CC BY
14
УДК 543.535.379
Мщяний С.В.1, к.х.н., доцент © Мицук О.А.1, к.х.н., доцент Оленич Р.Р.2, к.х.н., доцент 1Лье1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицины та бютехнологт iмет С.Гжицького 2Нацюнальний ушеерситет "Львiвська полтехтка"
ПРО МОЖЛИВ1СТЬ ВИЗНАЧЕННЯ ФЛАВОНОЩШ ХЕМ1ЛЮМ1НЕСЦЕНТНИМ МЕТОДОМ
Встановлено, що флавоногди е ефективними природними антиоксидантами i можуть регулювати ттенсивтсть протжання реакцт перекисного окиснення в живих оргатзмах, яю часто супроводжуються бюхемыюмтесценщею. Антиоксидантну активтсть хiмiчних сполук та бiологiчних об'ектiв можна оцшювати хемыюмтесцентним методом. Показано, що хемыюмтесцентш реакцп 10-метилакридишевих солей е перспективними для визначення загального вмкту флавоноïдiв та оцтки ïx антиоксидантног активностi врiзниx бiологiчниx субстратах.
Ключовi слова: флавоногди, бюхемыюмшесценщя, перекисне окиснення, антиоксидантна активтсть, хемыюмшесценщя, 10-метилакридинiевi солi.
В 70-их роках Б.Т. Тарусов i сшвробггаики [1] експериментально встановили, що тканинш лшщи, жири, ненасичеш жирш кислоти в присутност О2 спонтанно випромшюють слабке свiчення у видимш i близькш шфрачервонш дшянщ спектру. Це явище над^ дктало назву бюхемшюмшесценци. Було встановлено, що бюхемшюмшесценщя виникае в результат вiльнорадикального окиснення ненасичених жирних кислот, як вшьних, так i тих, що входять до складу лшдав. Дослщження закономiрностей протiкання бiохемiлюмiнесцентних реакцiй та 1х взаемозв'язку з метаболiзмом вiдкривае широк можливостi для використання бiохемiлюмiнесценцiï в кшшчнш дiагностицi.
Встановленим джерелом свiчення (емiтером) е електронозбудженi кетони. Вони виникають при розкладi тетраоксидiв, що утворюються в реакцiях за участю вiльних радикалiв. Сумарна iнтенсивнiсть свiчення залежить вiд факторiв, якi визначають швидкiсть утворення вiльних радикалiв, а також вщ ряду фiзичних факторiв. Наявнiсть в органiзмi iнгiбiторiв бюхемшюмшесценци зумовлюе ïï низьку iнтенсивнiсть в норм1 Однак iнтенсивнiсть свiчення може змшюватись при коливаннi вмiсту мжроелеменив, бiоантиоксидантiв чи ненасичених жирних кислот. Тому рiвень iнтенсивностi бiохемiлюмiнесценцiï може вказувати на протжання ряду патолопчних процеЫв.
Пiд впливом рiзних факторiв (хiмiчних, фiзичних, бiологiчних) в органiзмi можуть утворюватись нестiйкi високоактивнi промiжнi сполуки: електрофiли,
© Мадяний С.В., Мицук О.А., Оленич Р.Р., 2009
231
вшьш радикали, рiзнi активш форми Оксигену, здатнi взаeмодiяти з ферментами, бiлками, нуклешовими кислотами та шшими бiологiчними субстратами, що е однieю з першопричин будь-якого захворювання. Супероксид iон-радикал е О8 е однiею з найбшьш активних частинок, якi приймають участь в багатьох бюлопчних реакцiяX' Вш може утворюватись як при взаемоди первинних органiчних радикалiв чи металiв перемшно! валентностi з О2, так i при ди рiзних фiзичних факторiB'
В бiологiчних системах штенсившсть бюхемшюмшесценци зв'язана з активнiстю окремих фермента. Вiльнорадикальнi форми субстратiв i Оксигену утворюються в надлишкових концентращях внаслiдок порушення структур молекул фермента чи порушення 1х нормального метаболiзму'
Антиоксидантний статус органiзму визначаеться його здатшстю нейтралiзувати вiльнi радикали та шкiдливi продукти, що утворюються в результат протiкання реакцiй перекисного окиснення. Показано [2,3], що додавання до лшдав iонолу чи нафтолу рiзко зменшуе iнтенсивнiсть спонтанно! бюхемшюмшесценци. В органiзмi роль антиоксиданту виконуе фермент супероксиддисмутаза, яка нейтралiзуе анiон-радикали кисню без утворення iнших радикалiв:
02 + 02 + 2Н+ + СОД = НО8 + НО8 + СОД = Н2О2 + О2 + СОД Також активним шпб^ором реакцш вiльнорадикального окиснення е глюта-тiонпероксидаза'
Данi по ощнщ стану бiохiмiчного i окиснювального гомеостазу можна розглядати як показники загального стану оргашзму. Дослiдження антиоксидантно! активност органiзму дозволяе коректувати перекисний гомеостаз шляхом призначення вщповщних лiкарських препарата, що мютять антиоксиданти.
Дослiдження властивостей природних антиоксиданта рiзноl будови (токофероли, убiхiнони, вiтамiни групи К1, флавонощи) показали, що 1хня антиоксидантна актившсть е на 1-2 порядки вищою, шж активнiсть бiльшостi синтетичних фенолiв, яю входять до складу багатьох лжарських препаратiв [5]. Особливо цiкавими в цьому плаш е флавонощи, що входять до складу багатьох лжарських рослин i е похiдними флавону [6,7]:
3,5,7 - тригщроксилфлавон (галангш) 2,3,5,7 - тетрагщроксилфлавон (морш) 3,4,5,7 - тетрагщроксилфлавон
(кемпферол) 3,3,4,5,7 - пентагщроксилфлавон (кверцетин)
3.3 ,4,5,5 ,7- гексагщроксилфлавш ^рицитин)
3-О-глюкозид (кверцетин)
3.4 -О-диглюкозид ^зокверцетин)
232
Флавонощи проявляють pi3Hy ф^отерапевтичну дш. В фiтотерапiï часто використовуються такi флавоноïди як кверцетин, кемпферол, атгенш, рутин. Вони регулюють рiзнi метаболiчнi процеси. ïx дiя пов'язана i3 зниженням проникностi судинних капiлярiв, ïx ломкостi, здатнiстю впливати на запальш процеси. До найбшьш поширених природних джерел флавоноïдiв належать: кв^и арнiки, чорноï бузини, ромашки, липи, листя берези, пщбшу, вересу, коршь петрушки, плоди гiркокаштану, хвощ польовий i коршь солодки в яких мiститься 27 флавоноïдiв. Авторами [9] проведений порiвняльний аналiз антиоксидантнох' активностi рiзниx фiтоадаптогенiв, якi мктять флавонощи. Антиоксидантну активнiсть оцiнювали ефектившстю впливу цих флавоноïдiв на реакци перекисного окиснення лiпiдiв. Показано, що найбшьш виражену антиоксидантну активнiсть проявляв екстракт радюли рожево^ в якому мктяться такi флавонощи як кемпферол, кверцетин, iзокверцетин, гiперозид. Високою також е активнiсть екстракту елеутерококу.
Серед факторiв, якi суттево впливають на протжання реакцш вiльнорадикального окиснення, важливе значення належить металам зi змшною валентнiстю, якi в залежностi вщ концентрацiï можуть виступати в ролi каталiзаторiв або iнгiбiторiв вказаних процеЫв. Метали також приймають участь в регуляци iмунниx процесiв. Вiдомо, що юни металiв утворюють з багатьма бюлопчними субстратами органiзму комплекснi сполуки, у яких л^андами можуть бути амшокислоти та ïx поxiднi, бшки, нуклеотиди, нуклеïновi кислоти, лiпiди, вуглеводи тощо.
Спонтанна бiоxемiлюмiнесценцiя вiдображае штенсившсть
вiльнорадикального окиснення лiпiдiв, яке вщбуваеться самочинно без використання додаткових стимуляторiв окиснення. Iнтенсивнiсть xемiлюмiнесценцiï, iндукованоï Н2О2 i органiчними перекисами, кiлькiсно характеризуе присутшсть бiоантиоксидантiв, супероксиддусмутаз i каталаз. Амплiтуда спалаху xемiлюмiнесценцiï, iнiцiйованоï перекисом водню, характеризуе резистентнiсть тканин i лшвдв до перекисного окиснення. ïï величина прямо пропорцiйна до окиснювальноï здатностi лiпiдiв i концентрацiï металiв змiнноï валентностi i обернено пропорцшна вмiсту природних антиоксидантiв в дослщжуваному бiосубстратi.
На сьогоднiшнiй день для оцшки антиоксидантноï активностi xiмiчниx сполук i бюлопчних об'ектiв широке застосування одержав хемшюмшесцентний метод [10,11]. Використання хемшюмшесцентного методу спрощуе методику визначення антиоксидантноï активностi бiологiчниx об'ектiв в порiвняннi з iншими методами [11], оскшьки вiн е бiльш шформативним так як дозволяв визначати константи швидкостей елементарних реакцiй взаемодiï перекисних радикалiв з молекулами антиоксиданту, не вимагае значних кшькостей лiпiдiв i виключае необxiднiсть препаративного видiлення шдивщуальних бiоантиоксидантiв [12]. Цей метод е найбшьш експресним, достатньо надшним i простим для визначення антиоксидантноï активности Вiн також дозволяе зробити порiвняльну оцiнки активностi рiзниx антиоксид анив.
233
При додаванш вщомих хемшюмшесцентних реагента, таких як люмшол i люцигенш, в систему, де вщбуваеться ферментативна реакцiя, може виникати штенсивне свiчення. Так називаему люмшол- чи люцигеншзалежну хемiлюмiнесценцiю широко використовують як детектор на радикали та активш форми Оксигену в бюлопчних процесах, для оцiнки антиоксидантно! активност хiмiчних речовин i бiологiчних об'екта [13,14,15].
Хемiлюмiнесцентнi реакци з участю люмiнолу i люцигенiну характеризуються високим квантовим виходом, чим зумовлена висока чутливiсть визначення при використанш цих субстратiв. Проте використання цих реагента для аналiзу бюлопчних об'екта мае ряд недолшв. Так, введення люмшолу, механiзм хемшюмшесценци якого до кiнця ще так i не встановлений, в складну ферментативну систему не дозволяе однозначно трактувати отримаш результати. Крiм того слщ враховувати той факт, що бiльшiсть хемiлюмiнесцентних реакцiй вказаних реагента вщбуваються лише в лужному середовищ^ де бiологiчнi системи руйнуються, що додатково може впливати на штенсившсть хемшюмшесценци.
Багато важких металiв (Си, Со, Fe та iншi), яю мiстяться в органiзмi, можуть впливати на стан бiохiмiчного i окиснювального гомеостазу. Тi ж метали е ефективними каталiзаторами хемiлюмiнесцентних реакцiй люмшолу i люцигенiну, а отже, змша 1хньо1 концентраци впливатиме на параметри люмшол- i люцигеншзалежно! хемшюмшесценци.
В останш роки виконанi значнi дослщження по вивченню хемiлюмiнесцентних властивостей простих похщних акридину [16-20]. Зокрема вивчеш властивостi метилсульфатiв 9,10-диметилакридинiю (МСДМА), 10-метилакридишю (МСМА) \ н¡трату 9-щано-10-метилакридишю (НЦМА):
СН з ""|+ И: -Н СМСТНА)
-СИ (НЦМА) -СН3 СМСДЕНА)
I
К.
Для вказаних реагента хемшюмшесценщя спостерiгаеться практично у всьому iнтервалi значень рН, в той час як люмшол i люцигенш хемшюмшес-цiюють лише в лужному середовищ1 Так, при взаемоди НЦМА з Н2О2 хемiлюмiнесценцiя виникае вже при рН 4,5, а И тривалкть в окремих випадках становить ~ 40 годин. МСДМА, МСМА i НЦМА хемiлюмiнесцентно окиснюються рiзними окисниками, а свiчення люцигешну виникае лише при його окисненш пероксидом водню.
Дослiджено вплив багатьох металiв на хемiлюмiнесценцiю солей 10-метил-акридинiю в реакцiях з рiзними окисниками. Специфiчнiсть катал^ично! ди металiв, яка залежить вiд природи окисника, субстрату i кислотностi середовища е передумовою для аналiтичного застосування хемшюмшесцентних
234
композицш на основi простих похщних акридину. Розроблеш [21-23] високочутливi i селективнi методики визначення РЬ, Сг, Ru, V, Мп, Ni, Си, Со, Fe, перекисних сполук (пероксиду водню, пероксимоносульфату,
пероксидисульфату), ряду вщновниюв (N2H4, мн2он, SO3~ , 8 ' , тюгшколево! кислоти, цистешу). Характеристики цих методик представлен в таблицi.
Специфiчнi особливостi хемшюмшесценци простих похiдних акридину е основою !х можливого використання для вивчення властивостей флавоно1дов в таких напрямках:
1. ощнка антиоксидантно!' активного флавоноЩв в рйннх бшлопчних субстратах. Найбшьш часто необхiдно вивчати властивостi бюлопчних систем кислотнiсть яких е в межах рН 6-8. Люмшол i люцигенiн в кислому середовищi не хемшюмшесцшють. Тому хемiлюмiнесценцiя НЦМА з Н2О2, тривалiсть яко! становить ~ 40 год., дае можливiсть проводити неперервне тривале дослiдження антиоксидантно! активност бiологiчних об'ектiв;
Характеристики методик визначення на основi простих похiдних акридину
Визначувана 1ндикаторна система 1нтервал
речовина концентрации нг/мл
Со(П) МСДМА + дипероксиадитнова кислота, рН 12,5 0,0025-0,1
Fe(Ш) НЦМА + Н2О2 + о^еп, pH 5,0 2,5-1700
Си(П) МСДМА + Н2О2 + H2SO4 (9,7М) 30-900
Си(П) МСДМА + КШ05, pH 11,5 0,6-3
Сг(Ш) МСМА + Н2О2, рН 9,3 0,5-120
Сг(У1) МСМА + КШ05 (4,5М H2SO4) 1,5-68
НЕ(Н) НЦМА + Н2О2, рН 9,0 36-720
Мп(П) МСДМА + H2SO4 (8,4 М) 140-5500
Ru(IV) МСДМА + пероксикапринова кислота + С2Н5ОН, рН 6,6 1,2-1300
У(У) МСДМА + Н2О2 + H2SO4 (10,1 М) 50-400
V(IV) МСДМА + КШ05, pH 11,0 0,1-10
N1(11) МСДМА + КШ05 + диметилглюксим (0,012М КОН) 3-30
Н2О2 НЦМА, рН 10,7 0,17-850
КШО5 МСДМА (310-3 - 310-2М КОН) 14-350
K2S2O8 МСДМА (4М КОН) 30-280
N2H4 НЦМА + Н2О2, рН 10,3 0,7-85
NH2OH НЦМА, рН 13,0 3,0-1500
SOз2" НЦМА + Н2О2, рН 10,0 1,0-60
s2- НЦМА + Н2О2, рН 10,0 0,5-130
HSCH2COOH НЦМА + Н2О2, рН 11,0 2,5-95
Цистеш НЦМА + Н2О2, рН 10,5 80-380
2. визначення загального вмкту флавоно'щв. Вiдомо, що фенольнi форми природних антиоксидашчв при низьких концентрацiях, знижують iнтенсивнiсть свiчення, що вказуе на хiмiчний характер гасiння
235
хемшюмшесценци. Це явище може служити передумовою для розробки хемшюмшесцентних методiв визначення ендогенних i екзогенних антиоксиданив в рiзних об'ек-тах. Флавонощи, як природш антиоксиданти, e iнгiбiторами багатьох хемiлюмiнесцентних реакцiй простих похщних акридину. По шпбуючому ефекту флавоновдв можна визначати 1'х вмкт в рiзних бiологiчних об'ектах. Так як хемшюмшесценщя простих похщних акридину спостер^аеться в кислому, нейтральному i лужному середовищах, то на основi хемшюмшесцентних композицш НЦМА, МСДМА, МСМА можуть бути розробленi методики визначення загального вмiсту флавоноïдiв в бюлопчних субстратах, плодових соках, екстрактах лжарських рослин.
3. вивчення ефективносл флавоноЩв як антияд1в на вaжкi метали.
Флавонощи утворюють стiйкi комплекси з катюнами рiзних металiв. Тому вони можуть виступати в ролi антиядiв на важкi метали. Вiдомо, що сульфоновi похiднi кверцетину використовуються як антияди на Меркурш, Кадмiй, Плюмбум. Оскiльки на основi простих похщних акридину розроблено цший ряд методик визначення металiв, то 1'х можна використати для вивчення ефективност флавонохдов як антиядiв важких металiв.
Л^ература
1. Тарусов Б.Н., Паливода А.И., Журавлев А.И. Изучение сверхслабой спонтанной хемилюминесценции животных тканей. - Биофизика, Т.6, вып.4, 1961. - С.490-492.
2. Тарусов Б.Н., Журавлев А.И. Биохемилюминесценция липидов. - В кн.: Биохемилюминесценция. М.: Наука, 1965. - С.125-133.
3. Fridovich I., Superoxide radical and superoxide dismutase. - Accounts Chem. Soc., V.5, N 10, 1972. - P.321-326.
4. Fridovich I. Superoxide dismutase. - Annu. Rev. Biochem., V.44, 1975. - P.147-159.
5. Кухтина Е.Н., Наумов В.В., Храпова Н.Г. Особенности хемилюминесцентного метода определения активности природных антиоксидантов, Теоретические и методические основы биохемилюминесценции: Материалы симпозиума "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", апрель 1986 г., Ташкент: Наука, С.23-27.
6. Kopacz M., Kopacz S. Sulfonowe pochodne niektorych flawonoidow i ich zastosowanie. Materialy I Ogolnopolskej Konferencji "Flawonoidy i ich zastosowanie", 24-25 maja 1996 r, Rzeszow, S.57-70.
7. Krol W., Dworniczak S., Pietsz G., Сzuba Z.P., Kunicka M., Kopacz M., Nowak D. Ocena aktywnosci przeciwnowotwarowej nowych pochodnych moryny i kwercetyny. Materialy I Ogolnopolskej Konferencji "Flawonoidy i ich zastosowanie", 24-25 maja 1996 r, Rzeszow, S.183-191.
8. Лжарсью рослини: Енциклопедичний довiдник. Вiдп. ред. Гродзiнський А.М., Кшв: УРЕ 1989. - 544 с.
236
9. Винер Б.М., Гукасов В.М., Крендаль Ф.Г., Левина Л.В. Исследование антиоксидантной активности некоторых фитоадаптогенов. - Вопросы хемилюминесценции. Т.3, 1992. -С.1-4
10. Стежка В.А. Функциональное состояние системы свободнорадикального окисления как патогенетически обоснованный критерий гигиенической оценки воздействия на организм факторов производственной и окружающей среды. - Довкшля та здоров'я. В.1(8), 1999. - С.2-9
11. Шерстнев М.П. Методика определения антиокислительной активности химических соединений и биологических объектов с помощью регистрации хемилюминесценции в присутствии ионов двухвалентного железа. -Вопросы хемилюминесценции. Т.1, 1991. - С.13-15.
12. Храпова Н.Г., Сторожак Н.М. Использование хемилюминесценции при исследовании сложных многокомпонентных систем природного происхождения/ Теоретические и методические основы биохемилюминесценции: Материалы симпозиума "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", апрель 1986 г., Ташкент: Наука, С.40-43.
13. Русин Б.А. Хемилюминесценция фталгидразидов. Биохемилюминесценция фталгидразидов. Биохемилюминесценция. Москва: Наука, 1983. - С.69-117.
14. Krol W. Flawonoidy jako modulatory funkcji makrofagow. I. Regulacja produkcji reaktywnych form tlenu i azotu, Materialy II Ogolnopolskej Konferencji "Flavonoidy i ich zastoso-wanie", 28-29 maja 1998 r., Rzeszow, S.41-85.
15. Шерстнев М.П. Аденилциклазная система регуляции хемилюминесцентного ответа фагоцитов. - Вопросы хемилюминесценции. Т.1, 1990. - С.1-7
16. Василечко В.О. Применение хинолиновых и акридиновых производных в качестве новых аналитических хемилюминесцентных реагентов. Дис. канд. хим. наук, Львов, 1988. -280 с.
17. Мщяний С.В. Штрат 9-щано-10-метилакридинш - новий анал^ичний хемiлюмiнесцентний реагент. Дис. канд. хим. наук, Львiв, 1998. -186 с.
18. Мицук О.А. Хемiлюмiнесцентнi реакци метилсульфату 9,10-диметилак-ридинiю з пероксимоносульфатом калш i дипероксiадипiновою кислотою та визначення на !х основi Cu(II), Ni(II), V(IV), Cr(VI). Дис. канд. хим. наук, Львiв, 1999. -174 с.
19. Vasylechko V., Huta O., Pylypchouk O., Midyanyj S., Lebedynets L. A New Chemiluminescent Reagent. Abstract of the 35th IUPAC Congress, Istambull, August 14-19, 1995, 1, section3: Organic Chemistry, Synthesis, Mechanisms and Natural Products, P.588.
20. Huta O.M., Vasylechko V.O., Patsaj I.O., Midyanyj S.V., Mytsuk O.A., Polyuzhyn I.P. The Application of 10-Methylacridinium Salts for Chemiluminescent Environmental Determination of Some Pollutants. Abstracts of the Central Europe-USA Workshop on Environmental Chemistry, June 13-15, 1999, Praha-Pruhonice: Congress and Educational Centre Pruhonice 1999. -Р.176-177.
237
21. Гута А., Василечко В., Мидяный С. Новые хемилюминесцентные аналитические реагенты. - Материалы Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы фундаментальных наук", 28 октября - 3 ноября 1991, Москва: МГТУ, 5, секция химии, С.37-40.
22. Кузьма Ю.Б., Гута О.М., Василечко В.О., Мидяный С.В., Пилипчук Е.А. Хемилюминесцентное определение меди в кислой бреде. - Химия и технология воды. Т.15, 1993. - С.452-455.
23. Пацай I., Гута О., Дудчак Л. Хемшюмшесцентна реакщя штрату 9-щано-10-метилакридинш з цистешом. - Вюник Львiв. ун-ту, серiя хiм. В.39, 2000. -С.209-212.
Summary S. Midyanyj1, O.Mytsuk1, R. Olenych2 'viv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology 2 National University "L'vivska Polytechnica" ABOUT POSSIBILITY OF FLAVONOIDS DETERMINATION BY MEANS OF CHEMILUMINESCENT METHOD
A literary data concerning of the natural antioxidants - flavonoids are systematized. The possibility of regulation of reaction intensity of peroxide oxidation in living organisms by means of flavonoids are shown. Antioxidative activity of chemical compounds and biological objects may be estimated by means of chemiluminescent method. It has been shown the possibility of determination of total flavonoids content and estimation ones antioxidative activity by means of 10-methylacridinium salts chemiluminescent reactions .
Key words: flavonoids, biochemiluminescence, peroxide oxidation, antioxidative activity, chemiluminescence, 10-methylacridinium salts.
Стаття надшшла до редакцИ 4.04.2009
238
