CC BY
24
3-е МЕСТО В КОНКУРСЕ НАУЧНЫХ РАБОТ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ПО ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИИ НОГР ЗА 2010 г.
КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПИЩЕВОЙ ИНТОЛЕРАНТНОСТИ У ДЕТЕЙ
Приходченко Н.Г.
ГОУ ВПО Владивостокский государственный медицинский университет
Н '£
О
го
Я ^ Орё 2 -
X с ^
п а
¡ли
и
а
>
V
X
а
До настоящего времени остаются неизученными все патогенетические механизмы развития пищевой интолерантности у детей, влияние на процесс состояния реактивности организма ребенка, вопросы коррекции и профилактики. С целью изучения клинических и патогенетических особенностей формирования пищевой интолерантности у детей первого года жизни с пищевой непереносимостью лактозы (лактазная недостаточность, ЛН) было проведено комплексное клинико-иммунологическое, биохимическое и функциональное обследование в динамике 39 детей с ЛН в возрасте от 1,5 до 12 месяцев. Установлено, что формирование пищевой непереносимости лактозы у детей сопровождается нарушением всех этапов пищеварения: полостного, пристеночного, внутриклеточного с изменением состояния мукозального иммунитета, микробиоты кишечника и дисбалансом продукции провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов. Исследование неспецифических факторов защиты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, особенностей мукозального иммунитета перспективно для изучения патогенеза формирования пищевой интолерантности у детей и разработки алгоритмов лечения и профилактики.
Пищевая непереносимость является актуальной проблемой педиатрии и современного здравоохранения в целом [3; 10; 13; 15]. Это обусловлено ее значительным ростом в последнее десятилетие, отсутствием ранних достоверных критериев диагностики и недостаточной эффективностью имеющихся методов терапии, что способствует формированию хронической патологии желудочно-кишечного тракта и тяжелых аллергических заболеваний [4; 5; 10; 14].
Наиболее встречаемым вариантом пищевой ин-толерантности у детей является непереносимость лактозы (гиполактазия, лактазная недостаточность, ЛН) [1; 2; 7; 15]. Установлено, что до 70% случаев ЛН у детей грудного возраста носит приобретенный (вторичный) характер, при котором снижение
активности лактазы связано с повреждением энтероцита, возможном при инфекционном или иммунном (пищевая аллергия) воспалительном процессе в кишечнике, атрофи-ческих и субатрофических изменениях, при недостатке трофических факторов [7; 9; 12; 15]. Несмотря на многочисленные исследования в области физиологии процессов кишечного всасывания, механизмы развития пищевой интолерантности продолжают оставаться неясными.
Анализ работ, посвященных непереносимости лактозы, показывает единичные упоминания об участии нитрооксидергических механизмов в формировании данной патологии [6; 8; 11]. Известно, что оксид азота (N0) может регулировать процессы абсорбции в тонком кишечнике, что N0 является важнейшим защитным фактором, ингибиция продукции которого приводит к нарушению функций энтероцитов. Особый интерес имеет изучение молекулярной природы межклеточных взаимодействий и их роли в возникновении пищевой интолерантности. Для клинической практики несомненное значение имеет разработка новых гистохимических и иммунологических маркеров ранней идентификации нарушений процессов мембранного всасывания и с определением ведущего патогенетического звена.
Цель настоящего исследования состояла в изучении клинических и патогенетических особенностей формирования пищевой интолерантности у детей первого года жизни с пищевой непереносимостью лактозы
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под наблюдением находилось 39 детей, страдающих пищевой непереносимостью лактозы, в возрасте от 1,5 до 12 месяцев (I группа). Проведенный анализ анамнестических (наличие персистирующей кислой
CD LH
диареи), лабораторных данных (положительная реакция Бенедикта, стеаторея смешанного типа, амилорея) позволил выявить вторичную лактазную недостаточность. На момент установления диагноза все дети находились исключительно на грудном вскармливании. Группу сравнения (II группа) составили 20 детей, не имеющих симптомов пищевой непереносимости в анамнезе. Всем детям осуществлено комплексное клинико-иммунологическое, биохимическое и функциональное обследование в динамике. У всех детей оценивали состояние микро-биоты толстой кишки, уровень экскреции углеводов с калом, проводили многократное копрологическое исследование. Изучали состояние гуморального иммунного статуса (иммуноглобулины А, М, G, общего IgE и цитокинов (IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, ФНОа) в сыворотке крови и слюне. Определение иммуноглобулинов и цитокинов в биологических жидкостях проводилось согласно методическим рекомендациям «Исследование иммуноглобулинов и других белков в секретах человека» (М., 1987). 36 пациентам в периоде выраженных клинических проявлений по показаниям была проведена эзофаго-гастроеюноскопия с энтеробиопсией. Биопсийный материал получали через рабочий канал фиброгастроскопа PENTAX FG 24V при помощи фарцепта из тощей кишки до связки Трейца. Полученный биопсийный материал фиксировали в парафор-мальдегиде и использовали для приготовления срезов с последующей окраской их гематоксилином и эозином. Оценка морфологических данных проводилась с помощью световой и электронной микроскопии. Для изучения NO-образующей функции слизистой тонкого кишечника биопсийный материал исследовали по методу Hope, Vincent (1989). О количественном синтезе NO судили по NADPH-диафоразе, ферменте, солокализованном в клетках с нитрооксидсинтазой (NOS).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведенное исследование показало, все пациенты I группы имели пищевую непереносимость лактозы различной степени выраженности. У детей с ЛН (39 человек) регистрировали: учащенный стул водянистого характера, пенистый, с кислым запахом (100%), срыгивания у 24 (61,5%), рвоту — у 6 (15,36%). Для пациентов были характерны метеоризм (92,16% случаев), флатуленция (87,04%), кишечные колики (92,16%). Копрологические нарушения были умеренно выражены: смешанная стеаторея — у 15 детей (38,4%), стеаторея II типа у 18 (46,08%), амилорея — у 37 (94,72%), креаторея — у 18 (46,2%), переваримая клетчатка — у 23 (58,9%), йодофильная флора — у 34 (87,04%) детей. рН кала составлял 5,47 ±_0,32. Уровень общего содержания углеводов в кале (реакция Бенедикта) — 1,26 ±_0,07%. Были выявлены нарушения микробиоты кишечника I степени у 31 (79,5%), II степени — у 8 (20,5%): общее количество кишечной палочки было сниженным у 35 (89,7%), бифидобактерий — у 34 (87,04%), лактобактерий — у 37 (94,8%) детей, у 17 (43,6%) зарегистрирована патогенная и условно патогенная микрофлора (пролиферация лактозонегативных и гемолизинпро-дуцирующих эшерихий, стафилококков и грибов рода Candida).
Иммунологическое исследование секрета ротоглотки у больных 1-й группы показало достоверно низкие показатели (р < 0,01) уровней SIgA, ответственного за систему местного иммунитета, при сравнении с больными 2-й группы. IgE в секрете ротоглотки у детей с ЛН не отличался от нормы. Содержание IgM и IgG у детей с ЛН достоверно превышал показатели группы сравнения (табл. 1).
Уровень цитокинов в слюне достоверно отличался у пациентов с ЛН. При анализе соотношений про- и противовоспалительных цитокинов в слюне
Таблица 1
СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ЦИТОКИНОВ В СЛЮНЕ
Показатели Группы Достоверность, p
I группа, n = 39 II группа, n = 20
IgG, г/л 9,624 ± 0,412 0,084 ± 0,032 < 0,05
IgM, г/л 5,506 ± 0,211 4,915 ± 0,211 < 0,05
sIgA, г/л 0,301 ± 0,006 0,531 ± 0,031 < 0,01
IgE общ., г/л 2,112 ± 0,091 1,861 ± 0,211 > 0,05
ИЛ-lb (пкг/мл) 186,035 ± 26,617 97,644 ± 11,226 < 0,05
ИЛ-2 (пкг/мл) 2,853 ± 0,761 2,336 ± 0,224 < 0,05
ИЛ-4 (пкг/мл) 71,294 ± 1,789 12,774 ± 3,225 > 0,05
ИЛ-8 (пкг/мл) 134,383 ± 18,761 124,336 ± 9,321 < 0,05
ФНО-а (пкг/мл) 176,803 ± 18,276 124,365 ± 18,654 < 0,05
нами выявлено их значительное повышение у детей с ЛН за счет преобладания провоспалительных цитокинов (табл. 1).
В иммуноглобулиновом спектре сыворотки крови детей с ЛН достоверных различий по сравнению с контрольной группой зарегистрировано не было (рис. 1). При изучении уровня системных цитокинов было выявлено незначительное увеличение уровня про- и противовоспалительных цитокинов, при этом в сыворотке крови отмечалось преобладание противовоспалительных цитокинов (рис. 1,p > 0,5).
При эндоскопическом исследовании в периоде выраженных клинических проявлений ЛН изменений слизистой оболочки пищевода не выявлено ни одного пациента, в 41,66% (15) случаев выявлены воспалительные изменения слизистой оболочки желудка. У 33,33% отмечалась повышенная кислотообразующая
функция желудка. При динамическом наблюдении за 15 пациентами в периоде ремиссии на фоне диетотерапии и исчезновении клинических проявлений заболевания воспалительные изменения слизистой оболочки желудка практически полностью купировались и сохранялись лишь у 2 детей по типу поверхностной (эритематозной) гастропатии. Отсутствие структурных изменений слизистой оболочки пищевода подтверждено выборочными биопсиями, в которых определялся многослойный плоский неороговевающий эпителий без признаков воспаления. Воспалительные изменения в биоптатах желудка были выявлены у 8 (22,22%) пациентов.
Эндоскопическое исследование слизистой оболочки тонкой кишки показало наличие
Н !£
■2" го
Орё
2 -
^
П а.
¡ли
и
а
>
V
X
а
1дй, г/л |дМ, г/л 1дА, г/л 1дЕ общ., ИЛ-1Ь ИЛ-2 ИЛ-4 ИЛ-8 ФНО-а г/л (пкгЛлл) (пкгЛлл) (пкгЛлл) (пкг/мл) (пкг/мл)
I группа, п-39 ~II группа, п=20
Рис. 1. Содержание иммуноглобулинов и цитокинов в сыворотке крови
Рис. 2. Слизистая оболочка тонкой кишки при лактазной недостаточности, период выраженных клинических проявлений. Окраска гематоксилином и эозином; об. х20, ок. х10
у 19 (52,77%) пациентов очаговой гиперемии и отека, 8 (22,22%) детей имело дополнительно изменения, описанные в виде симптома «манной крупы», проявление которого усиливалось в дистальном направлении. Гистологическое изучение СО тонкой кишки у 36 больных на фоне клинических проявлений ЛН не выявило существенных изменений структуры кишечных ворсин и энтероцитов. У 12 (33,3%) больных отмечалось небольшое уменьшение длины ворсин до 487,8 ± 2,0 мкм, без углубления крипт (171,8 ± 6,6 мкм). Соотношение длины ворсин к глубине крипт соответствовала 2,83 ± 0,01. Специфических изменений структуры кишечных ворсин и энтероцитов при ЛН выявлено не было. В собственной пластинке слизистой оболочки при гистологическом исследовании отмечалось нарастание клеточной плотности за счет межэпителиальных лимфоцитов и плазматических клеток (рис. 2).
Исследование структурных особенностей слизистой тонкой кишки выявило энтероциты, в цитоплазме которых определяется большое количество митохондрий, рибосом, эндоплазматического ре-тикулума (рис. 3).
Установлено, что энтероциты ворсин и крипт проявляли высокую нитрооксидсинтазную активность. Диформазан окрашивал эпителиальные клетки в интенсивно-синий цвет. Максимальная способность к синтезу N0 установлена в энтероци-тах ворсин. Активность фермента в них составила 109,61 ± 1,70 ЕОП. Клетки, расположенные в криптах, содержали на 52,7 ± 3,2% фермент средней активности. 71,5 ± 3,8% энтероцитов ворсин содержали фермент высокой активности, 25,2 ± 2,2% — средней активности, единичные энтероциты проявляли слабую N0-образующую способность. Бокаловидные клетки были диафоразонегативными. Наряду с
указанными структурами синюю окраску имели клетки концевых отделов желез. Эндотелий сосудов имел голубую окраску. В стадии клинико-лабора-торной ремиссии на фоне безлактозной диеты и восстановления структуры слизистой регистрировали значительное снижение нитрооксидсинтазной активности клеток. Подавляющее большинство эпителиоцитов содержало NOS низкой и средней плотности, появлялась слабая NO-синтезирующая способность у бокаловидных клеток, гранулы ди-формазана в которых располагались по периферии.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Одним из важнейших условий развития пищевой интолерантности является нарушение пищеварительного барьера, селективно защищающего организм от антигенных субстанций [8; 10]. В этой защите играют большую роль анатомо-функцио-нальная состоятельность эпителиального барьера и напряженность местного иммунного ответа, что отражается локальным цитокиновым профилем и экспрессией костимулирующих молекул на анти-генпредставляющих клетках, угнетению синтеза IgA и повышенной проницаемости эпителия кишечника, что способствует проникновению антигенов в кровоток. Анализ полученных данных позволяет считать, что формирование пищевой интолерант-ности лактозы сопровождается нарушением всех этапов пищеварения: полостного, пристеночного, внутриклеточного с изменением состояния местного иммунитета и микробиоты кишечника. Полученные данные убедительно свидетельствуют о наличии структурных изменений всех отделов желудочно-кишечного тракта. Длительное нарушение
OJ 1-Л
Рис. 3. Эпителиальная клетка кишечника при лактазной недостаточности (Я — ядро, МХ — митохондрии, ЭР — эндоплазматический ретикулум, АГ — аппарат Гольджи). х7000
расщепления Сахаров сопровождается вовлечением в патологический процесс слизистой оболочки желудка, тонкой кишки, печени и поджелудочной железы, данные изменения у большинства пациентов носят транзиторный характер.
Согласно современным представлениям, в механизмах формирования пищевой толерантности могут участвовать не только клетки слизистой оболочки тонкой кишки, с локализованным на их поверхности ферментом, расщепляющим молочный сахар, решающая роль в развитии толерантности принадлежит процессу взаимодействия Т-клеток с АГ-презентирующими клетками (АПК) и присутствию при этом взаимодействии костимулирующих молекул [11; 12]. Наше исследование показало, что в механизмах компенсации происходящих нарушений принимают участие некоторые мембранные, лизосомальные и митохондриальные ферменты, локализованные в энтероцитах. Обнаруженное при гистологическом исследовании собственной пластинки слизистой оболочки нарастание клеточной плотности за счет межэпителиальных лимфоцитов и плазматических клеток, выявление энтероцитов с большим количеством митохондрий, рибосом, эндоплазматического ретикулума свидетельствуют о компенсаторной реакции и большой физиологической нагрузке клеток. Проведенный анализ экспрессии NOS клеточными элементами слизистой
оболочки тонкой кишки у детей с ЛН свидетельствуют о патогенетическом участии нитрооксидергических механизмов в процессах кишечного всасывания. Эндогенное образование оксида азота и содержание его метаболитов при различных патологических состояниях изменяются посредством регу-ляторных воздействий провоспалительных цитокинов, динамика содержания которых в крови и биологических жидкостях позволяет судить об адекватности иммунного процесса при поражении пищеварительного тракта. Нарушения продукции противовоспалительных цитокинов создают условия для поддержания и дальнейшего развития хронического воспаления в слизистой оболочке путем снижения антиинфекционной защиты, формирования локального иммунодефицитного состояния и усиления повреждающего действия различных антигенов и патогенных микроорганизмов. Исследование неспецифических факторов защиты СО желудочно-кишечного тракта, особенностей мукозального иммунитета перспективно для изучения патогенеза формирования пищевой интолерантности у детей и разработки алгоритмов лечения и профилактики.
Н '£
■2" го
rnî О-Ё 2 -XÏ
Ц
ID œ *Е
и
а
>
V
X
а
ЛИТЕРАТУРА
1. Бельмер С.В., Мухина Ю.Г., Чубарова А.И и др. Непереносимость лактозы у детей и взрослых // Леч. врач. — 2005. — № 1. — С. 34-38.
2. Корниенко Е.А., Митрофанова Н.И., ЛарченковаЛ.В.
3. Лактазная недостаточность у детей раннего возраста // Вопр. соврем. педиатрии. — 2006. — Т.5. — № 4.
4. Лусс Л.В., Сидорович О.И., Успенская К.С. Пищевая аллергия и пищевая непереносимость: принципы диагностики и терапии // Леч. врач. — 2007. —№ 4. — С. 16-20.
5. Функциональные нарушения ЖКТ у детей раннего возраста. Лактазная недостаточность : пособие для врачей / Под ред. А.И. Хавкина. — М., 2007. — 22 с.
6. Dowdee A., Ossege J. Assessment of childhood allergy for the primary care practitioner // J. Am. Acad. Nurse Pract. — 2007. — Vol. 19, №
2. — Р. 53-62.
7. Halken S. Prevention of allergic disease in childhood: clinical and epidemiological aspects of primary and secondary allergy prevention // Pediatr. Allergy Immunol. — 2004. № 15, Suppl. 16. — Р. 4-5, 9-32.
8. Perino A., Cabras S., Obinu D. Lactose intolerance: a non-allergic disorder often managed by allergologists // Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. — 2009. — Vol.41, № 1. — Р. 3-16.
9. Swallow D.M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. // Annu. Rev. Genet. — 2003. — Vol. 37. — P. 197-219.
10. Szilagyi A., Shrier I., Heilpern D. Differential impact of lactose/lactase phenotype on colonic microflora // Can. J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 24, № 6. — P. 373-379.
11. Teuber S.S., Porch-Curren C. Unproved diagnostic and therapeutic approaches to food allergy and intolerance // Curr. Opin. Allergy Clin. Imunol. — 2003. — Vol. 3. — P. 217-221
12. TomicicS., Fälth-Magnusson K., BöttcherM.F. Dysregulated
and Th2 responses in food-allergic children — does elimination diet contribute to the dysregulation? // Pediatr. Allergy Immunol. — 2010. — № 21. — P. 649-655.
13. Vrese M., Stegelmann A., Richter B. Probiotics-compensation for lactase insufficiency // Am. J. Clin. Nutr. — 2001. — № 73. — P. 421-429.
14. WaddellL. Food allergies in children: the difference between cow's milk protein allergy and food intolerance // J. Fam. Health Care. — 2010. — № 20. — P. 104.
15. Walker S., Wing A. Allergies in children // Fam. Health Care. — 2010. — № 20. — P. 24-26.
16. Wilt T.J., Shaukat A, Shamliyan T. Lactose intolerance and health // Evid. Rep. Technol. Assess (Full Rep.). — 2010. — № 192. — P. 1-410.
m Lл
