CC BY
30
Научни трудове на Съюза на учените в България - Пловдив. Серия В. Техника и технологии. Том XVII, ISSN 1311 -9419 (Print); ISSN 2534-9384 (Online), 2019. Scientific Works of the Union of Scientists in Bulgaria - Plovdiv. Series C. Technics and Technologies. Vol. XVII., ISSN 1311 -9419 (Print); ISSN 2534-9384 (Online), 2019
УСТАНОВЯВАНЕ НА АЛЕЛНОТО СЪСТОЯНИЕ НА ГЕНА PUN-1 , ОТГОВАРЯЩ ЗА СИНТЕЗА НАКАНСАНЦНН, В АЗБРАНН ВИДОВЕ ОТ РОД CAUSICUA (ИНПЕР) Тодорка Кребчева*, Божин Божинов Катедра „Генетика и селекция", Аграрен Университет, Пловдив,
Бьлгария
IDENTIFICATION OF ALLELIC STATE OF THE PUN-- GENE ASSOCIATED WITH THE CAPSAICIN SYNTHESIS IN SELECTED CAPSICUM (PEPPER) SPECIES. TodorkaSrebcheva*, Bojin Bojinov Department )f Genetics and Plant Eoeeding, Agricultural University,
Plovdiv, Bulgaria
Abstract
Known in Europe from the end of 15-th century and with key economic importance today the species of the genus Capsicum, Solanaceae, have the unique capacity to synthesize capsaicin. Capsaicin is the main of a group of alkaloid compounds that give the pungency to pepper. Its biosynthesis is complex and requires a number of intermediate compounds that are produced through two separate pathways that at the end converge so that the condensation reaction is controlled by the Pungency gene 1 (Pun 1) at chromosome 2, identified as acyltransferase 3 (At 3). Mutations in the Pun-1 gene lead to the loss of pungency. So far four mutant alleles of this gene are known: pun1-1, pun1-2, pun1-3 and pun1-4.
The aim of the current study was to examine the allelic state of some Bulgarian peppers. Genomic DNA from 2 pungent and 3 non-pungent Bulgarian pepper varieties was used for amplification with allele-specific primers for the pun1-1 mutation.
After the PCR amplification the products were subjected to electrophoretic separation in 2% w/v agarose gels and visualized by staining with ethidium bromide.
The analysis of the PCR products revealed that amplified fragments confirm the presence of this particular allele of the Pun-1 gene (the pun1-1 allele) as the cause for the lack of pungency in studied genotypes. In the pungent C. chinense species a fragment of 1064 bp was obtained that according to the literature corresponds to the Pun-1/Pun-1 wild type.
Keywords : Pun1, Capsaicin , Pepper, Pungency, Capsicum,
Тъведение
Като икономически важна култура в световен мащаб, пиперът е подробно изследван (Das et al., 2016; Ibarra-Torres et al., 2015; Lahbib et al., 2017; Moreira et al., 2018; Tanaka et al., 2014). Установено е, че само видовете от род Capsicum са в състояние да синтезират алкалоидното съединение капсаицин. След биосинтеза това вещество се секретира към външните епидермални клетки и накрая се натрупва в структури, наречени „мехури", разположени на повърхността на плацентата (Ananthan et al., 2018; Aza-Gonzalez et al., 2011; Lahbib et al., 2017; Stewart et al., 2007). Капсаицинът е изолиран за първи път в края на 19-ти
век (Thresh, 1876), а точната му природа е установена през 1923 г. (Nelson and Dawson, 1923). Наличието на капсаицин се контролира от локус Pun-1, кодиращ ацилтрансфераза (Ben-Chaim et al., 2001; Blum et al., 2002; Lefebvre et al., 1995). Функционални дефекти в този ген водят до загуба на пикантност (Han et al., 2013; Kobata et al., 2013). При рецесивния алел pun1-1 се наблюдава 2.5-kb делеция, обхващаща предполагаемия промоторен регион и голяма част на първия екзон. Смята се, че широко разпространеният в сладките сортове от вида Capsicum annuum алел е възникнал преди около 3 века. (Boswell, 1937; Lee et al., 2005). При алел pun1-2 в C. chinense има 4-bp делеция в първи екзон, която създава ранен стоп кодон. В този алел има транскрипция, но не се произвежда протеинов продукт (Stewart et al., 2007). В алела pun 1-3 в C. frutescense голяма делеция във втори екзон води до загубата на 70 аминокиселини в Pun1 протеина. Този алел не се транскрибира, нито транслира (Stellari et al., 2010). Произходът на алел pun1-4 в сорт Nara Murasaki от C. annuum не е известен. Въпреки, че има пълен промотор и екзон 1, една инсерция във втори екзон предизвиква изместване в рамката на четене (Kirii et al., 2017). Мутациите в Pun1 локуса са предпочитани и се използват от дълго време при отглеждането на сладки пипери (Deshpande, 1935).
Множеството данни показват как промените във фенотиповете по време на култивирането на растенията могат да бъдат резултат от смущения в единични доминантни гени, като Pun1. Над един век са продължили изследванията на алелния състав при лютиви и сладки пипери. Установено е, че алелът pun1-1 е отговорен за липсата на пикантност в C. annuum в резултат на голяма делеция в Pun1, която е запазета и разпространяваш в продължение на няколко века.
Фигура 1. Известните алели на гена Pun 1:
- Широка 5' делеция продуцира pun 1-1;
- мутация в първи екзон променя рамката на четене в pun1 -2;
- прекъсване във втори екзон в pun1 -3.
- Мутациите pun1-1 и pun 1-3 не се транскрибират, докато при pun 1-2 се наблюдава транскрипция, но не и транслация.
- pun 1-4 притежава единично нуклеотидно вмъкване във втория екзон, което променя рамката на четене (Kirii et al., 2017; Stellari et al., 2010).
За установяване на алелното състояние на трите български сорта пипер (Пловдивска капия, Фамилия и ИЗК Деликатес) е необходимо използването на алел-специфични PCR праймери, които могат да открият функционалните нуклеотидни полиморфизми на четирите Pun1 алели. Разработването на такъв набор от маркери е възпрепятствано от наличието на псевдоген catf2. catf2 е паралог на Punl, с 82% идентичност на секвенцията (Lang et al. 2006 г.). За да се разграничи надеждно алела pun1-1 от другите алели Pun1 Wyatt et al. (2012) проектират 3-праймерен PCR маркер. Чрез позиционирането на първият прав праймер в областта с делеция, амплифицирането се случва само в отсъствието на мутация pun1 -1. Вторият прав праймер обхваща областта с делеция, така че се свързва и амплифицира само, когато делецията на pun1-1 е налице (Wyatt et al., 2012). Точно тази комбинация от праймери е използвана и в настоящото изследване.
Материали и методи
За извършване на анализите беше екстрахирана геномна ДНК от млада листна тъкан от растения пипер, като беше използван метода на Doyle and Doyle (1990). PCR условията,
при които е извършена реакцията, са както следва: 12,5ц1 master mix, 0.25 ц1 от 10 цМ pun11 fwd 1 праймер, 0.25 ц1 от 10 цМ pun11 fwd2 праймер, 0.25 ц1 от 10 punll rev праймер, 10 ц1 от 20 ng/ц! разтвор на геномна ДНК и Н2о до краен обем от 25 ц1. PCR циклите са както следва: 94°С в продължение на 4 минути, 35 цикъла при 94°С за 30 секунди, 60°С за 1 минута, 72°С в продължение на 2 минути и крайно удължаване при 72°С за 10 минути. PCR продуктите са визуализирани върху 2% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид.
Таблица 1: Използвани PCR праймери
Праймер Секвенции
pun11 fwd 1 TCCTCATGCATCTCTTGCAG
pun11 fwd 2 GCTCCACGGAAAAGACTCAT
pun11 rev CAAATGGCAGTTTCCCTTCTCTCATT
Резултати и обсъждане
Фигура 2: Старт 1 - C. annuum, сладък сорт Пловдивска капия - бенд от 746 bp; Старт 2. C. chinense - лютив, бенд от 1064 bp; Старт 3. C. annuum, сладък сорт Фамилия - бенд от 746 bp; Старт 4. C. chinense, лютив сорт Хабанеро; Старт 5. C. annuum сладък сорт Деликатес - бенд от 746 bp. М - ДНК стандарт
С така използваните праймери за рецесивния алел punl-1 са амплифицирани продукти с големина 746 bp при сладките български сортове пипер от вида C. annuum. По литературни данни тези фрагменти отговарят на хомозиготното състояние на алела punl-1 (punl-1/punl-l), тоест липсата на лютивина, респективно на синтез на капсаицин, се дължи на преминаването на тази мутация в хомозиготно състояние. При проба 2 от лют пипер от вида C. chinense се наблюдава бенд с големина 1064 bp, отговарящ на хомозиготното състояние на алела Pun1 (Pun1/Pun1) - дивият тип.
Заключение
Идентифицирането на рецесивните алели на Punl, чрез използване на молекулни маркери, ще бъде полезно в програмите за размножаване и проучвания на алелно разнообразие. Установено е, че в изследваните български сортове загубата на лютивина се дължи на наличието на най-широко разпространения мутантен алел - pun l-l.
Използвана литература
Ananthan, R., Subhash, K., and Longvah, T. (2018). Capsaicinoids, amino acid and fatty acid profiles in different fruit components of the world hottest Naga king chilli (Capsicum chinense Jacq). Food Chemistry 238, 51-57. Aza-Gonzalez, C., Nunez-Palenius, H. G., and Ochoa-Alejo, N. (2011). Molecular biology of
capsaicinoid biosynthesis in chili pepper (Capsicum spp.). Plant Cell Reports 30, 695-706. Ben-Chaim, A., Grube, R. C., Lapidot, M., Jahn, M., and Paran, I. (2001). Identification of quantitative trait loci associated with resistance to cucumber mosaic virus in Capsicum annuum. Theoretical and Applied Genetics 102, 1213-1220. Blum, E., Liu, K., Mazourek, M., Yoo, E. Y., Jahn, M., and Paran, I. (2002). Molecular mapping
of the C locus for presence of pungency in Capsicum. Genome 45, 702-705.
Boswell, V. R. (1937). Improvement and genetics of tomatoes, peppers, and eggplant. In "Yearbook of Agriculture" (H. A. Wallace, ed.), pp. 176-206. United States Government Printing Office, Washington.
Das, S., Teja, K. C., Duary, B., Agrawal, P. K., and Bhattacharya, S. S. (2016). Impact of nutrient management, soil type and location on the accumulation of capsaicin in Capsicum chinense (Jacq.): One of the hottest chili in the world. Scientia Horticulturae 213, 354-366
Deshpande, R. J. I. J. A. S. (1935). Studies in Indian chillies: 4. Inheritance of pungency in Capsicum annuum L. 5, 513-516.
Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-15
Han, K., Jeong, H., Sung, J., Keum, Y., Cho, M., Kim, J., Kwon, J., Kim, B., and Kang, B. (2013). Biosynthesis of capsinoid is controlled by the Pun1 locus in pepper. Mol Breeding 31, 537548.
Ibarra-Torres, P., Valadez-Moctezuma, E., Pérez-Grajales, M., Rodríguez-Campos, J., and Jaramillo-Flores, M. E. (2015). Inter- and intraspecific differentiation of Capsicum annuum and Capsicum pubescens using ISSR and SSR markers. Scientia Horticulturae 181, 137146
Kirii, E., Goto, T., Yoshida, Y., Yasuba, K.-i., and Tanaka, Y. (2017). Non-pungency in a Japanese Chili Pepper Landrace (<i>Capsicum annuum</i>) is Caused by a Novel Loss-of-function <i>Pun1</i> Allele. The Horticulture Journal 86, 61-69.
Kobata, K., Sugawara, M., Mimura, M., Yazawa, S., and Watanabe, T. (2013). Potent Production of Capsaicinoids and Capsinoids by Capsicum Peppers. Journal of Agricultural and Food Chemistry 61, 11127-11132.
Lahbib, K., Dabbou, S., Bok, S. E. L., Pandino, G., Lombardo, S., and Gazzah, M. E. L. (2017). Variation of biochemical and antioxidant activity with respect to the part of Capsicum annuum fruit from Tunisian autochthonous cultivars. Industrial Crops and Products 104, 164-170.
Lang YQ, Yanagawa S, Sasanuma T, Sasakuma T (2006) A gene encoding a putative acyl-transferase involved in pungency of Capsicum. Breed Sci 56:55-62
Lefebvre, V., Palloix, A., Caranta, C., and Pochard, E. (1995). Construction of an intraspecific integrated linkage map of pepper using molecular markers and doubled-haploid progenies. Genome 38, 112-121.
Moreira, A. F. P., Ruas, P. M., Ruas, C. d. F., Baba, V. Y., Giordani, W., Arruda, I. M., Rodrigues, R., and Gongalves, L. S. A. (2018). Genetic diversity, population structure and genetic parameters of fruit traits in Capsicum chinense. Scientia Horticulturae 236, 1 -9.
Nelson, E. K., and Dawson, L. E. (1923). The constitution of capsaicin, the pungent principle of Capsicum. III. Journal of the American Chemical Society 45, 2179-2181.
Stellari, G. M., Mazourek, M., and Jahn, M. M. (2010). Contrasting modes for loss of pungency between cultivated and wild species of Capsicum. Heredity 104, 460-471.
Stewart, C., Jr. , Mazourek, M., Stellari, G. M., O'Connell, M., and Jahn, M. (2007). Genetic control of pungency in C. chinense via the Pun1 locus. Journal of Experimental Botany 58, 979-991.
Tanaka, Y., Yoneda, H., Hosokawa, M., Miwa, T., and Yazawa, S. (2014). Application of marker-assisted selection in breeding of a new fresh pepper cultivar (Capsicum annuum) containing capsinoids, low-pungent capsaicinoid analogs. Scientia Horticulturae 165, 242-245.
Thresh, J. C. (1876). Isolation of capsaicin. The Pharmaceutical Journal and Transactions 6, 941947.
Wyatt L., Eannetta N., Stellari G., Mazourek M. (2012). Development and application of a suite of non-pungency markers for the Pun1 gene in pepper (Capsicum spp.)
