. В то же время относительно высокая адгезивная активность к буккально-му эпителию человека позволяет предположить возможные симбиотические отношения этого микроорганизма с человеком, что требует дальнейшего изучения.
W. pararugosa (Candida pararugosa) считается редким патогеном человека, вызывающим фунге-мию, катетер-ассоциированные инфекции [15, 16] и другую патологию. Показатели адгезивной активности микромицета, выявленные в нашей работе, лишь подтверждают значимость этих дрожжей в патологии человека.
G. candidum нередко обнаруживается в кишечнике человека, но его роль в патологии человека до конца не доказана. С одной стороны, описаны случаи заболеваний, вызванные данным микроорганизмом [17,18], с другой - доказана его пробиотическая активность [19]. В настоящем исследовании мы отметили практически полное отсутствие адгезии G. candidum на буккальном эпителии, что дает возможность предположить наличие других механизмов взаимодействия с клетками человека.
T. asahii более известен как патоген кожи и её придатков. Однако его присутствие в кишечнике человека не является редким [20]. Низкая адгезивная активность к буккальному эпителию, выявленная в этой работе, позволяет предположить незначитель-
ную роль данного микроорганизма в патологии кишечника или наличие других механизмов перси-стенции.
Полученные нами данные дают лишь представление о возможности изученных микроорганизмов колонизировать ткани человека. Для более достоверной оценки типа симбиотических взаимоотношений между микромицетами кишечника и организмом человека необходимы дальнейшие исследования.
ВЫВОДЫ
Изучение микобиоты человека и микобиоты кишечника в частности находится в самом начале. Данные научной литературы немногочисленны и зачастую противоречивы. Даже установление типа взаимоотношения с организмом человека часто порождает вопросы, т.к. одни и те же микромицеты могут вызывать заболевания и оказывать пробиоти-
ческий эффект. В нашей работе мы оценили один из первых этапов взаимодействия клеток человека и базидио- и аскомицетных дрожжей, выделенных из кишечника человека. По сравнению с грибами рода Candida, исследованные микроорганизмы обладали меньшей адгезивной активностью, тем не менее её наличие может свидетельствовать о возможности колонизации тканей человека. У G. candidum и T. asahii адгезивная активность к буккальному эпителию отсутствовала, но частое выделение вышеуказанных микромицетов из кишечника человека говорит о наличии других механизмов персистенции. Для более достоверной оценки типа симбиотических взаимоотношений между микромицетами кишечника и организмом человека необходимо дальнейшее изучение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Schoch C.L., SeifertK.A., Huhndorf S., etal. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proc. Natl Acad Sci USA. 2012; 109 (16): 6241-6246. doi.org/10.1073/pnas.1117018109
2. Nash A.K., Auchtung T.A., WongM. C., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 2017; 5 (1): 153. doi: 10.1186/s40168-017-0373-4
3. Wu X., Xia Y., He F., et al. Intestinal mycobiota in health and diseases: from a disrupted equilibrium to clinical opportunities. Microbiome. 2021; 9 (1): 60. doi: 10.1186/s40168-021-01024-x
4. Харсеева Г.Г.,Миронов А.Ю., Алиева А.А. Подавление бактериальной адгезии: современные подходы, проблемы и перспективы. Успехи современной биологии. 2019: 139 (5): 506-515. [Kharseeva G.G., Mironov A.Yu., Alieva A.A. Suppression of bacterial adhesion: modern approaches, problems and prospects. The successes of modern biology. 2019: 139 (5): 506-515 (In Russ)]. doi: 10.1134/S0042132419050065
5. Саргсян А.Р., Булгаков В. С., Кравцов Э.Г. Адгезивная активность дрожжеподобных грибов рода Candida, входящих в микробиоценоз ротовой полости. Российская стоматология. 2016; 9 (1):118 -118.[ Sargsjan A.R., Bulgakov V.S., Kravtsov É.G. Russian Stomatology. 2016; 9 (1):118-118. (In Russ.)].
6. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Сачивкина Н.П. и др. Характеристика адгезивной активности клинических изоля-тов дрожжеподобных грибов Candida albicans в динамике менструального цикла. Вестник РУДН. Серия: Медицина . 2012; 1: 17-21. [Anokhina I.V., Kravtsov E.G., Sachivkina N.P., et al. Adhesive activity of clinical isolates of Candida albicans yeast cells during menstrual cycle. Bulletin of the RUDN. Series: Medicine. 2012; 1: 17-21. (In Russ)].
7. Ioannou P., VamvoukakiR., Samonis G. Rhodotorula species infections in humans: A systematic review. Mycoses. 2019; 62 (2): 90-100. doi: 10.1111/myc.12856
8. Raimondi S., Amaretti A., Gozzoli C., et al. Longitudinal survey of fungi in the human gut: ITS profiling, phenotyp-ing, and colonization. Front Microbiol. 2019; 10: 1575. doi: 10.3389/fmicb.2019.01575
9. García-Gamboa R., Kirchmayr M.R., Gradilla-Hernández M.S., et al. The intestinal mycobiota and its relationship with overweight, obesity and nutritional aspects. J. Hum. Nutr. Diet. 2021; 34 (4): 645-655. doi: 10.1111/jhn.12864
10. Nagarathnamma T., Chunchanur S.K., Rudramurthy S.M., et al. Outbreak of Pichia kudriavzevii fungaemia in a neonatal intensive care unit. J. Med. Microbiol. 2017; 66 (12): 1759-1764. doi: 10.1099/jmm.0.000645
11. AlBshabshe A., Joseph M.R.P., Battayah E. S., HamidM.E. Fungal peritonitis caused by Pichia kudriavzevii following sleeve gastrectomy. Ann Saudi Med. 2019; 39 (3): 205-208. doi: 10.5144/0256-4947.2019.205
12. Moure M.C., Pérez Torrado R., Garmendia G., et al. Characterization of kefir yeasts with antifungal capacity against Aspergillus species. Int. Microbiol. 2022. doi: 10.1007/s10123-022-00296-z
13. Hong S.M., Kwon H.J., Park S.J., et al. Genomic and probiotic characterization of SJP-SNU strain of Pichia kudriavzevii. AMB Express. 2018; 8 (1): 80. doi: 10.1186/s13568-018-0609-0
14. De Greef F., HayetteM.P., Rossi C. Fungemia caused by Pichia kluyveri: An uncommon yeast infection. New Microbes New Infect. 2022; 49-50: 101018. doi: 10.1016/j.nmni.2022.101018
15. El Helou G., Palavecino E. Candidapararugosa: First Reported Bloodstream Infection in an Adult. Cureus. 2017; 9 (5): e1283. doi: 10.7759/cureus.1283
16. Piatti G., Feltrin S., Fellini E., et al. Catheter-related sepsis by Candida pararugosa in an adult patient under chemotherapy regimen. Case Rep. Infect. Dis. 2021; 2021: 8858157. doi: 10.1155/2021/8858157
17. Jagirdar J., GellerS.A., BottoneE.J. Geotrichumcandidum as a tissue invasive human pathogen. Hum Pathol. 1981; 12 (7): 668-71. doi: 10.1016/s0046-8177(81)80055-x
18. Ghosh P., Boler A.K. Geotrichum candidum: A rare primary pathogen in pulmonary geotrichosis. Indian J. Med. Res. 2020; 152 (Suppl 1): S123-S124. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_2202_19
19. Noor-Ul H., Haokun L., Junyan J., et al. Dietary supplementation of Geotrichum candidum improves growth, gut microbiota, immune-related gene expression and disease resistance in gibel carp CAS (Carassius auratus gibelio). Fish Shellfish Immunol. 2020; 99: 144-153. doi: 10.1016/j.fsi.2020.02.001
20. Cho O., MatsukuraM., Sugita T. Molecular evidence that the opportunistic fungal pathogen Trichosporon asahii is part of the normal fungal microbiota of the human gut based on rRNA genotyping. Int. J. Infect Dis. 2015; 39: 878. doi: 10.1016/j.ijid.2015.09.009
Поступила в редакцию журнала 20.03.23 Принята к печати 28.03.23
