CC BY
34
УДК 619:616.98:579.873.21:616-07
Власенко В.В., д.б.н., проф., Фарионик Т.В., к.вет.н., Власенко И.Г., д.мед.н., Березовский И.В., Селиванов Ю.В.
Винницкий национальный аграрный университет Лысенко А.П., проф. д.вет.н., Лемиш А.П., к.вет.н., Архипов И.Н. © РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», гМинск
АДАПТИВНЫЕ ФОРМЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА В ТУБЕРКУЛИНЕ ППД ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
После внутрикожного введения туберкулина в диагностической дозе из крови 20-40% животных с помощью питательной среды ВКГудается выделить измененные некислотоустойчивые формы возбудителя туберкулеза, которые имеют такой же полипептидный профиль и антигены, как изолят из туберкулина.
Ключевые слова: туберкулез, млекопитающие, питательная среда ВКГ, стимулятором роста ВКГ, туберкулин ППД, пробы крови.
Туберкулин получают из термически инактивированной жидкой питательной среды после роста на ней патогенных штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ). Учитывая то, что его вводят человеку и животным, препарат, безусловно, не должен содержать патогенных клеток, не быть токсичным и реактогенным [8]. Опыт применения туберкулина подтверждает его относительную безопасность. Вместе с тем, получены данные о том, что высокая температура, убивая патогенные формы возбудителя, не предотвращает образование термически устойчивых структур [1,4]. В туберкулинах обнаружены светопреломляющие некислотоустойчивые зерна, которые, как считается, содержат жизнеспособные элементы МБТ [5]. Высказывалось предположение о том, что МБТ в неблагоприятных условиях, в том числе и в организме, образуют подобные структуры, способствующие их выживанию [6,7]. Такие адаптивные формы не дают роста при обычных методах контроля стерильности, но при использовании стимуляторов роста и специальных сред восстанавливают жизнеспособность [1,4]. Полученные изоляты некислотоустойчивы, слабопатогенны, но персистируют в организме морских свинок и индуцируют гиперчувствительность к туберкулину [4].
Для выделения термостабильных форм МБТ использовались стимулятор роста и питательная среда ВКГ [1]. Считается, что эффект восстановления жизнеспособности достигается активацией стимулятором роста ВКГ Ca-зависимых ферментов и К-№-насосов МБТ [1]. Однако, неизвестно, способны ли такие формы МБТ, восстанавливать жизнеспособность в организме.
© Власенко В.В., Фарионик Т.В., Власенко И.Г., Селиванов Ю.В., Лысенко А.П., Лемиш А.П., Архипов И.Н., 2011
Целью работы явилось изучение возможности восстановления жизнеспособности в организме животных термостабильных форм МБТ после внутрикожного введении туберкулина в диагностической дозе.
Материалы и методы. В работе использовали стандартный раствор ППД туберкулина для млекопитающих Курской биофабрики серии 11 в дозах 10000МЕ\0,2 мл (для крупного рогатого скота) и 1000 МЕ\0,2 мл (для морских свинок).
Исследования проведены:
- на 2-х месячном теленке и 6 морских свинках, которым внутрикожно трехкратно вводили туберкулин повторные инъекции через 7 и 20 суток);
- на 5 телятах 2-7 дневного возраста;
-10 коровах благополучного по туберкулезу стада.
До введения туберкулина и и через 72 ч после инъекции аллергена у животных стерильно брали пробы крови, которые смешивали со стимулятором роста ВКГ (1:1), инкубировали 24 ч. (370C) и сеяли по 400-600 мкл на среду ВКГ (*HANSA*, Ukraine). Контролем служили посевы на среду ВКГ стимулятора роста ВКГ без проб крови и посев смеси ППД туберкулина для млекопитающих со стимулятором роста ВКГ. Чашки с посевами инкубировали до 7 суток при 370С.
При появлении на среде ВКГ колоний, готовили мазки (окраска по Циль-Нильсену) с последующей микроскопией и цифровой фиксацией результатов на микроскопе Olympus ВХ-51.
Бактериальную массу исследовали в реакции агглютинации (РА) на предметных стеклах с антисывороткой к M.bovis Vallee, адсорбированной Staph.aureus, Str. sp., E.coli и антигенами нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) [4], в электрофорезе в готовых блоках 12,5% ПААГ-ДСН и в иммуноблоттинге с кроличьей антисывороткой к M.bovis Vallee (1:50) [4].
Результаты исследований. Установлено, что стандартный раствор туберкулина для млекопитающих после 24 ч инкубации со стимулятором роста ВКГ (1:1, 370С) и посеве на среду ВКГ через 48 ч. дал рост «парафиновых» колоний некислотоустойчивых кокков и палочек (рис.1).
Пробы крови морских свинок, взятые до введения туберкулина, не давали роста на среде ВКГ. После первой внутрикожной инъекции туберкулина и посеве крови через 24 ч. после нее, рост мелких светлых «парафиновых» колоний получен у 2 (33,3%) из 6 морских свинок. После II и III инъекции рост в посевах крови получен у 3 -х (50%) и 4-х (66,7%) морских свинок. Культуры росли на среде ВКГ через 1-3 сутки. В мазках обнаруживали крупные синие кокки и биполярные палочки, иногда встречались формы красного цвета (рис.1). Выделенные культуры агглютинировались антисывороткой к M.bovis Vallee и, следовательно, имели общие поверхностные антигены с классической формой МБТ.
Рис.1 Изолят из ППД туберкулина, полученный на питательной среде ВКГ (3 сутки инкубации, окраска по Циль-Нильсену (100х10)
Рис. 1. Культура, выделенная из Рис. 2 Культура, выделенная из крови морской свинки, после крови теленка после введения введения туберкулина (1000МЕ). 10000МЕ туберкулина. Окраска по Окраска по Циль-Нильсену Циль-Нильсену (100х10). (100х10).
После внутрикожной инъекции туберкулина (10000МЕ) теленку, посев крови, взятой через 72 ч, дал на среде ВКГ рост белых «парафиновых» колоний. В мазках обнаружены синие палочки, неокрашенные светопреломляющие и розоватые кокки (рис.2).
При последующих инъекциях туберкулина из крови теленка также выделяли культуры с подобной морфологией, реагировавшие в РА с антисывороткой к M.bovis Vallee.
При посеве крови 5 новорожденных телят после туберкулинизации в 1 случае (20%) был получен рост колоний, характерных для адаптивных форм МБТ.
В таблице 1 приведены результаты посева крови 10 коров после введения туберкулина. Во всех случаях результат туберкулинизации был отрицательный, но у 40% животных после введения туберкулина в крови появлялись адаптивные формы МБТ, которые агглютинировались в РА моноспецифической антисывороткой м.ьоу18 Уа11ее с оценкой +3-+4.
Таблица 1
Результаты посева крови коров до и после туберкулинизации на
питательную среду ВКГ
Инвентарный №. Реакция на ППД туберкулин Результаты посева крови после туберкулинизации
Рост на среде ВКГ РА изолята с а. с M.bovis
6293 Отриц. + +++
6274 Отриц. - -
6201 Отриц. - -
6680 Отриц. - -
7957 Отриц. + ++++
6574 Отриц. - -
6153 Отриц. + +++
6189 Отриц. + +++
6114 Отриц. - -
6248 Отриц. - -
Итого 10 4 (40%) 4 (40%)
В электрофорезе ПААГ-ДСН (12,5%) сравнили полипептидный профиль культуры, выделенной из туберкулина для млекопитающих и из крови теленка. Полипептидный профиль культуры из туберкулина был представлен 11 фракциями (с м.м. 80, 67, 65, 51, 45, 38, 36, 32, 24, 17, 14 kDa). Полипептидный профиль изолята из крови теленка после туберкулинизации, состоял из 10 фракций (с м.м. 85, 67, 65, 51, 45, 38, 36, 32, 24, 17kDa), которые по расположению и молекулярной массе были, практически, такие же, как у изолята из туберкулина (рис.3).
В иммуноблоттинге с антисывороткой к M.bovis Vallee (рис.3) реагировали антигены культуры из туберкулина для млекопитающих с м.м. 51, 45, 38, 36, 24, 20 и 14 kDa, а антигены изолята из крови с м.м. 51, 45, 38 и 17 kDa. Фракции контрольной культуры E.coli с антисывороткой M.bovis Vallee окрашенных полос не давали. Таким образом, результаты электрофореза и иммуноблоттинга подтвердили родство изолята из туберкулина и крови теленка после его введения в диагностической дозе.
Рис. 4. Электрофорез ПААГ-ДСН (12,5%) и иммуноблоттинг (с антисывороткой M. bovis 1:50) ВКГ -изолята из крови телки после инъекции туберкулина (1) и изолята из туберкулина (2)
Обсуждение результатов. Посев на среду ВКГ стандартного раствора ППД туберкулина подтвердил наличие в нем жизнеспособных структур [4]. Оказалось, что и в организме животных после однократного введения туберкулина находящиеся в нем термостабильные формы восстанавливали жизнеспособность. Обнаружить это явление удалось у части подопытных животных. У новорожденных телят изолят из крови получен лишь в одном случае (20%). Необходимо отметить, что в иммуноферментном анализе (ИФА) с соникатом M.bovis у 4 из 5 подопытных телят были обнаружены высокие уровни антимикобактериальных антител (ДОП в сравнении с эмбриональной сывороткой 3,8-9,1), вероятно, колострального происхождения, а изолят из крови был получен у теленка с самым низким показателем (ДОП 1,2).
У коров персистенция в крови жизнеспособных форм МБТ после введения туберкулина отмечена в 40% случаев. У морских свинок после 3-кратного введения препарата этот показатель повышался до 66,7%.
Все изоляты, полученные из крови животных после введения туберкулина агглютинировались в РА антисывороткой к бактериальной форме M.bovis, истощенной антигенами НТМБ и банальной флоры, что подтверждало наличие у них поверхностных антигенов, характерных для бактериальной формы возбудителя [4]. Более того, изолят из крови подопытного теленка имел, практически, идентичный полипептидный профиль и антигенные свойства, как у изолята из туберкулина.
Значение факта персистенции адаптивных форм МБТ после туберкулинизации пока трудно оценить, но, безусловно, его надо учитывать при диагностике туберкулеза у реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота с использованием питательной среды ВКГ. Отмечено, что через 20-30 суток после введения туберкулина адаптивные формы МБТ из крови не выделяются. Поэтому, взятие крови для дифференциальной диагностики необходимо проводить не ранее, чем через 20 суток после туберкулинизации. С другой стороны, полученные данные, в известной степени могут объяснять
иммунизирующие свойства туберкулина [2], которые трудно трактовать с позиций современной иммунологии.
Выводы: 1. После внутрикожного введения туберкулина в диагностической дозе из крови 20-40% животных удается выделить измененные некислотоустойчивые формы возбудителя туберкулеза.
2. Измененные некислотоустойчивые формы возбудителя туберкулеза, выделенные из крови животных имеют такой же полипептидный профиль, как изолят из туберкулина, а также антигены, характерные для классического возбудителя туберкулеза.
Литература
1. Власенко В.В. Туберкулез в фокусе проблем современности // Винница: Наука, 1998.- 350с.
2. Евглевский А.А. Совершенствование аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. вет. наук. - Воронеж.- 1992.- 26 с.
3. Лысенко А.П. Антигены Mycobacterium bovis и атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. докт. вет. наук. Минск.-1994.- 35С.
4. Лысенко А.П., Лемиш А.П.,,. Красникова Е.Л., с соавт. Изучение термической устойчивости микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких.-2007.-№2 .- с.42-46
5. Лысенко А.П., Лемиш А.П., с соавт. Выявление адаптивных форм микобактерий в туберкулинах // Современные проблемы инфекционной патологии человека. Сборник научных трудов.- Выпуск 1.- Минск.-«Белпринт».-2008.- с.227-230.
6. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Морфология измененных форм микобактерий туберкулеза // Проблемы туберкулеза .-1988.-№4.-с.57-59.
7. Maggini, Praloran, Gammarotta // Ann.dell Instituto Carlo Forlanini.- v. XXY - 1965.- p. 321-345
8. Mannual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Annimals, 5th edition, 2004.
Summary
Vlasenko V.V., Farionik T.V., Vlasenko I.G., Berezovsky I.V., Selivanov Yu.
Vinnitsa National Agrarian University Lysenko A.P., Lemish A.P., Arkhipov I.N.
RUE "Institute of Experimental Veterinary Medicine. SN Vyshelesski th", Minsk ADAPTIVE FORMS OF TB GERMS IN THE TUBERCULIN PPD FOR
MAMMALS
After intracutaneus introduction tuberculin in a diagnostic dose from blood of 2040% of animals by means of nutrient medium VKG it is possible to allocate changed adaptive forms of M.bovis which have same polypeptide a profile end antigenes as isolate from tuberculin.
Стаття надшшла до редакцИ 8.05.2011
