CC BY
0
УДК 615.273:616.379-008.64-092.9:577.1
О. Н. Ринейская 1, Ф. Ф. Лахвич 2, С. В. Глинник 3, Е. М. Ермоленко 4, Е. Н. Галюк 5, К. И. Павлов 6, Д. А. Глинник 7, И. А. Золотарев 8, М. И. Редкина 9, А. И. Ринейский 10, Т. Г. Метелица 11
1 Кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой биоорганической химии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
2Кандидат химических наук, доцент, доцент кафедры биоорганической химии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
3Кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры биоорганической химии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
4Старший преподаватель кафедры биоорганической химии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
5Кандидат химических наук, ведущий лаборант кафедры биоорганической химии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
^Заведующий лабораторией экспериментальной медицины, фармакологии и токсикологии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь 7 Студент лечебного факультета, УО «Белорусский государственный медицинский
университет», г. Минск, Республика Беларусь 8Студент лечебного факультета, УО «Белорусский государственный медицинский
университет», г. Минск, Республика Беларусь 9Студент лечебного факультета, УО «Белорусский государственный медицинский
университет», г. Минск, Республика Беларусь 10Студент лечебного факультета, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь 11 Старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной медицины, фармакологии и токсикологии, УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, Республика Беларусь
ВАЛИДАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО ДОКИНГА
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АФФИННОСТИ РИВАРОКСАБАНА К ГЛЮКОКИНАЗЕ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Ш У1УО НА КРЫСАХ С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ
Изучено влияние Ривароксабана на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальным (аллоксановая модель) диабетом. Установлено, что эндогастральное введение водного раствора Ривароксабана в дозе 300 мг/кг сопровождается нормализацией уровня глюкозы крови экспериментальных животных, что согласуется с результатами молекулярного докинга, в котором Ривароксабан показал высокую аффинность к глюкокиназе.
Ключевые слова: глюкокиназа, молекулярный докинг, Ривароксабан, экспериментальный диабет.
Введение
Глюкокиназа является изоформой гексокиназы (гексокиназа IV) [1] и играет важную роль в гомеостазе глюкозы; регулирует ее метаболизм в инсулинпродуцирующих бета-клетках поджелудочной железы, гепатоцитах и некоторых клетках нервной системы [2]. В отличие от других гексокиназ, глюкокиназа вступает в процессе фосфорилирования глюкозы только после достижения определенной концентрации [3]. Мутации гена глюкокиназы GCK вызывают аутосомно-доминантную гиперинсулинемическую гипогликемию и гипоинсулинемическую гипергликемию у людей [4], что свидетельствует о важной роли глюкокиназы в регуляции углеводного метаболизма. Это создает предпосылки для выбора данного фермента в качестве потенциальной мишени для разработки гипогликемических лекарственных средств (ЛС).
Актуальной проблемой современного здравоохранения является высокое и постоянно растущее количество пациентов с сахарным диабетом (СД), среди которых 90-95 % составляют пациенты с СД 2-го типа [5]. Несмотря на доступность противодиабетических препаратов различных классов, только половина пациентов достигает целевого уровня гликированного гемоглобина.
© Ринейская О. Н., Лахвич Ф. Ф., Глинник С. В., Ермоленко Е. М., Галюк Е. Н., Павлов К. И., Глинник Д. А., Золотарев И. А., Редкина М. И., Ринейский А. И., Метелица Т. Г., 2023
Известно, что у пациентов с СД 2-го типа отмечается заметная задержка секреции инсулина в ранней фазе в ответ на глюкозу [6]. Поэтому влияние на более ранние фазы секреции инсулина путем увеличения чувствительности к глюкозе может быть ценным подходом к решению проблемы [7], так как для оптимизации лечения диабета необходимы новые противодиабетические средства, которые непосредственно воздействуют на зависимый от глюкозы процесс секреции инсулина. На протяжении последних 20 лет проводился поиск малых молекул, являющихся активаторами глюкокиназы [8]. При помощи методов структурного анализа был установлен центр, который отвечает за связывание активаторов глюкокиназы, что приводит к изменению топологии фермента и, в конечном итоге, к увеличению его аффинности к глюкозе, а также увеличению скорости фосфорилирования [9]. Как следствие, стимулируется биосинтез и секреция инсулина, увеличивается поглощение глюкозы печенью, ускоряется ее метаболизм, а также связанные с ним процессы в клетках, экспрессирующих глюкокиназу [10].
Снижение уровня глюкозы в крови под действием активаторов глюкокиназы было установлено в результате исследований на лабораторных животных, а также в рамках клинических испытаний (фазы 1-3) у здоровых волонтеров и пациентов с сахарным диабетом [8, 9, 11]. Это создает предпосылки к поиску новых соединений-кандидатов для разработки лекарственных средств, являющихся активаторами глюкокиназы для лечения пациентов с СД.
На рисунке 1 представлены формула ЛС Дорзаглиатина и структуры потенциальных ЛС-активаторов глюкокиназы [9, 11, 13-15] (в скобках приведены ссылки на работы, в которых содержатся результаты исследования строения и биологической активности соответствующих веществ).
Рисунок 1 - Формулы потенциальных активаторов глюкокиназы (в скобках указаны ссылки на публикации)
Были проведены исследования, которые показали высокую аффинность приведенных выше веществ к аллостерическому центру глюкокиназы. Выявлены аминокислоты, которые играют основную роль в связывании с лигандом [8, 11, 13]. При этом в структуре исследованных активаторов глюкокиназы можно выделить ряд структурных особенностей. Они характеризуются вытянутой структурой, которая обусловлена наличием циклических плоскостных фрагментов, включающих бензольные и гетероароматические ядра. Последние соединяются короткими мостиками, которым соответствуют амидные группы и гетероатомы, вступающие в сопряжение с ароматическими циклами. Это приводит к ограничению возможности вращения в пределах рассматриваемой вытянутой структуры. В целом скелет соединений носит в значительной степени гидрофобный характер. При этом следует отметить наличие фрагментов, которые обеспечивают возможность образования водородных связей с макромолекулой протеина.
При анализе структуры различных активаторов глюкокиназы нами было отмечено их топологическое и функциональное сходство с молекулой Ривароксабана, который используется для лечения и профилактики осложнений заболеваний сердечно-сосудистой системы у пациентов, часть из которых страдает от менее или более выраженного снижения толерантности к глюкозе. При этом показано, что использование Ривароксабана (рисунок 2) у пациентов с СД дает меньше осложнений по сравнению с применением антагонистов витамина К [12].
Анализ литературных данных показал, что ранее не проводилось исследований по влиянию Ривароксабана на уровень глюкозы в крови. При этом в связи с использованием Ривароксабана для купирования некоторых осложнений СД (повышение склонности к тромбозам, диабетические кардиомиопатии и пр.) были проведены исследования фармакокинетики и возможности взаимодействия при совместном использовании Ривароксабана и гипогликимических ЛС [16].
Исходя из вышесказанного изучение влияния Ривароксабана на метаболизм глюкозы является актуальным и практически значимым.
Целью данной работы явилось исследование влияния Ривароксабана на уровень глюкозы крови крыс с экспериментальным диабетом для валидации результатов молекулярного докинга по определению аффинности ривароксабана к глюкокиназе.
Материалы и методы исследования
Исследование было проведено на белых беспородных крысах-самцах массой 230-250 г. Животные содержались в условиях свободного доступа к воде в соответствии с требованиями Санитарных правил и норм 2.1.2.12-18-2006 «Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Доступ к пище (стандартный рацион вивария БПМУ) осуществлялся после введения препаратов (до 12.00 каждого дня эксперимента). Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: группа 1 - чистый контроль, группа 2 - контроль Ривароксабана, группа 3 - крысы с сахарным диабетом (аллоксановая модель), группа 4 - крысы с СД, получающие Ривароксабан.
До начала эксперимента у всех крыс оценивали концентрацию глюкозы в крови при помощи портативного измерителя концентрации глюкозы с полоской электрохимической однократного применения «Сателлит экспресс». Измерение уровня глюкозы в крови у экспериментальных животных производилось путем помещения капли крови из сосудов хвоста крыс на тестовую полоску. Пробы крови от каждого животного получали через разрез кожи на кончике хвоста при локальной анестезии лидокаином. Экспериментальный сахарный диабет создавался с использованием модели СД путем интраперитонеального введения аллоксана в дозе 100 мг/кг однократно. Вызываемая аллоксаном инсулинопения обусловливает состояние экспериментального СД. Известно, что аллоксан ингибирует секрецию инсулина путем селективного связывания с глюкокиназой, которая является сенсором глюкозы для р-клеток поджелудочной железы [17].
О
Рисунок 2 - Структурная формула Ривароксабана
Животные третьей (СД) и четвертой групп (СД + Ривароксабан) получали инъекцию аллоксана в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Контроль уровня глюкозы в крови проводился в течение 10-ти дней ежедневно, начиная с 3-го дня после введения аллоксана. Ривароксабан вводился экспериментальным животным групп 2 и 4 в дозе 300 мг/кг эндогастрально один раз в сутки в течение 14-ти дней. По окончании эксперимента животные умерщвлялись под тиопента-ловым наркозом (5 % раствор тиопентала вводился внутрибрюшинно по 0,3 мл каждой крысе); кровь из сонной артерии собиралась для дальнейших исследований. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 10.0. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (Mean ± sd). Для анализа межгрупповых различий был использован критерий Манна-Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05.
Для молекулярного докинга in silico использовали информацию о трехмерной структуре фермента глюкокиназы (код белка 4RCH [13]), которая получена с сайта Protein Data Bank (https://www.rcsb.org), а также ряд специализированных программ: программный пакет ChemOffice, AutoDock Tools 1.5.7, программа OpenBabelGUI. Для визуализации и анализа полученных комплексов использовалась программа PyMOL, а также онлайн-серверы Protein-Ligand Interaction Profiler (PLIP) (https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) и Protein-Plus (https://proteins.plus).
Создание структурных формул соединений выполнено с помощью пакета программ ChemOffice. AutoDock 4 использовался для подготовки лигандов к стыковке с рецептором, расчета сетки потенциалов и непосредственно лиганд-белковых взаимодействий. При стыковке с целью оптимизации процесса в Autodock использовался генетический алгоритм поиска глобального минимума Ламарка (LGA) c числом прогонов 200, размером популяции 300 для жесткого рецептора и гибкого лиганда. Взаимодействие лиганда и белка (аффинность) оценивалось при помощи характеристик, полученных в результате докинга: энергии связывания и константы ингибирования (Ki). В настоящей работе энергией связывания считали наименьшее значение изменения свободной энергии Гиббса при переходе комплекса лиганд-протеин из несвязанного состояния в связанное. Программа OpenBabelGUI использовалась в качестве конвертера форматов, требуемых AutoDock 4, PLIP и Protein-Plus. Поиск центров связывания, изучение характера взаимодействий лигандов с рецептором производился при помощи онлайн-серверов PLIP и Protein-Plus, а также программы PyMOL (центр связывания рассматривался в пределах 4 ангстрем от лиганда).
Результаты исследования и их обсуждение
В эксперименте in silico нами было показано, что Ривароксабан имеет высокую аффинность к аллостерическому центру глюкокиназы. При этом топология связывания в значительной степени аналогична комплексам изученных ранее активаторов глюкокиназы [18]. Так, минимальное значение энергии связывания Ривароксабана - 9,41 ккал/моль найдено для стыковки в пределах того же кармана (аллостерического центра), который определен методом рентгеноструктурного анализа для комплекса 4RCH и лигандов 1 и 2 [9, 13]; топология комплекса с указанными лигандами (рисунок 3) подтверждена нами in silico (энергия связывания - 7,89 ккал/моль и 8,19 соответственно).
Нами более детально были проанализированы два кластера с наибольшей аффинностью лиганда к протеину (- 9,41 ккал/моль), которые характеризуются близкой топологией связывания.
Данные комплексы были проанализированы с помощью плагинов Protein-Plus, PyMOL и PLIP. Информация о взаимодействиях между атомами лиганда и остатками аминокислот протеина представлена в таблице 1 и на рисунке 4.
N
Рисунок 3 - Структурные формулы лиганда 1 [9] и лиганда 2 [13]
Таблица 1 - Показатели, характеризующие топологию связывания Ривароксабана с аминокислотными остатками аллостерического центра глюкокиназы
Аминокислота Тип взаимодействия Межатомное расстояние, А
Комплекс 1 Комплекс 2
Arg63 Водородная связь - 2,09-3,02*
Arg63 Гидрофобное 3,89 3,89
Pro66 Гидрофобное 3,72 3,59
Ile159 Водородная связь 2,85-3,52 2,89-3,05*
Ile159 Гидрофобное - 3,80
Met210 Галогеновая связь 3,74 3,74
Ile211 Гидрофобное 3,52 -
Tyr214 Гидрофобное 3,40 -
Tyr214 п-стэкинг - 4,28
Val455 Гидрофобное 3,74 -
Ala456 Водородная связь - 3,32-3,87
Ala456 Гидрофобное 3,21 -
Кластер 1
Кластер 2
Рисунок 4 - Комплексы Ривароксабана с протеином 4RCH (PyMOL)
Следует отметить, что во всех проанализированных кластерах для Ривароксабана выделяется взаимодействие хлортиофенового фрагмента с Tyr 214. Это соответствует результатам всех предыдущих исследований по дизайну активаторов ГК различных классов. Так, в различных работах показано сродство к Tyr 214 фрагментов пиридина [7], имидазола [8], пиримидина [9].
Помимо указанного выше взаимодействия с Tyr 214, следует отметить взаимодействие с Arg 63, которое также было подтверждено в исследованиях для других активаторов ГК. При этом, для энтропийно мажорного кластера 2 (включает большее число прогонов в эксперименте по молекулярному докингу в Autodock4) взаимодействие с Arg 63 становится наиболее значимым за счет образования дополнительной водородный связи. Подобные взаимодействия могут существенно менять топологию всего фермента и обеспечивать активацию ГК за счет блокирования каталитически неактивной супероткрытой конформации. Для всех кластеров характерны взаимодействия Рива-роксабана с аминокислотами с углеводородными фрагментами (Ile, Val, Met и др.), что также отмечено для лиганда 1, изученного в работе [4]. При этом уменьшение доли других взаимодействий приводит к ожидаемому уменьшению энергии связывания.
Для водородной связи расстояние - атом-Н - атом-донор электронор электоронов.
Результаты исследования характера взаимодействия Ривароксабана с аллостерическим центром глюкокиназы показывают, что топология комплексов в пределах изученных кластеров соответствует близким суперпозициям, которые легко могут трансформироваться за счет конформа-ционных переходов лиганда. Близость строения комплексов Ривароксабана с аллостерическим центром ГК и аналогичных комплексов для лигандов 1 и 2 [7-9], которые показали биологическую активность на 1-3 стадиях клинических испытаний, позволяют считать Ривароксабан перспективным кандидатом на валидизацию гипогликемической активности в моделях in vivo и в клинических испытаниях.
Для проведения исследования in vivo была выбрана аллоксановая модель сахарного диабета, характер симптоматики которого имеет сходные черты с патологией человека и широко используется в исследованиях по поиску новых гипогликемических ЛС.
Введение аллоксана привело к увеличению уровня глюкозы у экспериментальных животных на третьи сутки. Гликемический профиль экспериментальных крыс в группах контроля 1 и 2 ожидаемо соответствовал показателям здоровых животных (таблица 1). Напротив, в экспериментальной группе с индуцированным сахарным диабетом зафиксирован статически значимый рост уровня глюкозы. При этом три особи были досрочно выведены из эксперимента в результате гибели на фоне экстремальных значений уровня глюкозы. У остальных экспериментальных животных группы 3 повышенный уровень глюкозы наблюдался на протяжении всего эксперимента; динамика изменения носила скачкообразный характер, что соответствует литературным данным об аллоксановом диабете у крыс [17; 19].
Таблица 2 - Уровень глюкозы в крови экспериментальных животных (ммоль/л) сравниваемых групп
Группа животных Уровень глюкозы, ммоль/л, Mean ± sd
1 - чистый контроль 7,38 ± 0,52
2 - контроль введения ривароксабана 7,26 ± 0,46
3 - сахарный диабет 11,23 ± 2,53
4 - сахарный диабет + ривароксабан 7,42 ± 0,66 2)
Показатели уровня глюкозы крови крыс экспериментальной группы 4 и группы чистого контроля 1 не имели статистически значимых различий. Это свидетельствует о влиянии Ривароксабана на процессы, лежащие в основе метаболизма глюкозы при патологии. Отсутствие статистически значимых различий между показателями уровня глюкозы крови крыс групп контроля 1 и 2 косвенно подтверждает наше предположение о селективном связывании ривароксабана с именно гексокиназой IV (глюкокиназа).
Выводы
Результаты молекулярного моделирования показали высокую аффинность Ривароксабана к аллостерическому центру глюкокиназы. Данные эксперимента in silico были валидизированы в эксперименте in vivo, в котором было показано статистически значимое снижение показателей уровня глюкозы крови крыс с аллоксановым диабетом, которым вводился Ривароксабан. Полученные результаты позволяют сделать вывод об участии Ривароксабана в процессе фосфорилирования глюкозы у крыс с участием глюкокиназы через связывание с аллостерическим центром фермента. Это является основанием для проведения в дальнейшем практико-ориентированных медико-биологических исследований по влиянию Ривароксабана на метаболизм глюкозы у человека.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Grossbard, L. Multiple hexokinases of rat tissues: purification and comparison of soluble forms / L. Grossbard, R. T. Schimke // J. Biol. Chem. - 1966. - Vol. 241. - P. 3546-3560.
2. The network of glucokinase-expressing cells in glucose homeostasis and the potential of glucokinase activators for diabetes therapy / F. M. Matschinsky [et al.] // Diabetes. - 2006. - Vol. 55, № 1. - P. 1-12.
3. Agius L. Glucokinase and molecular aspects of liver glycogen metabolism / L. Agius // Biochem. J. -2008. - Vol. 414. - P. 1-18.
1)1 Различия достоверны по сравнению с группой 1 (р < 0,05).
2) Различия достоверны по сравнению с группой 3 (р < 0,05).
4. Gloyn, A. L. Glucokinase (GCK) mutations in hyper- and hypoglycemia: maturity-onset diabetes of the young, permanent neonatal diabetes, and hyperinsulinemia of infancy / A. L. Gloyn // Hum. Mutat. -2003. - Vol. 22, № 5. - P. 353-362.
5. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas tenth edition (2021) [Electronic resource]. -Mode of access: https://diabetesatlas.org/idfawp/resource-files/2021/07/IDF_Atlas_10th_Edition_2021.pdf. -Date of access: 20.05.2023.
6. Effects of type 2 diabetes on insulin secretion, insulin action, glucose effectiveness, and postprandial glucose metabolism. / A. Basu [et al.] // Diabetes Care. - 2009. - Vol. 32. - P. 866-872.
7. Importance of early-phase insulin secretion to intravenous glucose tolerance in subjects with type 2 diabetes mellitus. / S. E. Kahn, [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. - Vol. 86. - P. 5824-5829.
8. Glucokinase as an emerging anti-diabetes target and recent progress in the development of its agonists. / Yixin Ren [et al.] // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. - 2022. - Vol. 37, № 1. - P. 606-615.
9. Structural basis for allosteric regulation of the monomeric allosteric enzyme human glucokinase // K. Kamata [et al.] / Structure. - 2004. - Vol. 12, № 3. - P. 429-438.
10. Massa, M. L. Liver glucokinase: An overview on the regulatory mechanisms of its activity / M. L. Massa, J. J. Gagliardino, F. Francini // IUBMB Life. - 2011. - Vol. 63, № 1. - P. 1-6.
11. Dorzagliatin in drug-naïve patients with type 2 diabetes: a randomized, double-blind, placebo-controlled phase 3 trial. / D. Zhu [et al.] // Nat. Med. - 2022. - Vol. 28. - P. 965-973.
12. Efficacy and safety of rivaroxaban in patients with diabetes and nonvalvular atrial fibrillation: The Rivaroxaban Once-daily, Oral, Direct Factor Xa Inhibition Compared with Vitamin K Antagonism for Prevention of Stroke and Embolism Trial in Atrial Fibrillation (ROCKET AF Trial), American Heart / Sameer Bansilal [et al.] / American Heart Journal. - 2015. - Vol. 170, № 4. - P. 675-682.
13. Discovery of 2-Pyridylureas as Glucokinase Activators. Journal of Medicinal Chemistry / Ronald J. Hinklin [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - Vol. 57 (19). - P. 8180-8186.
14. TMG-123, a novel glucokinase activator, exerts durable effects on hyperglycemia without increasing triglyceride in diabetic animal models / Y. Tsumura [et al.] // PLoS ONE. - 2017. - Vol. 12, № 2. -P. 172-252.
15. Characterization of a novel glucokinase activator in rat and mouse models / M. Lu [et al.] // Plos one. - 2014. - Vol. 9. - № 2. - P. e88431. - doi:10.1371/journal.pone.0088431.
16. Simultaneous determination of Rivaroxaban and Sitagliptin in rat plasma by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetic drug-drug interaction study. / Libin Wang [et al.] // Acta Chromatographics -2022. - Vol. 34, № 4. - P. 430-436. - doi:10.1556/1326.2021.00988
17. Alloxan-induced diabetes, a common model for evaluating the glycemic-control potential of therapeutic compounds and plants extracts in experimental studies / Osasenaga Macdonald Ighodaro [et al.] // Medicina. - 2017. - Vol. 53, № 6. - P. 365-374.
18. Лахвич, Ф. Ф. Исследование in silico аффинности Ривароксабана к глюкокиназе / Ф. Ф. Лахвич, О. Н. Ринейская // Мед. журн. - 2023. - № 2 (84). - С. 62-66. - doi:10.51922/1818-426X.2023.2.62.
19. Lenzen, S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes. / S. Lenzen // Diabetologie - 2008. - Vol. 51. - P. 216-226. doi.org/10.1007/s00125-007-0886-7
Поступила в редакцию 00.00.2023 Е-mail: ryneiskaya@mail.ru; lakhvichtt@gmail.com
V. M. Ryneiskaya, T. T. Lakhvich, S. V. Hlinnik, E. M. Ermolenka, E. M. Galiuk, C. I. Pavlov, D. A. Glinnik, I. A. Zolotarev, M. I. Redkina, A. I. Ryneiski, T. G. Metelitsa
VALIDATION OF MOLECULAR DOCKING RESULTS ON THE DETERMINATION
OF RIVAROXABAN AFFINITY TO GLUCOKINASE IN AN IN VIVO EXPERIMENT IN RATS WITH ALLOXAN-INDUCED DIABETES
The effect of Rivaroxaban on blood glucose level in rats with experimental (alloxan model) diabetes was studied. It was found that endogastric administration of Rivaroxaban aqueous solution at a dose of 300 mg/kg is accompanied by normalization of blood glucose level in experimental animals, which is consistent with the results of molecular docking, in which Rivaroxaban showed high affinity to glucokinase.
Keywords: glucokinase, molecular docking, Rivaroxaban, experimental diabetes.
