CC BY
105
НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
Выбор носителя и условий дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток для восстановления костной ткани
Анна Жерносеченко,
научный сотрудник лаборатории клеточных биотехнологий и цитотерапии научного отдела РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии; sapphire.anna@gmail.com
Янина Исайкина,
кандидат биологических наук, заведующая лабораторией клеточных биотехнологий и цитотерапии научного отдела РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии; yaninai@mail.ru
Таисия Михалевская,
врач-патологоанатом РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии; aisiat@tut.by
Аннотация. Представлены краткий аналитический обзор рекомендуемых клеточных носителей с целью создания биоинженерной конструкции для восстановления участка костной ткани и результаты собственного исследования. Недиференцированными и остеогенно преддифференцированными мезенхималь-ными стволовыми клетками (МСК) заселяли различные носители: гидроксиапатит, коллагеновую губку и фибриновый гель. Полученные результаты свидетельствуют, что для репарации костной ткани наиболее эффективно использование недифференцированных МСК с последующей дифференцировкой клеток факторами -индукторами остеогенеза в составе матрикса, а фибриновый гель представляет собой оптимальный клеточный носитель, так как обеспечивает равномерное распределение клеток и поддерживает их функциональную активность. Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, клеточный носитель, остеогенная дифференцировка, фибриновый гель. Для цитирования: Жерносеченко А, Исайкина Я., Михалевская Т. Выбор носителя и условий дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток для восстановления костной ткани // Наука и инновации. 2019. №5. С. 58-61. Л йрз://ёоюгд/10.29235/1818-9857-2019-5-58-61
УДК: 616.419-018.4:576.5361:616.71.004.64-003.93
езенхимальные стволовые клетки широко применяются в регенеративной медицине и тканевой инженерии, что обусловлено их уникальными биологическими характеристиками, такими как относительная доступность, высокая пролиферативная активность и легкость экспансии in vitro, конституционная предрасположенность к дифференцировке в хондрогенном и остеогенном направлении. Гипоиммуноген-ность дает возможность использовать не только аутологичные, но и аллогенные клетки донора.
Важнейшим феноменом МСК костномозгового происхождения, делающим их идеальными для репарации костной и хрящевой
тканей, является экспрессия основного конституционного гена коллагена 1-го типа (COL-I) - маркера остеогенеза и коллагена 10-го типа (COL-X) - маркера хондроге-неза. По данным Conget P.A et al., потенциал к остео/хондрогенной дифференцировке остается у 6080% первичных клонов МСК костного мозга человека [1].
Остеобласты развиваются в линейном последовательном процессе от остеопрогениторных клеток до преостеобластов, остеобластов и остеоцитов через упорядоченно регулируемую экспрессию генов. Уже в начале остеогенной диффе-ренцировки МСК теряют свою фи-бробластоподобную форму и приобретают шаровидную [2, 3].
МСК синтезируют широкий спектр молекул, способных индуцировать пролиферацию и созревание предшественников остеоцитов в самой костной ткани, окружающей область некроза, таким образом стимулируя репарацию пораженного участка. В эксперименте in vitro остеогенная диффе-ренцировка легко стимулируется добавлением аскорбиновой кислоты, в-глицеролфосфата и гидрокортизона или дексаметазона [4-10].
Реконструкция обширного участка костной ткани требует тканеинженерного подхода, то есть создания клеточной конструкции на основе носителя, при этом важно сохранить жизнеспособность и функциональную активность клеток. Материал для матрицы должен обладать способностью к высокой адгезии клеток, их сохранению в имплантате и поддержке пролиферации; биосовместимостью, предотвращающей иммунные реакции у реципиента после имплантации; остео-индуктивностью; биопроводимостью, обеспечивающей свободную
диффузию питательных веществ и кислорода; структурой и механическими свойствами, подобными нативной костной ткани; поддерживать васкуляризацию и соотносительную степень деградации с образованием новой костной ткани [11].
Наиболее широко в качестве клеточного носителя для создания биоинженерной конструкции используются коллаген и фибрин в связи с их высокой адгезивной способностью, низкой иммуно-генностью, быстрой резорбцией, а также сохранностью в фибри-новом и коллагеновом матриксе высокой плотности внесенных клеток, их остеогенной морфологии и фенотипа после диффе-ренцировки [12, 13]. Фибриновый матрикс, кроме того, формирует непрерывную границу с костной тканью в месте имплантации [14]. Транспортировать МСК также можно с помощью альгинатного гидрогеля, кальция фосфата и ги-дроксида фосфата кальция, который входит в состав нативной костной ткани [15-18].
Целью настоящего исследования является определение степени остеогенной дифференциров-ки МСК и выбор носителя для их доставки в зону костного дефекта при имплантации.
Дифференцировка в остеоген-ном направлении в 2D-культуре. Изоляция и экспансия МСК проводилась из проб костного мозга. Мононуклеарные клетки выделяли на Гистопаке плотностью 1,077 г/мл (Sigma, США) и культивировали в среде IMDM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) (Sigma, США) в концентрации 1 • 106/мл во флакон 25 см2 (Sarstedt, Германия), затем инкубировали при +37 °С и 5% СО2. После проведения двух пассажей
подтверждали принадлежность полученных клеток к МСК методом проточной цитофлуори-метрии по наличию специфических маркеров CD90, CD105, CD73, экспрессия которых в популяции должна составлять > 95%. [19]. Использовали МСК 2-го или 3-го пассажей. Для проведения эксперимента полученные из костного мозга доноров (n=3) клетки рассаживали в 4-луночный планшет по 1 • 105 в лунку в среду DMEM с 10% ЭТС в двух вариантах: c добавлением 10 мМ глицерол-2-фос-фата, 1% антибиотика, 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты, 10 нг/ мл BMP-2, 100 нМ дексаметазона и без факторов дифференци-ровки (контроль). МСК культивировали в СО2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 90% влажности со сменой среды каждые 3-4 дня. Через 21 день для подтверждения направленной остеогенной диф-ференцировки (методом оценки активности щелочной фосфата-зы) клетки окрашивали с помощью специального набора (Sigma, США) согласно инструкции. Присутствие кальциевых депозитов устанавливали окраской 2%-ным раствором ализаринового красного (pH 4,1) в 10%-ном растворе формальдегида.
Остеодифференцировка в 3D-системе. МСК (n=3) культивировали в среде DMEM с добавлением факторов для остеогеноой дифференцировки. В качестве носителей применяли фибриновый гель, коллагеновую губку и гранулы гидроксиапатита с коллагеном «КоллапАн-Р». Каждый из носителей помещали в лунку 24-луночного планшета совместно с 1 • 106 МСК в 1 мл дифферен-цировочной среды. МСК в фибри-новом геле получали путем смешивания суспензии клеток с 0,01 г
НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
■'■ 'ш с- ■ . ■ • „ Б| У~/>■' > у ' % - - /„ ' ? ■ зР ■ г- й» ЕЯ
Д • V- й* Г г* -л* - •/'• . ,->: ■ V 1 V ■ .. .- в . 1 & я
Рис. 1. Культура МСК: А, В, Д - клетки после дифференцировки в остеогенном направлении в течение 21 дня, Б, Г, Е - МСК до дифференцировки. А, Б - морфология клеток, В, Г - окраска композитов Са ализариновым красным, Д, Е - окраска клеток на присутствие щелочной фосфатазы
фибриногена, растворенного в 1 мл 0,9%-ного водного раствора хлорида натрия с добавлением 100 мкл апротенина, и последующего добавления 100 ьи тромбина, разведенного в 1 мл 0,9%-ного водного раствора хлорида натрия. Наблюдали, чтобы поверхность коллагеновой губки и гранулы «КоллапАн-Р» были полностью покрыты суспензией МСК. Планшет помещали в СО2-инкубатор при 37 °С, 5% СО2 и 90% влажности. Культивирование проводили в течение 14 дней со сменой среды через 2-4 дня. Морфофункцио-нальное состояние клеток оценивали методом гистологического анализа каждой из 3Э-куль-тур с приготовлением срезов
парафиновых блоков и окраской гематоксилин-эозином.
Остеодифференцировка МСК в условиях культивирования в монослое. После 21 дня направленной остеогенной дифференцировки МСК наблюдалось морфологическое изменение клеток, которое проявлялось в потере характерной для них веретенообразной формы (рис. 1Б) и трансформации в широкие, распластанные, подобные остеобластам, и плоские, с большим числом контактирующих отростков, подобные остеоцитам (рис. 1А). Внесение ализаринового красного индикатора давало характерное ярко-красное окрашивание обширных внеклеточных кальциевых депозитов через 21
день после индукции остеодиффе-ренцировки, тогда как в изначальной культуре МСК окраски не было (рис. 1В, Г). Интенсивный синтез кальция, приводящий к минерализации ткани, характерен для остеогенеза. Таким образом, полученные результаты по накоплению кальция во внеклеточном ма-триксе подтвердили остеогенную дифференцировку МСК.
Для установления наличия остеобластов в культуре МСК определяли активность в клетках щелочной фосфатазы. Подтверждала синтез этого фермента интенсивная ярко-фиолетовая окраска цитоплазмы после стимуляции остеогенной дифференци-ровки на 21-й день, в отличие от недифференцированных МСК контроля (рис. 1Д, Е).
Остеодифференцировка МСК при культивировании в 3D-системе. Исследовались три различных образца донорских МСК. Заселение каждого из них в трех различных носителях (фибриновый гель, кол-лагеновая губка и гранулы ги-дроксиапатита «КоллапАн-Р») выполняли в двух комбинациях. В первом варианте происходило первоначальное заполнение носителя недифференцированными МСК, а затем культивирование композита в среде с индукторами остеогенеза. Во второй комбинации монослойную культуру МСК индуцировали добавлением коктейля ростовых факторов, с последующим введением остео-генно преддифференцированных клеток в матрикс.
При использовании гранул «КоллапАн» и недифференцированных МСК через 14 дней остеогенной дифференцировки в гистологическом срезе не обнаружено клеток. Аналогичной была картина в образцах, когда
к -.1 > л
и ■ ЁШ 1Ш Д| ' 1 и; ф- тш ■ -у.^. ■■ ¿МЗ1
Рис. 2. Гистологические срезы на 14-й день после заселения недифференцированными МСК: А - гидрок-сиапатита «КоллапАн», В - коллагеновой губки, Д - фибринового геля. Гистологические срезы на 14-й день после заселения остеогенно преддифференцированными МСК: Б - гидроксиапатита «КоллапАн», Г - коллагеновой губки, Е - фибринового геля. Окраска гематоксилин-эозином
гидроксиапатит помещали в суспензию предварительно дифференцированных клеток (рис. 2А, Б).
В образцах коллагеновой губки, заселенных недифференцированными МСК с последующей диффе-ренцировкой в составе носителя, наблюдалось их небольшое количество. При внесении остеогенно преддифференцированных МСК через 14 суток в гистологическом срезе их не выявлено (рис. 2В, Г).
Наилучшие результаты показал фибриновый гель. Так, большинство внесенных в него недифференцированных МСК через 14 суток находилось внутри субстрата и отмечалось их равномерное распределение. При анализе гистологических срезов
определялись крупные округлые клетки со светлой цитоплазмой, гиперхромным округлым ядром, часть - в состоянии митоза. Кроме того, наблюдалось просветление в области комплекса Гольджи, что свидетельствует об активной наработке белка. В образцах, заполненных преддифференцированными в остеогенном направлении МСК, выявлены небольшие фрагменты эозинофильного материала и отдельные клетки округлой формы с эксцентричным гиперхромным пикнотичным ядром, из-за дис-трофичности кластеры или скопления клеток не сформировались (рис. 2Д, Е).
На основании полученных нами данных можно сделать вывод,
что использование недифференцированных МСК для заселения носителя с последующей диффе-ренцировкой в присутствии факторов - индукторов остеогенеза более эффективно, чем применение преддифференцированных МСК. Из трех носителей (фибриновый гель, коллагеновая губка и гранулы гидроксиапатита с коллагеном «КоллапАн-Р») предпочтителен фибриновый гель, который способствует равномерному распределеннию функционирующих клеток. Остеогенная дифференцировка МСК в носителе подтверждается накоплением кальция во внеклеточном матриксе и синтезом щелочной фосфатазы..
■ Summary. The purpose of this study was to determine the degree of osteogenic differentiation of MSCs and to choice of scaffold for them. Histological analysis revealed the presence few dystrophic cells or absence of them when we seeded and cultured for 14 days predifferentiated MSCs into the hydroxyapatite, collagen sponge, fibrin gel. The undifferentiated MSCs weren't found in histological section after cells culture with the hydroxyapatite, the presence cells into the collagen sponge were insignificant. The test detected the even distribution and functional activity of cells into fibrin gel. Our results proved that fibrin gel is the optimal cellular scaffold and colonization it undifferentiated MSCs is effective for creating structure for the bone repair.
■ Keywords: mesenchymal stem cells, scaffold, osteogenic differentiation, fibrin gel.
■ https://doi.org/10.29235/1818-9857-2019-5-58-61
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Conget P. A., Allers C., Minguell J. J. Identification of a discrete population of human bone marrow-derived mesenchymal cells exhibiting properties of uncommitted progenitors // J. Hematother. Stem. Cell. Res. 2001. Vol. 10, N6. P. 749-758.
2. Rodriguez J. P., Gonzalez M., Rios S.,Cambiazo V. Cytoskeletal organization of human mesenchymal stem cells (MSC) changes during their osteogenic differentiation // J. Cellular Biochem. 2004. N93. Р.721-731.
3. LinyiP., Zhuqing J., Xinhua Y. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, cartilage, and adipose tissue // Stem cells and development. 2008. N17. Р.761-774.
4. Langenbach F., Handschel J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and ^-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro // Stem Cell Research & Therapy. 2013. N4. Р.117.
5. Beederman M., Lamplot J. D., Nan G., Wang J. BMP signaling in mesenchymal stem cell differentiation and bone formation // J. Biomed. Sci. Eng. 2013. N6 (8A). Р.32-52.
6. Luu H. H., Song W. X., Luo X. et al. Distinct roles of bone morphogenetic proteins in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells // J. Orthop. Res. 2007. N25(5). P. 665-677.
7. Kang Q., Song W. X., Luo Q. et al. A comprehensive analysis of the dual roles of BMPs in regulating adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells // Stem Cells Dev. 2009. N18 (4). Р. 545-559.
8. Ng F., Boucher Sh., Koh S. et al. PDGF, TGF-ß,and FGF signaling is important for differentiation and growth of mesenchymal stem cells (MSCs): transcriptional profiling can identify markers and signaling pathways important in differentiation of MSCs into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages // Blood. 2008. Vol. 112, N2. P. 295-307.
9. Lebouvier A., Poignard A., Cavet M. et al. Development of a simple procedure for the treatment of femoral head osteonecrosis with intra-osseous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells: study of their biodistribution in the early time points after Injection // Stem Cell Research & Therapy. 2015. N6. Р.68.
10. Ciuffreda M. Ch., Malpasso G., Musaro P., Turco V. Protocols for in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells into osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages // Mesenchymal stem cells: methods and protocols, methods in molecular biology. 2016. Vol. 1416. P. 149-158.
11. Vinatier C., Bouffi C., Merceron C. et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy // Curr. Stem Cell Res. Ther. 2009. N4 (4). P. 318-329.
12. Richter W. Mesenchymal stem cells and cartilage in situ regeneration // J. Intern. Med. 2009. N266. P. 390-405.
13. Polo-Corrales L., Latorre-Esteves M.. Scaffold Design for Bone Regeneration // J. Nanosci. Nanotechnol. 2014. N14 (1). Р. 15-56.
14. Liu J., Zhao L., Ni L. et al. The effect of synthetic a-trica lciu m phosphate on osteogenic differentiation of rat bone mesenchymal stem cells // J. Transl. Res. 2015. N7 (9). P. 1588-1601.
15. Zhou H., Hockin H., Xu K. The fast release of stem cells from a lginate-fibrin microbeads in injectable scaffolds for bone tissue engineering // Biomaterials. 2011. N32 (30). Р. 7503-7513.
16. Shih Y., Hwang Y. S., Phadke A., Kang H. Calcium phosphate-bearing matrices induce osteogenic differentiation of stem cells through adenosine signaling // PNAS. 2014. Vol. 111. N3. Р. 990-995.
17. Lebouvier A., Poignard A., Cavet M. Development of a simple procedure for the treatment of femoral head osteonecrosis with intra-osseous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells: study of their biodistribution in the early time points after injection // Stem Cell Research & Therapy. 2015. N6. Р. 68.
18. Yuan H., Kurashina K., de Bruijn J. D. et al. A preliminary study on osteoinduction of two kinds of calcium phosphate ceramics // Biomaterials. 1999. N20. P. 1799-1806.
19. Букач Дм. В., Белецкий А. В., Эйсмонт О. Л., Мохаммади М. Т., Исайкина Я. И. Аутотрансплантация мезенхимальных стволовых клеток для регенеративного восстановления повреждений суставного хряща (экспериментальное исследование) // Весц Нацыянальнай акадэми навук Беларуси Серыя мед. навук. 2015. №1. С. 5-11.
Статья поступила в редакцию 22.01.2018 г.
