CC BY
94
УДК 615.322:582.287.237
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ.
XIII. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА КОЛЛОИДНОЙ СИСТЕМЫ, ФОРМИРУЕМОЙ ПОСЛЕ УДАЛЕНИЯ ДИСПЕРСНОЙ ФАЗЫ ИЗ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ ХЛОРИСТОВОДОРОДНОЙ КИСЛОТОЙ
© М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова , В.С. Гамаюрова
Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, 420015, Республика Татарстан (Россия) E-mail: ramven@rambler.ru
Статья посвящена комплексному исследованию фильтрата, полученного из водного извлечения чаги, после осаждения по-лифенолоксикарбонового комплекса (ПФК) хлористоводородной кислотой. Применена исчерпывающая экстракция фильтрата с различной последовательностью использования органических растворителей для определения биологически активных соединений различных классов, которые находятся в нем в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой состоянии. Определено количество указанных соединений в фильтрате, а также изучен их качественный состав. Установлено, что в свободном или слабосвязанном состоянии в фильтрате присутствуют липиды, фенольные соединения, углеводы.
Ключевые слова: чага, водная вытяжка, полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК), фильтрат, липиды, фенольные соединения.
Введение
Водные извлечения чаги используются для профилактики и лечения предраковых заболеваний и рака различной этиологии. На их основе готовят ряд препаратов. Основным действующим компонентом извлечений считается полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК) [1]. Он обладает более высокими антиокси-дантными свойствами, чем водные извлечения чаги [2]. Ранее был разработан таблетированный препарат на основе ПФК - «Бин-чага», эффективно применяемый для лечения гастритов [3].
Отделение ПФК из водного извлечения чаги проводят хлористоводородной кислотой. Это приводит к осаждению 50-60% ПФК от сухого остатка водного извлечения. В фильтрате, имеющем рН около 2, формируется новая коллоидная система. Часть соединений в фильтрате оказываются в связанном с дисперсной фазой состоянии [4].
Исследованию веществ, остающихся после осаждения ПФК, посвящено несколько работ. Первоначально считалось, что в фильтрате остаются зольные элементы, полисахарид, часть свободных ароматических кислот и щавелевая кислота [1, 5]. Затем, в нем было определено содержание фенольных соединений в количестве 0,62%, углеводов - 3,88 [6], и 0,1 и 1,88% соответственно [7]. С помощью ТСХ были идентифицированы вещества, принадлежащие к различным классам соединений: к фенольным - резорцин и пирокатехин, к ароматическим кислотам - кофейная кислота, к флаваноидам - апигенин и кверцетин, к углеводом - глюкоза и ксилоза [7].
Цель исследования - комплексное изучение биологически активных соединений различных классов, находящихся в фильтрате после осаждения ПФК из водного извлечения чаги хлористоводородной кислотой в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой фильтрата состоянии.
Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Поставщик ЗАО «Фирма Здоровье», серия 020605, 2005 г. Московская область, Красногорский район. Вытяжки получали согласно методике [8]. Осаждение ПФК из водных вытяжек чаги осуществляли согласно методике [9].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Содержание экстрактивных веществ в фильтрате и экстрактах, полученных при его обработке, определяли по [10] и [11] соответственно. Количественное определение углеводов, фенолов, белков осуществляли согласно [12], [13]и [10] соответственно.
Электронные спектры снимали на спектрофотометре UNICO UV/VIS 2800.
Качественный состав липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» в следующих системах растворителей: петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (90 : 10 : 1 для нейтральных липидов) и хлороформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода (6 : 8 : 2 : 2 : 1 для полярных липидов). В качестве проявителей применяли: 20%-ный раствор сульфата аммония (все классы липидов); раствор хлорного железа (стерины и их эфиры); 0,25% раствор нингидрина в бутаноле (липиды, имеющие свободные аминогруппы, а также аминофосфатиды в количестве не менее 1 мкг); анилинфталевый реактив (гликолипиды) [14].
Для количественного определения полярных липидов в хлороформ-этанольном экстрактах балластные соединения удаляли по методике [15]. Количественное определение стеринов, гликолипидов и липидов, содержащих в своем составе первичную аминогруппу, осуществляли согласно методикам [14-16].
Жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров на хроматографе «1Нимадзу-ОС-8А» с плазменно-ионизационным детектором с использованием насадочной колонки (2,0 м *2,5 мм), заполненной 5% ДЭГА (Р) на Chromaton N-super в режиме программирования температуры. В качестве газа-носителя применяли гелий со скоростью потока 30 мл/мин. Идентификацию кислот проводили сравнением относительных времен удерживания их метиловых эфиров по отношению к стандарту (18920 - LAMP).
Качественный состав фенолкарбоновых кислот осуществляли методом тонкослойной хроматографии в системе растворителей: бензол - метанол - уксусная кислота (90 : 16 : 8). В качестве проявителя использовали 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты [17].
Качественный состав флавоноидов осуществляли методом бумажной хроматографии в системах растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5) и 15% уксусная кислота. В качестве проявителей использовали пары аммиака (большинство фенольных соединений) и 1% спиртовой раствор AlCl3 (для обнаружения флавоноидов) [18].
Обсуждение результатов
Для отделения биологически активных соединений различных классов, находящихся в фильтрате в свободном или слабосвязанном с его дисперсной фазой состоянии, проведена последовательная исчерпывающая экстракция фильтрата с различными вариантами применения органических растворителей. По схеме 1 последовательную обработку фильтрата осуществляли петролейным эфиром, смесью хлороформ - этанол (2 : 1), диэтиловым эфиром, этилацетатом и бутанолом. По схеме 2 для последовательной обработки фильтрата после петролейного эфира применяли диэтиловый эфир, затем смесь хлороформ - этанол (2 : 1), и далее, как в схеме 1 [19]. Экстракты, полученные с применением петролейного эфира и диэтилового эфира обозначаются ПЭ экстракт и ДЭ экстракт соответственно.
Суммарно по обеим схемам удается отделить около 56-58% веществ от сухого остатка фильтрата. Однако применение первой схемы позволяет получить больше экстрактивных веществ, переходящих в хлороформ-этанольный экстракт (полярные липиды и сопутствующие им соединения) и ДЭ экстракт (ароматические кислоты, катехины и агликоны флавонолов). Применение второй схемы позволяет получить больше экстрактивных веществ, переходящих в этилацетатный экстракт (эфиры ароматических кислот, а также моногликозиды и частично дигликозиды флавонов, флаванонов и флаванолов) и бутанольный экстракт (полигликозидные формы фенольных соединений). Как видно из данных таблицы 1, максимальное количество экстрактивных веществ содержится в бутанольном экстракте. Следовательно, в свободном и слабосвязанном состоянии в фильтрате находится много веществ, относящихся к полигликозидным формам фенольных соединений.
Анализ ПЭ экстракта с помощью тонкослойной хроматографии позволил выявить присутствие в нем мо-но- и триглицеридов, стеринов и эфиров стеринов или восков. Содержание стеринов и их эфиров составляет
0,29% от сухих веществ фильтрата. С помощью газожидкостной хроматографии определен состав высших жирных кислот петролейного экстракта. Были идентифицированы семь высших жирных кислот: тридекано-вая (С13:0), миристиновая (С14:0), миристолеиновая (С14:1), пентадекановая (С15:0), пальмитиновая (С16:0), геп-тадекановая (С17:0), олеиновая (Ci8:i), две из которых являются мононенасыщенными кислотами.
Для анализа полярных липидов хлороформ-этанольного экстракта из него удалены белковые, углеводные и фенольные вещества, образец был подготовлен по методике [15]. Хроматограмма полученного образца приведена на рисунке 1. Неидентифицированные соединения, согласно примененным проявителям, можно отнести к
гликолипидам или фосфолипидам. Количество гликолипидов, полученных по первой схеме экстракции, составляет 0,1% от сухих веществ фильтрата, по второй - 0,03%. Количество содержащих аминогруппу липидов, полученных по первой схеме экстракции, составляет 0,19% от сухих веществ фильтрата, а по второй схеме - 0,13%. Максимально в свободном или слабосвязанном состоянии в фильтрате содержится 0,1% гликолипидов и 0,19% липидов, содержащих аминогруппу, т.е. 0,09% из них приходится на фосфолипиды.
Поскольку электронный спектр ДЭ экстракта, приведенный на рисунке 2, имеет неразрешенный вид, для анализа экстрактов проведено их фракционирование путем последовательной обработки растворами МаНСО3 и №ОН по методике [5]. Получены фракции, содержащие фенолкарбоновые кислоты (ФК1 и ФК2) и фенолы (Ф1 и Ф2). Как видно на рисунке 2, на спектрах полученных фракций, согласно приведенным максимумам поглощения, содержатся фенолкарбоновые кислоты (во фракциях ФК1 и ФК2) и простые фенолы, часть из которых могут иметь кислородные заместители (такие как ОН, ОСН3) в ядре (в фракциях Ф1 и Ф2). Для определения качественного состава соединений, входящих во фракции ФК1 и ФК2, использована тонкослойная хроматография. Как видно на рисунке 3, проведенная идентификация кислот позволила выявить пять - восемь соединений этого класса, а также четыре неидентифицированных. Количество фенолкарбоновых кислот во фракциях составляет: ФК1 - 32,50%, ФК2 - 24,28% от сухих веществ ДЭ экстракта. Количество простых фенолов во фракциях: Ф1 - 17,50%, Ф2 - 10,00%. Таким образом, суммарное содержание фенолкарбоновых кислот и простых фенолов составляет 50% от сухих веществ диэтилового экстракта.
Электронные спектры этилацетатного экстракта приведены на рисунке 4. Максимумы поглощения 250-270, 310-350 нм могут свидетельствовать о содержании флавонов, 255-265 нм - изофлавонов, и 275-290, 290-330 нм флаванонов в этилацетатных экстрактах. Для разделения соединений этих классов была применена бумажная хроматография. Использованы две системы растворителей бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5) и 15% уксусная кислота. В качестве проявителей использованы пары аммиака для обнаружения фенольных веществ и специфический проявитель - 1% спиртовой раствор А1С13 для обнаружения флавоноидов. Проведенная идентификация, как показано на рисунке 5, позволила выявить, кроме апигенина, ранее найденного в фильтрате, еще восемь соединений, относящихся к классам флаванонов, флавонов и флавонолов. Два соединения не идентифицированы.
Таблица 1. Содержание экстрактивных веществ в объектах исследования
Объекты исследования Содержание экстрактивных веществ, %*
По схеме 1 По схеме 2
Фильтрат 100 100
ПЭ экстракт 5,26 5,26
Хлороформ-этанольный экстракт 10,17 7,22
ДЭ экстракт 14,21 4,33
Этилацетатный экстракт 5,13 19,18
Бутанольный экстракт 23,17 20,39
Всего экстрактивных веществ 58,21 56,38
от сухих веществ фильтрата.
0,2% раствор нин-гидрина в бутаноле
Анилин-фталевый
реактив
20% раствор сульфата аммония
эксп. М- по [14] Отнесение
0,89 0,9 моно- или дигалактозилглицерид
0,45 0,44 дизофосфатидилэтаноламин
0,40
0,24 - не идентифицировано
0,21 - не идентифицировано
А Б А Б А Б
Рис. 1. Хроматограмма полярных липидов хлороформ-этанольного экстракта. Хлороформ-этанольные экстракты: А - полученный по схеме 1; Б - полученный по схеме 2
1 - ^тах, нм = 235, 254, 298; 2 - Хтах, нм = 254, 268, 278, 294
длинаволны: нм
1 - ^тах, нм = 234, 274; 2 - Хтах, нм =236, 282
Рис. 2. Электронные спектры объектов исследования: А - ДЭ экстракты 1 и 2; Б - фракции ФК 1 и 2; В - фракции Ф - 1 и 2
длина волны нм
1 - ^тах, нм = 236, 279; 2 - Хтах, нм = 249, 279
5% спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты
по [17]
Отнесение
0,89
0,72
0,61
0,49
0,32
0,25
0,19
0,15
0,09
0,03
0,70
0,61
0,60
0,52
0,51
0,39
0,23
не идентифицировано
вератровая
ванилиновая сиреневая, и-оксибензойная
п-кумаровая, Р-резорциловая ■/и-оксибензойная протокатеховая галловая
не идентифицировано не идентифицировано не идентифицировано не идентифицировано
А Б
Рис. 3. Хроматограмма ароматических кислот. ДЭ экстракты: А - полученный по схеме 1; Б - полученный по схеме 2.
длина волны,нм
длина волны, нм
Рис. 4. Электронные спектры объектов исследования. А - этилацетатные экстракты 1: X max, 261, 290,
322 нм и 2: X max, 261, 290, 322 нм; Б - бутанольные экстракты 1: X max, 234, 261 нм и 2: X max, 234, 261 нм
NH3 (пары)
1% спиртовый раствор AlCl3
0,93
0,86
0,76
0,6i
0,47
0,29
0,i8
0,07
Rf но [19]
0,88
0,87
0,79
0,59
0,43
0,29
0,28
0,26
0,25
Отнесение
не идентифицировано 4',5?7-триоксифлаванон (нарингенин) 4',5,7-триоксифлавон (апигенин)
4',5,7-триоксифлавонол (кемпферол)
3-метокси-4,5-диоксифлаванон-7-О-
неогесперидозид
кверцетин-3-О-галактозид (гиперин)
3',4',5',5,7-пентаоксифлавонол (мирицетин) 3' ,4' ,5,7,8-пентаоксифлавонол (госсипетин) 3' ,4' ,5,7-тетраоксифлавонол (робинетин) 3',4',5-триоксифлавон-7-О-рутинозид не идентифицировано
А
Б
А
Б
Рис. 5. Хроматограмма этилацетатного экстракта. Этилацетатные экстракты: А - полученный по схеме 1;
Б - полученный по схеме 2
Бутанольный экстракт проанализирован аналогично этилацетатному экстракту. Электронный спектр, приведенный на рисунке 4, имеет максимумы поглощения: 234, 261 нм, которые, согласно литературным данным [20], могут свидетельствовать о содержании гликозидированных флаванонов, например гесперидин-3-О-глюкозида (234, 280, 311 нм). Проведенная бумажная хроматография позволила обнаружить в этом экстракте нарингенин-7-О-неогесперидозид (наренгин) и два неидентифицированных соединения.
В водных остатках, полученных после проведения последовательной экстракции фильтрата органическими растворителями по первой и второй схемам (О1 и О2 соответственно), определено содержание углеводов, фенольных соединений и белка (табл. 2).
Применение второй схемы экстракции фильтрата органическими растворителями позволяет получить в водном остатке большее количество углеводов. Обе схемы экстракции показывают, что большая часть фенольных соединений, находящихся в свободном или слабосвязанном состоянии в фильтрате, определены в полученных ранее экстрактах. Белка в свободном или слабосвязанном состоянии в фильтрате не обнаружено, вероятно, он ассоциирован с дисперсной фазой фильтрата.
Таблица 2. Содержание углеводов, фенольных соединений и белка в объектах исследования
Объект исследования Содержание углеводов, %* Содержание фенольных соединений, %* Содержание белка, %*
Фильтрат 5,55 0,48 0,14
О1 2,77 0,05 -
О2 3,12 0,05 -
* От сухих веществ фильтрата.
Примененный способ разделения находящихся в фильтрате веществ после осаждения ПФК из водного извлечения чаги хлористоводородной кислотой позволил определить, что в свободном или слабосвязанном с его дисперсной фазой состоянии находится 61,38% от сухих веществ фильтрата. В их состав входят биологически активные соединения различных классов - мононенасыщенные высшие жирные кислоты, стерины и их эфиры, фосфолипиды и гликолипиды, фенолкарбоновые кислоты, фенолы и вещества, относящиеся к различным классам флавоноидов.
Выводы
1. Показано, что в коллоидной системе фильтрата, полученного из водного извлечения чаги после осаждения ПФК хлористоводородной кислотой в свободном или слабосвязанном с его дисперсной фазой состоянии, находится 61,38% от сухих веществ фильтрата.
2. Установлено, что в фильтрате в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой фильтрата состоянии находятся биологически активные липиды - миристолеиновая (Сш) и олеиновая (Сі8:і) кислоты, стерины и их эфиры в количестве 0,29%, фосфолипиды и гликолипиды в количестве 0,09 и 0,1% соответственно от сухого остатка.
3. Определено, что в фильтрате в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой фильтрата состоянии находятся биологически активные фенольные соединения различных классов. Установлен их состав.
4. Показано, что в фильтрате в свободном или слабосвязанном с дисперсной фазой фильтрата состоянии находятся углеводы в количестве 3,12%, а белок входит в состав дисперсной фазы фильтрата.
Список литературы
1. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К вопросу о природе и происхождении водорастворимого пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом чага // Биохимия. 1959. Т. 24. №1. С. 67-72.
2. Кузнецова О.Ю. Физико-химические характеристики и биологическая активность водных извлечений и поли-фенолоксикарбонового комплекса чаги: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Казань, 2004. 20 с.
3. Якимов П.А., Булатов П.К., Березина М.К. Препарат «Бин-чага» // Вестник АН СССР. 1957. №4. С. 88-91.
4. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С. Структурная организация и свойства полифенолов чаги // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2005. №1. С. 244-250.
5. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 72-84.
6. Рыжова Г. Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В., Пашинский В.Г., Дычко К.А. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
7. Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин»: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Пятигорск, 2003. 23 с.
8. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
9. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. М., 1981. С. 625-627.
10. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. 11-е изд., доп. М., 1987. 336 с.
11. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М., 1989. 509 с.
12. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Мурри И.К. Методы биохимического исследования растений. М., 1972. 400 с.
13. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Л., 1981. 623 с.
14. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 324 с.
15. Полевой В.В. Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. 192 с.
16. Антипов Л.В. Физические методы контроля сырья и продуктов в мясной промышленности. СПб., 2006. 200 с.
17. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., 1965. 508 с.
18. Хайс И.К., Мацек К. Хроматография на бумаге. М., 1962. 852 с.
19. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 213 с.
20. Клышев Л.К., Бандюкова В.А. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования). Алма-Ата, 1978. 220 с.
Поступило в редакцию 21 августа 2007 г.
