© Коллектив авторов, 2019
Степаненко Р.Н., Львов В.Л., Андреев И.В., Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Мартынов А.И.
в (1^6)-0-глюкан из плодового тела гриба Lentinus edodes: структура и иммунобиологические свойства
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г. Москва, Россия
Многие, если не все, базидиальные грибы, содержат биологически активные полисахариды (Р-глюканы) обладающие иммуномодулирующими свойствами. Большинство исследований биологической активности глюканов было сфокусировано на изучении Р-(1—3)-Э-глюканов. В то же время у высших грибов обнаружен широкий спектр глюканов с различным соотношением и композицией (1—*3)- и (1—6)-Р-гликозидных связей. В этой работе грубый водорастворимый полисахарид, выделенный из плодового тела гриба Lentinus edodes экстракцией горячей водой и преципитацией этанолом, фракционировали на колонке с Sepharose 6B. Была выделена полисахаридная фракции с молекулярной массой 500-2000 кДа. 1H- и 13С-ЯМР-спектры показали, что очищенный полисахарид является разветвленным Р-глюканом, построенный из Р-(1— 6)-связанных остатков D-глюкозы, с боковыми ответвлениями, представленными одним Р-(1—3)-связанным остатком D-глюкозы. Выделенный Р-(1— 6) увеличивал in vitro продукцию фактора некроза опухоли (ФНО)а, интерферона-у (ИФН-у) и интерлейкинов (ИЛ) -1р и не стимулировал синтез ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5 клетками селезенки мышей. Кроме того, Р-(1—6)-глюкан in vitro усиливал созревание дендритных клеток. Он увеличивал экспрессию CD83, CD86 и MHC (major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости) II-антигенов на конечных этапах дифференцировки этих клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что не только Р-(1—3)-глюканы, но и другие глюканы, включая Р-(1— 6)-, могут быть перспективными для дальнейших исследований, в частности как иммуномодулирующие агенты.
Ключевые слова: иммуностимулирующие полисахариды; р-(1—6)^-глюканы высших грибов; ФНОа; дендритные клетки
Статья поступила 10.03.2019. Принята в печать 16.04.2019.
Для цитирования: Степаненко Р.Н., Львов В.Л., Андреев И.В., Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н. А., Мартынов А.И. р (1—6)^-глюкан из плодового тела гриба Lentinus edodes: структура и иммунобиологические свойства. Иммунология. 2019; 40 (4): 13-22. doi: 10.24411/0206-4952-2019-14002
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Степаненко Родион Николаевич -доктор медицинских наук, руководитель лаборатории экспериментальных технологий ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: rstepanenko2009@yandex.ru
Stepanenko R.N., Lvov V.L., Andreev I.V., Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyaeva N.A., Martynov A.I.
P (1^6)-D-glucan from the fruit body of mushroom Lentinus edodes: structure and immunobiological properties
NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115478, Moscow, Russia
Most, if not all, Basidiomycetes mushrooms have biologically active polysaccharides (P-glucan) showing potent immunomodulating properties. The majority of research on biological activities of glucans has focused on P-(1^3)-glucans. At the same time fungi produce a wide variety of glucans with vast differences in proportion and arrangement of their (1^3)- and (1^6)-P-glycosidic linkages. In this study, the crude water-soluble polysaccharide, which was obtained from the fruiting body of Lentinus edodes by hot water extraction and ethanol precipitation, was fractionated by Sepharose 6B column chromatographies. This process resulted purified polysaccharide fraction. The molecular mass of isolated fraction was estimated by gel filtration to be 500-2000 kDa. 1H- and 13C-NMR spectra indicate that purified polysaccharide is a branched P-glucan with a main chain that consists of P-D-(1^6) linked Glcp residues substituted at O-3 by single-units of P-Glcp. Isolated P-(1^6)-glucan increased in vitro production of TNF-a, INF-y and IL-1P but did not stimulated IL-2, IL-4 and IL-5 production by spleen cells of mouse. Furthermore, P-(1^6)-glucan enhanced in vitro maturation of dendritic cells. It increased CD83, CD86 and MHC II antigen expression in
For correspondence
Stepanenko Rodion N. -MD, Head of Laboratory of Experimental Technologies NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia E-mail: rstepanenko2009@yandex.ru
the final stages of differentiation of these cells. Our findings suggest that not only P-(1^3)-glucan, but also other P-glucans inclusive P-(1^6)-glucans should be considered in future research, in particular, as immunomodulatory agents.
Keywords: immunostimulating polysaccharide; mushroom-derived p-(1^6)-D-glucan; TNF-a; dendritic cells
Received 10.03.2019. Accepted 16.04.2019.
For citation: Stepanenko R.N., Lvov V.L., Andreev I.V., Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyaeva N.A., Martynov A.I. P (1^6)-D-glucan from the fruit body of mushroom Lentinus edodes: structure and immunobiological properties. Immunologiya. 2019; 40 (4): 13-22. doi: 10.24411/0206-4952-2019-14002 (in Russian)
Acknowledgements. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Одним из источников биологически активных соединений природного происхождения являются высшие ба-зидиальные грибы. Выделенные из клеточных мембран этих грибов полисахариды - р-Б-глюканы - оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, противо-инфекционное, антидиабетическое, гепатопротектор-ное, гиполипидемическое и антиаллергическое действие [1-5]. При попадании в организм млекопитающих они, взаимодействуя с рецепторами на макрофагах, ней-трофилах, естественных клетках-киллерах и дендритных клетках (ДК), индуцируют развитие реакций врожденного иммунитета [6-8]. Связывание с рецепторами приводит к активации фагоцитоза, образованию активных форм кислорода, усилению микробиологического киллинга и продукции провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) а, интерлей-кинов (ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-12), интерферона-у (ИФН-у), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулиру-ющего фактора (ГМ-КСФ) и ряда других [7, 8]. В настоящее время накоплено много экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о том, что каскад метаболических реакций, вызванных взаимодействием полисахаридов базидиальных грибов с клетками врожденного иммунитета, может оказывать влияние на функционирование различных органов и тканей [1].
Особый интерес к глюканам связан с их способностью оказывать положительный клинический эффект при лечении различных онкологических заболеваний. Установлено, что большинство из них не проявляют прямого цитотоксического воздействия на опухолевые клетки, а их положительное терапевтическое действие обусловлено стимуляцией противоопухолевой активности клеток иммунной системы больного [4, 5, 9, 10].
Молекулы р-Б-глюканов, выделенные из высших грибов, - это длинные цепи, образованные остатками Б-глюкозы, связанными р-(1—^3)- или р-(1—>6)-гликозидными связями. При этом основная цепь может содержать боковые ответвления различной длины, также образованные остатками Б-глюкозы, связанными Р-(1—3) или р-(1—6) связями. р-Б-глюканы различаются длиной цепи, количеством и строением боковых ответвлений, пространственной структурой, растворимостью в воде и физиологическом растворе и т. д. Установлено, что эти факторы в различной степени влияют на иммуностимулирующую активность Р-Б-глюканов.
Так, наиболее выраженный ответ моноцитарных клеток наблюдали при связывании p-D-глюкана с большим молекулярным весом (400-2000 кДа) и сложной пространственной структурой, так как в этом случае в реакцию включается одновременно большое количество рецепторов. В то же время инкубация клеток с короткими фрагментами молекулы этого же глюкана, содержащими менее 10 остатков глюкозы, не приводит к активации клеток. Установлено, что способность моноцитарных клеток связывать p-D-глюканы зависит от пространственной структуры, молекулярного веса, наличия боковых цепей и заряда полисахарида [8, 11-13].
В настоящее время наиболее изучены иммунобиологические свойства р-(1—3)-Э-глюканов с боковыми ответвлениями в положении 6, являющиеся компонентом клеточной стенки съедобных грибов: Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Grifóla frondosa, Saccharomyces cerevisiae и ряда других [14, 15]. Специфическая структура Р-(1—3)-глюканов позволяет им связываться с рецепторами на клетках миелоидного ряда, такими как Dectin-1 и CR3. С рецептором Dectin-1 связываются плохорастворимые в воде P-D-глюканы, которые затем фагоцитируются. Параллельно с фагоцитозом индуцируется синтез провоспа-лительных цитокинов посредством активации тирозин-киназы Syk и транскрипционного фактора. Поглощение P-D-глюканов приводит к преимущественной активации Th1- и ТЪ17-клеток и индуцирует активацию антиген-специфических CD8+-цитотоксичных Т-лимфоцитов. Хорошо растворимые в воде P-D-глюканы связываются CR3-рецепторами на нейтрофилах и естественных клетках-киллерах, таким образом, становится возможна реакция CD3-зависимой клеточной цитотоксичности в отношении Ю3Ъ-опсонизированных опухолевых клеток [15-18].
Наряду с р-(1—3)-Э-глюканами из плодовых тел высших грибов (Pleurotus cornucopiae, Amillariella mellea, Hericium erinaceus и Lentinus edodes) выделены глюканы, в которых основная цепь образована р-(1—>6)-связанными остатками D-глюкозы [18, 19]. Выделенные р-(1-6)-Э-глюканы различаются по молекулярной массе, пространственной организации и структуре боковых цепей. При этом они, как и Р-(1— 3)-Э-глюканы, оказывают влияние на активность клеток врожденного иммунитета. При добавлении в культуру макрофагов
они индуцируют респираторный взрыв и синтез ФНО, ИЛ-ip и ИЛ-10. Р-(1— 6)-Э-глюкан с боковыми цепями Р-(1—3) стимулирует созревание ДК клеток человека и активирует синтез хемокинов СС-типа: CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a) и CCL8 (MCP-2) этими клетками. Эти и ряд других данных свидетельствуют о том, что Р-(1— 6)-Э-глюканы наряду с другими полисахаридами, выделенными из базидиальных грибов, обладают способностью стимулировать реакции врожденного иммунитета, оказывающие положительное влияние при различных патологических процессах в организме человека (инфекции, диабет, онкологические заболевания и т. д.).
Нами выделен Р-(1— 6)-Э-глюкан (ВГЛ) с молекулярной массой 500-2000 кДа из плодового тела гриба Lentinus edodes. Выделенный глюкан - это гомопо-лимер, построенный из Р-(1— 6)-связанных остатков D-глюкозы, с боковыми ответвлениями, представленными одним Р-(1— 3)-связанным остатком D-глюкозы. Добавление выделенного глюкана в культуру клеток селезенки мышей приводит к стимуляции синтеза ФНОа, ИЛ-1Р и ИФН-у, но не ИЛ-2, -4, -5 (табл. 1). Наибольший стимулирующий эффект ВГЛ оказывает на синтез ФНО клетками, прилипающими к пластиковой поверхности. Кроме того, выделенный полисахарид увеличивает продукцию ГМ-КСФ при культивировании с клетками пе-ритонеального экссудата, а при индукции образования ДК костномозгового происхождения в культуре in vitro стимулирует созревание этих клеток на конечных этапах дифференцировки.
Материал и методы Животные
Для экспериментов использовали мышей линии C57BL/6J и гибридов первого поколения (CBA/J х C57BL/6)F1 массой 18-20 г, полученных из питомника «Столбовая». Содержание животных соответствовало санитарно-эпидемиологическим правилам СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Животных без ограничений кормили комбикормом ПК-120 по ГОСТу Р 50258-92 и поили водой по ГОСТу 2874-82. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.
Выделение полисахаридов
Высушенные плодовые тела гриба L. edodes измельчали в лабораторном гомогенизаторе и перемешивали c тройным объемом (по отношению к объему сухих грибов) деионизированной воды в течение 2 ч при 80 °С, затем раствор центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 20 мин и супернатант упаривали на роторном испарителе при температуре 60 °С до 1/10 первоначального объема. Сконцентрированный раствор повторно центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 20 мин и осаждали из него полисахариды, добавляя 96% этило-
вый спирт до выпадения осадка. Осадок осаждали центрифугированием при 12 000 об/мин 10 мин, суперна-тант сливали, а осадок растворяли в деионизированной воде до первоначального объема и центрифугировали при 12 000 об/мин 10 мин и лиофилизировали.
В 30 мл деионизированной воды растворяли 500 мг высушенного препарата, диализовали в мешках для диализа с размером пор 12-14 кДа в течение суток и лио-филизировали (выход 255 мг); 100 мг глюкана перемешивали 24 ч при 37 °С в 10 мл в буферного раствора (0,2 М NaCl, 0,01 TRIS, 0,001M CaCl2, 0,001M MgCl2, 0,01% NaN3), содержащего 1-2 мг протеазы (Protease K, AppliChem). После диализа и лиофилизации получено 67 мг продукта, содержащего 93% углеводов, <1% белков и 6% неидентифицированных компонентов по весу. Содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом [20], используя D-глюкозу в качестве стандарта. Белки определяли по методу, предложенному Бредфорд [21].
Определение уровня цитокинов в культурах клеток селезенки мышей
Для изучения влияния выделенного глюкана на синтез цитокинов клетками мышей C57BL/6 забивали цер-викальным смещением, удаляли селезенки, гомогенези-ровали их в стеклянном гомогенезаторе в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 25 мМ Hepes-бефера. Клеточную суспензию фильтровали через капроновый фильтр и лизировали в ней эритроциты с помощью ли-зирующего раствора 10Х RBC (Lysis Buffer multi-species сatalog Number: 00-4300, eBioscience) в объеме 3 мл в течение 5 мин при комнатной температуре. После обработки лизирующим раствором клеточную суспензию дважды отмывали в культуральной среде, затем разводили ее до концентрации 5-106/мл полной культураль-ной средой - культуральная среда RPMI-1640 с добавлением 25 мМ Hepes-буфера («ПанЭко», кат. № С350), 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки (ЭТС) (HyClon UK Ltd, SH 40007-13), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», кат. № Ф032), 40 мкг/мл гентамицина (ОАО «Биохимик») (полная культуральная среда - ПКС).
Для фракционирования выделенных клеток селезенки на прилипающие и неприлипающие к пластиковой поверхности по 1 мл клеточной суспензии помещали в лунки 24-луночного пластикового планшета, предварительно обработанные ЭТС при 37 °С в течение 1 ч. Клетки культивировали в течение 2 ч (37 °С; 5% СО2), по окончанию культивирования из лунок отбирали пипеткой культуральную жидкость, содержащую неприлипшие клетки. Неприлипшие клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 250g, разводили в 500 мкл ПКС и помещали в свободные лунки планшета. В лунки с прилипшими клетками также добавляли по 500 мкл ПКС.
В лунки, содержащие прилипающие, неприлипаю-щие и нефракционированные клетки, добавляли 500 мкл ПКС, содержащий ВГЛ в концентрации 0,1 мг/мл, в контрольные - аналогичный объем ПКС без глюкана.
Клетки культивировали 24 ч (37 °С; 5% СО2), а затем определяли в супернатантах культур уровень ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФН-у и ФНО с помощью наборов реактивов BD™ CBA Mouse Th1/Th2 Cyokine Kit (Catalog No. 551287), согласно инструкции к наборам.
Определение синтеза гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора клетками перитонеального экссудата мышей
В работе использовали макрофаги от гибридов первого поколения CBA/J х C57BL/6)F1 мышей после дислокации шейных позвонков. Резидентные макрофаги получали путем перитонеального лаважа по 5 мл на мышь среды RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС и 40 мкг/мл гентамицина (Mapichem AG, Швейцария). Клетки пулировали, отмывали центрифугированием и полученную клеточную суспензию разливали в чашки Петри, предварительно обработанные в течение 1 ч ЭТС. Через 2 ч инкубации при 37 °С и 5% СО2 культуральную среду вместе с неприлипшими клетками сливали, адгезировавшие клетки снимали с помощью шпателя и помещали в ПКС. Доводили клеточной средой до концентрации 1-106 клеток/мл и разливали по 1 мл в лунки 24-луночного планшета. В опытные лунки добавляли ВГЛ в концентрации 0,1 мг/мл. Клетки инкубировали 24 ч в СО2-инкубаторе при 37 °С и 5% СО2. После окончания инкубации планшет замораживали и хранили при -20 °С в течение нескольких дней.
Затем планшет размораживали, центрифугировали и в супернатантах опытных и контрольных лунок определяли концентрацию ГМ-КСФ с помощью набора реактивов для количественного определения ГМ-КСФ иммуноферментным методом (Mouse GM-CSF Platinum ELISE, eBioscience).
Получение дендритных клеток
Для получения дендритных клеток (ДК) из трубчатых костей (бедренных и большеберцовых) мышей линии C57BL/6 с помощью шприца вымывали культу-ральной средой клетки костного мозга.
Клеточную суспензию тщательно ресуспендиро-вали и помещали в объеме 15 мл ПКС во флакон 75 см2 (SPL Lifesciences кат. № 70075) в СО2-инкубатор на 24 ч (37 °С; 5% СО2). После культивирования куль-туральную жидкость сливали, клетки, прилипшие ко дну флакона, снимали скребком («Пан Эко» № 90030) и центрифугировали 5 мин при 250g. Полученную клеточную суспензию (25-28 • 106 в мл) разводили в 15 мл в ПКС с добавлением мышиных ростовых факторов: рекомбинантного интерлейкина-4 (ИЛ-4) 10 нг/мл (Invitrogen Gibco PMC0045) и ГМ-КСФ 20 нг/мл (Invitrogen Gibco PMC2015) и разливали во флаконы 75 см2, которые помещали в СО2-инкубатор (37 °С; 5% СО2) на 72 ч. Через 72 ч во флаконы добавляли 15 мл свежей ПКС с тем же количеством ростовых факторов - ИЛ-4 и ГМ-КСФ.
На 8-е сутки после начала культивирования из флаконов сливали культуральную среду, содержащиеся
в ней клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 250g, осадок тщательно ресуспендировали в ПКС и переносили в опытный и контрольный флаконы. В опытный флакон добавляли ВГЛ в ПКС до конечной концентрации 0,1 мг/мл, в контрольный - такой же объем ПКС. Флаконы помещали в СО2-инкубатор на 24 ч (37 °С; 5% СО2).
На следующие сутки культуральную жидкость из каждого флакона, содержащую снятые скребком клетки, центрифугировали 5 мин при 250g. Клеточный осадок ресуспендировали в разводящем буферном растворе (фосфатно-солевой буфер кат. № 6020 «Эко Сервис» с добавлением 0,1% ЭТС и 0,1% МаМ3) и готовили образцы для проточной цитометрии.
Проточная цитометрия
Клетки окрашивали РГГС-, РЕ- и АРС-конъ-югированными моноклональными антителами (МкАт). Были использованы следующие флюоресцеин-меченые МкАт фирмы еВюБаепсе: СБПс-РГГС (кат. № 11-0114), са80-РГГС (кат. № 12-0801-82), СБ83-Р1ТС (кат. № 110831), са86-РЕ (кат. № 11-0862) и СБ МНС II РЕ (кат. № 12-5321). Пробы анализировали на проточном цито-метре ОаШоБ 6 Со1ог/2 (Вектап).
Результаты
Выделение высокомолекулярной фракции полисахарида из плодового тела грибов ЬвпШш ейвйез хроматографией на колонке с сефарозой 6В
Полученные из плодовых тел гриба Ь. ейвйез 20 мг экстракта растворяли в 5 мл 0,15 М №С1 и наносили на колонку с сефарозой 6В (2,6 х 75 см), уравновешенную 0,15 М №С1. Препарат элюировали 0,15 М №С1 при скорости потока 0,5 мл/мин, собирая фракции по 10 мл. После хроматографии определяли содержание глюкана
0,7. 0,6 0,5 0,40,3 0,2 0,1 0
I
III I V
г/ ^
( Ч1 Г
V 1 ' Г " г
Рис. 1. Профили элюции на колонке с сефарозой 6В экстракта полисахаридов плодового тела грибов ЬвпИпш вЗоЗвз (А) и рехроматографии высокомолекулярной фракции (Б) По оси абсцисс - номера фракций; по оси ординат - ОП (оптическая плотность) (490 нм). А - профиль элюции экстракта из плодовых тел гриба Ь. вdodвs; Б - профиль элюции высокомолекулярной фракции (рехроматография); I, II, III, IV- области выхода декстранов с молекулярными массами 2000, 500, 150 и 70 кДа.
Б
А
в пробах фенол-сернокислотным методом. Профиль элюции препарата представлен на рис. 1.
Получены 3 глюкан-содержащие фракции - мажорная в области выхода декстранов с молекулярной массой от 2000 (Blue Dextran 2000) до 500 кДа (декстран, Т500) и 2 минорные - с меньшими молекулярными массами. Повторная хроматография 20 мг мажорной фракции при тех же условиях подтвердила ее гомогенность (см. рис. 1). Эта фракция была собрана, повторно диализована в мешках для диализа с размером пор 12-14 кДа в течение суток, лиофилизирована и использована для дальнейших исследований.
ЯМР-спетроскопия р-(1^6)-Б-глюкан
13С- и Щ-спектры ЯМР (ядерный магнитный резонанс) С13 и Н1 выделенного высокомолекулярного глю-кана были сняты на спектрометрах Avance II 600 b DRX-500 (Bruker) с рабочей частотой для протонов 600 МГц и атомов углерода 150 МГц соответственно. Собирали и обрабатывали данные с помощью программы TopSpin 2/1 (Bruker) с использованием стандартного программного обеспечения. Сигналы 13С- и 'Н-ЯМР-спектров были интерпретированы, согласно литературным данным [22-24]. Отнесение сигналов и анализ корреляций в спектрах ЯМР с использованием двумерных экспериментов с применением методов коррелирующих химические сдвиги протонов между собой (Щ, 'И COSY, Щ, 'H TOCSY, Щ, Щ ROESY) и протонов с атомами углерода (Щ, 13С HMBC и Щ, 13С HMQC) свидетельствует о том, что выделенный полисахарид (далее - ВГЛ) - это P-(1^6)-D-Glcp -цепь, содержащая 10-20% боковых от-
ветвлений, представленных одним р-(1^-3)-связанным остатком D-глюкозы (рис. 2-4).
Иммунобиологические свойства выделенного высокомолекулярного D-глюкана
Исследование иммунобиологических свойств ВГЛ мы начали с изучения его способности влиять на клетки иммунной системы при непосредственном контакте, т. е. в культуре in vitro. В предварительных экспериментах было установлено, что ВГЛ нетоксичен в диапазоне концентраций 1-0,01 мг/мл (не оказывает цитотоксиче-ского эффекта на клетки селезенки при культивировании в течение 24-48 ч).
Известно, что одним из основных характерных свойств глюканов, выделенных из плодовых тел бази-диальных грибов, является способность при контакте с клетками иммунной системы индуцировать синтез различных цитокинов. Поэтому на первом этапе исследования иммунобиологических свойств ВГЛ изучали его способность индуцировать в клетках селезенки мышей синтез различных цитокинов. Для этого 3-105 клеток селезенки интактных мышей линии C57BL/6J (после лизиса эритроцитов) культивировали в СО2-инкубаторе при 37 °С и 5% СО2 в течение 24 ч в присутствии 0,1 мг/мл препарата. Жизнеспособность клеток после выделения и перед началом культивирования составляла 95% (по окрашиванию трипановым синим). Клетки культивировали на 96-луночном планшете по 0,3 мл ПКС в лунке. После окончания культивирования определяли в супернатантах культур клеток концентрацию ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФН-у и ФНО, используя коммер-
~ ю ю ю ю
C-3
C-1
C-5
и
C-2
C-4 I
Щ
C-6a
C-6b
110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 ppm Рис. 2. 13С-ЯМР-спектр ß-(1^6)-D-niK®:aHa
H-6b
5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 Рис. 3. 1Н-ЯМР-спектр ß-(1^6)-D-niK>KaHa
ческие наборы BD Cytometric Bead Array (CBA) фирмы BD Biosciences. В основе использованного метода лежит цитофотометрическое определение уровня цитокинов в супернатантах клеточных культур и сыворотках с помощью МкАт к ним, иммобилизованных на микрогранулах. Вышеуказанный метод позволяет определять концентрацию цитокинов в диапозоне от 20 до 2500 пк/мл. Концентрации цитокинов (пг/мд) в супернатантах культур клеток селезенки, в которые был добавлен ВГЛ, и в контрольных представлены в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что ВГЛ при добавлении в культуру спленоцитов интактных мышей, т. е. при непосредственном контакте с клетками, стимулирует продукцию ИЛ-ip, ФНО и ИФН-у и в то же время он не оказывает влияния на синтез ИЛ-2, -4 и -5.
Известно, что цитокины ИЛ-1Р, ФНО и ИФН-у синтезируются преимущественно клетками моноцит/макрофа-гальной системы иммунитета и, по-видимому, выделенный 1,6-р-глюкан оказывает стимулирующее действие именно на эти клетки. Для подтверждения этого предположения клетки селезенки интактных мышей разделили на прилипающие к пластиковой поверхности (клетки моноцит/макрофагального ряда) и неприлипающие.
Таблица 1. Влияние Р-(1^6)^-глюкана (ВГЛ) на синтез цитокинов клетками селезенки мышей
Цитокин ВГЛ Контроль Р
пг/мл ± m
ИЛ-1Р 197 ± 15 112 ± 11 < 0,05
ИЛ-2 56 ± 12 44 ± 10 > 0,05
ИЛ-4 42 ± 10 55 ± 21 > 0,05
ИЛ-5 74 ± 22 62 ± 16 > 0,05
ИФН-у 453 ± 27 243 ± 35 < 0,05
ФНО 1622±144 376 ± 72 < 0,05
После фракционирования прилипающие и неприлипающие клетки и клетки цельной популяции в течение 24 ч культивировали в присутствии 0,1 мг/мл ВГЛ, после окончания культивирования определяли концентрацию ИЛ-1Р, ФНО и ИФН-у (рис. 5).
Эксперименты по культивированию различных субпопуляций клеток селезенки интактных мышей с ВГЛ показали, что наибольший стимулирующий эффект на синтез цитокинов глюкан оказывает при взаимодействии с прилипающими клетками. Культивирование клеток этой субпопуляции с глюканом увеличило концентрации ФНО в супернатанте культур почти в 4 раза: с 302 до 1184 пг/мл. Кроме того, увеличилась концентрация ИЛ-1Р (с 136 до 248 пк/мл) и ИФН-у (с 88 до 258 пк/мл). В то же время эффект от добавления глю-кана к субпопуляции клеток, не прилипающих к пластику, был значительно слабее. Так, концентрация ФНО в супернатанте культур возросла всего со 113 до 247 пк/мл. Индукция синтеза ИЛ-1Р практически отсутствовала (44 пк/мл - в контроле и 52 пк/мл - в опыте), так же как ИФН-у - 42 пк/мл в контроле и 38 пк/мл в опыте. Таким образом, с большой долей вероятности можно утверж-
Рис. 5. Индукция ВГЛ-синтеза цитокинов различными субпопуляциями клеток селезенки интактных мышей линии С57БЬ/61 По оси ординат - концентрация цитокинов, пг/мл.
Культура ДК, в которую добавляли ВГЛ Культура ДК, в которую не добавляли ВГЛ
Comp-FL1-A:: FL1 INT LOG Comp-FL1-A:: FL1 INT LOG
Рис. 6. Цитограмма экспрессии CD86 в координатах FL1-SS
дать, что мишенями, с которыми взаимодействует ВГЛ, являются клетки моноцит-макрофагального ряда. Данное заключение подтверждается результатами, полученными в экспериментах по культивированию с ВГЛ резидентных макрофагов, выделенных из перитонеальной полости интактных мышей линии С57БЬ/6. Культивирование этих клеток в течение 24 ч с 0,1 мг/мл полисахарида приводило к накоплению в супернатанте культур ГМ-КСФ. Его концентрация в культурах, в которые добавляли глюкан, была в 2,65 раза выше, чем в контрольных (39,0 и 14,7 пг/мл соответственно).
Установлено, что некоторые Р-глюканы грибного происхождения стимулируют созревание ДК [25-27], поэтому в следующей серии экспериментов мы решили выяснить, обладает ли аналогичными свойствами выделенный нами Р-(1^6)-глюкан. Для этого полисахарид в концентрации 0,1 мг/мл добавляли в культуру предшественников ДК на 8-е сутки после начала культивирования прилипающих клеток костного мозга с ИЛ-4 и ГМ-КСФ. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе 24 ч (37 °С; 5% СО2), после окончания культивирования окрашивали МкАт, мечеными флюорохромами к антигенам СБ11е, МНС II, СБ80, СБ83 СВ86 и СВ205, и определяли относительное количество меченых клеток в опыте и в контроле (табл. 2).
Добавление ВГЛ в культуру предшественников ДК увеличило относительное количество клеток, экспрес-сирующих поверхностные антигены, характерные для зрелых клеток. В присутствии глюкана значительно возросла экспрессия маркера созревания СБ83, а также было обнаружено повышение плотности на поверхности ДК костимулирующей молекулы СВ86 (рис. 6), но
Таблица 2. Влияние ВГЛ на экспрессию маркеров дендритных клеток
Таблица 3. Влияние выделенного ВГЛ на концентрацию ци-токинов в культуре дендритных клеток
Маркер ВГЛ, % Контроль, % Р
cdllc 62,6 48,1 < 0,05
MHC II 59,2 43,1 < 0,05
cd80 32,1 35,2 > 0,05
cd83 48,2 28,6 < 0,05
cd86 53,7 31,5 < 0,05
Цитокин Культуры, в которые добавляли ВГЛ Контроль
ИФН-у Не обнаружен Не обнаружен
ИЛ-ф 56,2 пк/мл Не обнаружен
ФНО 1689 пг/мл 224 пк/мл
при этом глюкан не оказывал влияния на экспрессию другой костимулирующей молекулы - CD80.
На следующем этапе исследования влияния ВГЛ на созревание ДК в культуре сравнили концентрацию 3 цитокинов: ИЛ-1Р, ФНО и ИФН-у, синтез которых стимулирует глюкан в культуре клеток селезенки, в культурах ДК. Концентрацию цитокинов определяли методом Cytometric Bead Array (табл. 3).
Обсуждение
Из плодовых тел гриба Lentinus edodes экстракцией при 80 °С деионизированной водой, преципитацией этанолом и фракционированием на хроматографиче-ской колонке с Sepharose CL-6B выделен ВГЛ с молекулярной массой 500-2000 кДа. Выделенный глюкан представляет собой гомополимер, построенный из (1^-6)-связанных остатков P-D-глюкозы с короткими боковыми ответвлениями, представленным одним (1^-3)-связанным остатком P-D-глюкозы.
К настоящему времени из базидиальных грибов выделен ряд ВГЛ, различающихся по молекулярной массе и строению боковых цепей. Так, Lee Jong Seok и соавт. [28] из плодового тела гриба Hericium erinaceus выдели ВГЛ с боковыми Р-(1^3)-цепями с молекулярной массой 13 кДа, который индуцировал у макрофагов респираторный взрыв и стимулировал синтез ИЛ-ip и ФНО. ВГЛ с боковыми цепями, представленными или замещенными в положении О-3 остатком P-D-глюкозы или цепями а^-(1^-6)-галактозы, был выделен из грибов Amillariella mellea [29]. При добавлении в культуру макрофагов клеточной линии RAW264.7 он стимулировал продукцию H2O2, супероксида O2- и гидроксильного ра-
дикала OH-, а также ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-1р. Из грибов Pleurotus citrinopileatus был выделен ВГЛ с Р-(1—^3)-боковыми цепями и молекулярной массой 450 кДа, который при добавлении в культуру предшественников ДК человека стимулировал появление их на поверхности маркеров созревания, таких как cd80, cd86 и HLA-DR. Кроме этого, данный глюкан обладал способностью стимулировать синтез провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-1Р, ИЛ-6 и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а также ряда хемокинов [30]. Из плодового тела грибов Lentinuse edodes был выделен Р-(1— 6)-Э-глюкан с молекулярной массой 577 кДа с боковыми цепями, представленными соединенными в Р-(1— 3)-остатками D-глюкозы [30]. Авторы показали, что данный глюкан регулирует экспрессию MHC II и F4/80 на супрессорных клетках миелоидного происхождения и дозозависимо подавляет их ингибирующее действие на CD4+-Т-клетки. Под воздействием этого глюкана супрессорные клетки дифференцировались в многоядерные макрофаги посредством MyD88-зависимого NF-кВ-сигнального пути. Результаты, полученные при изучении иммунобиологических свойств глюканов, в которых основная цепь образована остатками молекул P-D-глюкозы, соединенными гликозидной связью между 1-м и 6-м атомами углерода, свидетельствуют о том, что они так же, как и Р-(1— 3)-Э-глюканы, активируют реакции врожденного иммунитета посредством структур, получивших название «патоген-ассоциированных молекулярных паттернов» (pathogen-associated molecular patterns -PAMP), которые распознаются образ-распознающим рецептором (pattern-recognition receptors (PRR) на клетках врожденного иммунитета. По-видимому, к этому же типу патогенов природного происхождения относится выделенный нами высокомолекулярный ВГЛ.
При изучении иммунологических свойств ВГЛ установлено, что при совместном культивировании с прилипающими клетками селезенки он стимулирует синтез ФНО, ИЛ-1Р и ИФН-у. Аналогичный эффект, хотя и гораздо менее выраженный, он оказывал и на нефракционирован-ные клетки селезенки (рис. 5). В то же время он не стимулировал синтез ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5 как прилипающими клетками, так и нефракционированными (см. табл. 1). Полученные результаты позволяют утверждать, что при добавлении в культуру клеток селезенки глюкана, его распознают клетки моноцит/макрофагального ряда, что подтверждается его способностью стимулировать продукцию ГМ-КСФ резидентными макрофагами, выделенными из перитонеальной полости интактных мышей.
Характер иммунобиологических свойств ВГЛ позволяет предположить, что он может взаимодействовать с одним из представленных на лимфоцитах рецепторов, распознающих PAMP - PRR. К этим рецепторам относятся RIG-I-подобные рецепторы, Nod-подобные рецепторы, лектины C-типа, Юлл-подобные рецепторы (TLR) и др., расположенные на поверхности и/или внутри клеток врожденной иммунной системы [31]. И, если в отношении Р-(1—3)^-глюканов, выделенных из плодового тела базидиальных грибов, точно установлено,
что они взаимодействуют с рецептором Dectin-1, представленным на макрофагах и ДК, и с рецептором CR3 на нейтрофилах, то в отношении ВГЛ такой ясности нет. E.L. Adams и соавт. [31] и A.S. Palma и соавт. [32] представили результаты, свидетельствующие о том, что Dectin-1 не распознает ВГЛ. Также ß-(1—6)-глюканы не связываются и другим PPR - лактозилцерамидом, входящим в состав клеточных мембран различных видов лейкоцитов, и взаимодействующим с ß-(1—3)-глюканами [33]. Результаты, полученные в последние годы, свидетельствуют о существовании на макрофагах специфического рецептора, распознающего ВГЛ, и это может быть TLR2 [19], с которым не взаимодействуют ß-(1—3)-глюканы. [34]. Эти результаты свидетельствуют о различных механизмах распознавания ß-(1—>6)- и ß-(1—3)-глюканов. Различие в механизмах распознавания структурно различающихся глюканов, естественно, приводит к различию в иммунобиологических эффектах, которые оказывают эти патогены при попадании в организм млекопитающих, что делает целесообразным дальнейшее их изучение при различных патологических процессах, в том числе при онкологических заболеваниях. В пользу перспективности таких исследований говорят данные о большей иммуногенности ВГЛ, чем ß-(1—3)-глюканов, что приводит к подавлению роста злокачественных опухолей у экспериментальных животных. Так, показано наличие обратной корреляции между титрами Ат, индуцированными ВГЛ, и продолжительностью жизни мышей с привитой солидной опухолью EL-4 [35].
Выводы
1. Из плодовых тел гриба Lentinus edodes выделен ß-(1—6)^-глюкан с молекулярной массой 500-2000 кДа, построенный из ß-(1—6)-связанных остатков D-глюкозы с короткими боковыми ответвлениями, представленными одним ß-(1—3)-связанным остатком D-глюкозы. Сходный по структуре ß-(1—6)-Э-глюкан с боковым ответвлением в виде одного остатка D-глюкозы, соединенной с основной цепью ß-(1—3)-гликозидной связью, но с гораздо меньшей молекулярной массой (5,6 кДа), был выделен J. Yan и соавт. [18] из плодового тела грибов Amillariella mellea.
2. При совместном культивировании с прилипающими клетками селезенки выделенный высокомолекулярный ß-(1— 6)-Э-глюкан стимулирует синтез ФНО, ИЛ-ф и ИФН-у. Он также увеличивает продукцию ГМ-КСФ резидентными макрофагами, выделенными из пе-ритонеальной полости интактных мышей, и количество ДК миелоидного происхождения при добавлении в культуру на конечных этапах дифференцировки этих клеток.
3. Можно предположить, что выделенный нами глю-кан, как и сходный с ним по структуре низкомолекулярный глюкан, выделенный J. Yan и соавт. [18], взаимодействует с TLR2 на клетках моноцит-макрофагальной системы, а следовательно, по всем своим характеристикам они являются типичными РАМР.
4. Выделение и изучение иммунобиологических свойств новых ß-глюканов природного происхождения позволяет расширить спектр известных иммуностимулирующих средств; наиболее эффективные из них могут найти применение в клинической практике.
■ Литература
1. Герасименя В.П., Гумаргалиева К.З., Захаров С.В., Миле-вич Т.И. и др. Экстракты базидиальных грибов и их полифункциональная медико-биологическая активность. М. : Ин-т химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, ООО «Инбиофарм»; 2014.
2. Brown G.D., Gordon S. Fungal B-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-315.
3. Friedman M. Mushroom polysaccharides: chemistry and antiobesity, antidiabetes, anticancer, and antibiotic properties in cells, rodents, and humans. Foods. 2016; 5: 80.
4. Meng X., Liang H., Luo L. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on the structural characteristics, antitumor mechanisms and immunomodulating activities. Carbohydr. Res. 2016; 424: 30-41.
5. Wasser S.P. Medicinal mushrooms in human clinical studies. Part I. Anticancer, oncoimmunological, and immunomodulatory activities: a review. Int. J. Med. Mushrooms. 2017; 19 (4): 279-317.
6. Gordon D.B., Gordon S. Fungal B-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-5.
7. Barreto-Bergter E., Figueiredo R.T. Fungal glycans and the innate immune recognition. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4: 145.
8. Camilli G.,Tabouret G., Quintin J. The Complexity of fungal P-glucan in health and disease: effects on the mononuclear phagocyte system. Front. Immunol. 2018; 9: 673.
9. Vannucci L., Krizan J., Sima P., Stakheev D. et al. Immunostimulatory properties and antitumor activities of glucans (review). Int. J. Oncol. 2013; 43: 357-64.
10. Cioanca O., Trifan A., Mircea C., Dragos S. et al. Natural macromolecules with protective and antitumor activity. Anticancer Agents. Med. Chem. 2018: 18 (5): 675-83. doi: org./ 10.2174/187152061866618 0425115029.
11. Mueller A., Raptis J., Rice P.J., Kalbfleisch J.H. et al. The influence of glucan polymer structure and solution conformation on binding to (1—3)-P-D-glucan receptors in human monocyte-like cell line. Glicobiology. 2000; 10 (4): 339-46.
12. Lowe E., Rice P., Ha T., Li C. et al. A (1—3)-P-D-linked heptasaccharide is the unit ligand for glucan pattern recognition receptors on human monocytes. Microbes Infect. 2001; 3 (10): 789-97.
13. Adams E.L., Rice P.J., Graves B., Ensley H.E. et al. Differential high-affinity interaction of Dectin-1 with natural or synthetic glucans is dependent upon primary structure and is influenced by polymer chain length and side-chain branchin. J. Pharm. Exp. Ther. 2008; l (325): 115-23.
14. Dalonso N., Goldman G.H., Gern R.M.M. P-(1-3),(1-6)-Glucans: medicinal activities, characterization, biosynthesis and new horizons. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015; 99 (19): 7893-906. doi: org/10.1007/s00253-015-6849-x.
15. Nakashima A., Yamada K., Iwata O., Sugimoto R. et al. P-Glucan in foods and its physiological functions. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2018; 64 (1): 8-17.
16. Chan G.C., Chan W.K., Sze D.M. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J. Hematol. Oncol. 2009; 2: 25-35.
17. Albeituni S.H., Yan J. The effects of P-glucans on dendritic cells and implications for cancer therapy. Anticancer Agents Med. Chem. 2013; 13 (5): 689-98.
18. Yan J., Han Z., Qu Y., Yao C. et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of a P-glucan derived from the fruiting bodies ofAmillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.
19. Jeff I.B., Yuan X., Sun L., Kassim R.M. et al. Purification and in vitro anti-proliferative effect of novel neutral polysaccharides from Lentinus edodes. Int. J. Biol. Macromol. 2013; 52: 99-106. doi: 10.1016/j. ijbiomac.2012.10.007. Epub 2012 Oct 13.
20. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956; 28: 350-6.
21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54.
22. Luo X., Xu X.Y., Yu M.Y., Yang Z.R. et al. Characterization and immunostimulatory activity of an a-(1^6)-D-glucan from the cultured Armillariella tabescens mycelia. Food Chem. 2008; 111: 357-63.
23. Aguire M.J., Isaacs M., Matsuhiro B., Mendoza L. et al. Characterization of a neutral polysaccharide with antioxidant capacity from red wine. Carbohydr. Res. 2009; 344: 1095-101.
24. Mei-Kuang L., Jing-Ly C., Cha-Yui L., Chia-Chuan. Food Chem. 2010; 118: 349-56.
25. Huang H., Ostroff G.R., Lee C.K., Wang J.P. et al. Distinct patterns of dendritic cell cytokine release stimulated by fungal ß-glucans and tolllike receptor agonists. Infect. Immun. 2009; 77 (5): 1774-81.
26. Masuda Y., Inoue H., Ohta H., Miyake A. et al. Oral administration of soluble ß-glucans extracted from Grifolafrondosa induces systemic antitumor immune response and decreases immunosuppression in tumor-bearing mice. Int. J. Cancer. 2013; 133: 108-20.
27. Minato K.I., Laan L.C., Ohara A., van Die I. Pleurotus citrinopileatus polysaccharide induces activation of human dendritic cells through multiple pathways. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 156-63.
28. Lee J.S., Kyoung M.M., Jae Y.C., Eock K.H. Study of macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharides from the fruiting body of Hericium erinaceus. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19 (9): 951-9.
29. Jingmin Yan, Zhen Han, Yunhe Qu, Ci Yao et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of aß-glucan derived from the fruiting bodies ofAmillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.
30. Wu H., Tao N., Liu X., Li X. et al. Polysaccharide from Lentinus edodes inhibits the immunosuppressive function of myeloid-derived suppressor cells. PLoS One. 2012; 7 (12): e51751.
31. Lee M.S., Kim Y.J. Signaling pathways downstream of pattern recognition receptors and their cross talk. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 447-80.
32. Palma A.S., Feizi T., Zhang Y. et al. Ligands for the beta-glucan receptor, Dectin-1, assigned using «designer» microarrays of oligosaccharide probes (neoglycolipids) generated from glucan polysaccharides. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5771-9.
33. Zimmerman J.W., Lindermuth J., Fish P.A. et al. A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a ß-(1^3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22 014-20.
34. Noss I., Ozment T.R., Graves B.M., Kruppa M.D. et al. Cellular and molecular mechanisms of fungal ß-(l^6)-glucan in macrophages. Innate Immun. 2015; 21 (7): 759-69.
35. Dong H., Dai H., Hu X., Xiong S.D. et al. The (1^6)-ß-glucan moiety represents a cross-reactive epitope of infection-induced malignancy surveillance. J. Immunol. 2014; 192 (3): 1302-12.
■ References
1. Gerasimenya V.P., Gumargalieva K.Z., Zakharov S.V., Mile-vich T.I., Treskova A.V. Extracts of basidiomycetes and their polyfunctional medical-biological activity. Moscow: N.N. Semenov Institute of chemical physics of RAS, "Inbiopharm"; 2014.
2. Brown G.D., Gordon S. Fungal B-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-315.
3. Friedman M. Mushroom polysaccharides: chemistry and antiobesity, antidiabetes, anticancer, and antibiotic properties in cells, rodents, and humans. Foods. 2016; 5: 80.
4. Meng X., Liang H., Luo L. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on the structural characteristics, antitumor mechanisms and immunomodulating activities. Carbohydr. Res. 2016; 424: 30-41.
5. Wasser S.P. Medicinal mushrooms in human clinical studies. Part I. Anticancer, oncoimmunological, and immunomodulatory activities: a review. Int. J. Med. Mushrooms. 2017; 19 (4): 279-317.
6. Gordon D.B., Gordon S. Fungal ß-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-5.
7. Barreto-Bergter E., Figueiredo R.T. Fungal glycans and the innate immune recognition. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4: 145.
8. Camilli G.,Tabouret G., Quintin J. The Complexity of fungal ß-glucan in health and disease: effects on the mononuclear phagocyte system. Front. Immunol. 2018; 9: 673.
9. Vannucci L., Krizan J., Sima P., Stakheev D., et al. Immunostimulatory properties and antitumor activities of glucans (review). Int. J. Oncol. 2013; 43: 357-64.
10. Cioanca O., Trifan A., Mircea C., Dragos S., et al. Natural macromolecules with protective and antitumor activity. Anticancer Agents. Med. Chem. 2018; 18 (5): 675-83. doi: org./ 10.2174/18715 20618666180425115029.
11. Mueller A., Raptis J., Rice P. J., Kalbfleisch J.H., et al. The influence of glucan polymer structure and solution conformation on binding to (1—3)-ß-D-glucan receptors in human monocyte-like cell line. Glicobiology. 2000; 10 (4): 339-46.
12. Lowe E., Rice P., Ha T., Li C., et al. A (1—3)-ß-D-linked heptasaccharide is the unit ligand for glucan pattern recognition receptors on human monocytes. Microbes Infect. 2001; 3 (10): 789-97.
13. Adams E.L., Rice P.J., Graves B., Ensley H.E., et al. Differential high-affinity interaction of Dectin-1 with natural or synthetic glucans is dependent upon primary structure and is influenced by polymer chain length and side-chain branchin. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008; 325 (1): 115-23.
14. Dalonso N., Goldman G.H., Gern R.M.M. ß-(1-3),(1-6)-Glucans: medicinal activities, characterization, biosynthesis and new horizons. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015; 99 (19): 7893-906. doi: org/10.1007/s00253-015-6849-x.
15. Nakashima A., Yamada K., Iwata O., Sugimoto R., et al. ß-Glucan in foods and its physiological functions. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2018; 64 (1): 8-17.
16. Chan G.C., Chan W.K., Sze D.M. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J. Hematol. Oncol. 2009; 2: 25-35.
17. Albeituni S.H., Yan J. The effects of ß-glucans on dendritic cells and implications for cancer therapy. Anticancer Agents Med. Chem. 2013; 13 (5): 689-98.
18. Yan J., Han Z., Qu Y., Yao C., et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of a ß-glucan derived from the fruiting bodies of Amillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.
19. Jeff I.B., Yuan X., Sun L., Kassim R.M., et al. Purification and in vitro anti-proliferative effect of novel neutral polysaccharides from Lentinus edodes. Int. J. Biol. Macromol. 2013; 52: 99-106. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.10.007. Epub 2012 Oct 13.
20. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A., et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956; 28: 350-6.
21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54.
22. Luo X., Xu X.Y., Yu M.Y., Yang Z.R., et al. Characterization and immunostimulatory activity of an a-(1—6)-D-glucan from the cultured Armillariella tabescens mycelia. Food Chem. 2008; 111: 357-63.
23. Aguire M.J., Isaacs M., Matsuhiro B., Mendoza L., et al. Characterization of a neutral polysaccharide with antioxidant capacity from red wine. Carbohydr. Res. 2009; 344: 1095-101.
24. Mei-Kuang L., Jing-Ly C., Cha-Yui L., Chia-Chuan. Food Chem. 2010; 118: 349-56.
25. Huang H., Ostroff G.R., Lee C.K., Wang J.P., et al. Distinct patterns of dendritic cell cytokine release stimulated by fungal ß-glucans and toll-like receptor agonists. Infect. Immun. 2009; 77 (5): 1774-81.
26. Masuda Y., Inoue H., Ohta H., Miyake A., et al. Oral administration of soluble b-glucans extracted from Grifolafrondosa induces systemic antitumor immune response and decreases immunosuppression in tumor-bearing mice. Int. J. Cancer. 2013; 133: 108-20.
27. Minato K.I., Laan L.C., Ohara A., van Die I. Pleurotus citrinopileatus polysaccharide induces activation of human dendritic cells through multiple pathways. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 156-63.
28. Lee J.S., Kyoung M.M., Jae Y.C., Eock K.H. Study of macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharides from the fruiting body of Hericium erinaceus. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19 (9): 951-9.
29. Jingmin Yan, Zhen Han, Yunhe Qu, Ci Yao, et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of aß-glucan derived from the fruiting bodies of Amillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.
30. Wu H., Tao N., Liu X., Li X., et al. Polysaccharide from Lentinus edodes inhibits the immunosuppressive function of myeloid-derived suppressor cells. PLoS One. 2012; 7 (12): e51751.
31. Lee M.S., Kim Y.J. Signaling pathways downstream of pattern recognition receptors and their cross talk. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 447-80.
32. Palma A.S., Feizi T., Zhang Y., et al. Ligands for the beta-glucan receptor, Dectin-1, assigned using «designer» microarrays of oligosaccharide probes (neoglycolipids) generated from glucan polysaccharides. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5771-9.
33. Zimmerman J.W., Lindermuth J., Fish P.A., et al. A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a ß-(1—*3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22 014-20.
34. Noss I., Ozment T.R., Graves B.M., Kruppa M.D., et al. Cellular and molecular mechanisms of fungal ß-(l— 6)-glucan in macrophages. Innate Immun. 2015; 21 (7): 759-69.
35. Dong H., Dai H., Hu X., Xiong S.D., et al. The (1—6)-ß-glucan moiety represents a cross-reactive epitope of infection-induced malignancy surveillance. J Immunol. 2014; 192 (3): 1302-12.