CC BY
143
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 1-2, стр 121-124 ©2003, СПбРОРААКИ
Краткие сообщения
СОСТОЯНИЕ КИСЛ0Р0ДЗАВИСИМ0Г0 МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУК0ВИСЦИД030М И ЕГО ДИНАМИКА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ЛЕЧЕНИИ АЗИТР0МИЦИН0М
Власова А.В., Кратнов А.Е.
Ярославская государственная медицинская академия
Резюме. В работе исследованы изменения состояния кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных муковисцидозом (MB). У обследованных пациентов из мокроты чаще высевался Ps. aeruginosae (65,7%). При MB выявлено достоверное, по отношению к контролю, снижение спонтанной активности фермента миелопероксидазы нейтрофилов. Найдена связь развития повторных обострений хронического бронхита при MB в течение 3 месяцев наблюдения с более частой колонизацией дыхательных путей Ps. aeruginosae (50%> 12,5%), снижением образования супероксидного анион-радикала, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и уменьшением уровня малонового диальдегида в плазме крови, что свидетельствует о дефекте микробиоцидности фагоцитов. Выявленное снижение активности миелопероксидазы нейтрофилов устранялось при длительном лечении больных MB азитромицином в субингибирующих концентрациях.
Ключевые слова: муковисцидоз, нейтрофилы, кислородзависимый метаболизм, азитромицин.
Vlasova A.V., Kratnov А.Е.
OXYGEN-DEPENDENT METABOLISM OF NEUTROPHILS IN PATIENTS
WITH CYSTIC FIBROSIS UNDER AZITHROMYCIN TREATMENT
Abstract. Alterations in oxygen-dependent metabolism of neutrophils in patients with cystic fibrosis (CF) have been investigated. The sputum inoculation from the examined patients contained mostly Pseudomonas aeruginosae (65.7%). The significant decrease in spontaneous activity of neutrophil myeloperoxidase was shown. We revealed the association of recurring exacerbations of chronic bronchitis in CF patients during the supervision period (3 months) with more frequent colonization of respiratory tracts with Pseudomonas aeruginosae (50% > 12.5%), as well as with the decrease in superoxide anion production, reduction of myeloperoxidase activity of neutrophils and diminution of malonic dialdehyde levels in plasma. The obtained data testify to the defect of microbicidal activity of phagocytes. The decrease in myeloperxidase activity of neutrophils was eliminated by long-term treatment with Azithromycin in subinhibitory concentrations. (Med.Immunol., 2003, vol.5, N1-2, pp 121-124)
Известно, что главной причиной осложнений МВТР обеспечивает благоприятные условия для
и смертельного исхода у больных муковисцидо- колонизации лёгких Ps. aeruginosae. Результаты
зом (MB), который обусловлен мутацией гена му- исследований последних лет свидетельствуют,
ковисцидозного трансмембранного регуляторно- что азитромицин в субингибирующих концентрата белка (МВТР), является патология дыхатель- циях in vitro инактивирует экзоэнзимы Ps.
ных путей [5,14]. МВТР регулирует вязкость сек- aeruginosae [12, 16]. Накапливаясь в азурофиль-
рета экзокринных желёз и является рецептором ных гранулах нейтрофилов азитромицин, в ответ
эпителия бронхов, участвующим в очищении лёг- на стимуляцию рецепторного аппарата клетки,
ких от синегнойной палочки (Pseudomonas выделяется посредством секреторной дегрануля-
aeruginosae), предотвращая её первичную адгезию ции вместе с основным компонентом этих гранул
на эпителиоциты [18]. Изменение структуры - миелопероксидазой (МПО) [13]. Доказано, что
у больных MB на фоне обострения хронического бронхита, по сравнению с детьми, имеющими по-Адрес для переписки: роки развития лёгких, наблюдается более низкая
150040, г. Ярославль, проспект Октября, д. 28 “А”, активность МПО в нейтрофилах, однако влияние
кв. 28. Кратнов Андрей Евгеньевич азитромицина на активность этого фермента
Кафедра терапии педиатрического факультета у больных MB не изучено [2].
Ярославской государственной медицинской Целью данного исследования была оценка вли-
академии. Дом. тел.: (8-0852) 30-40-84. яния длительного лечения азитромицином в су-
Раб. тел.: (8-0852) 79-29-05. E-mail: duk@incap.ru бингибирующей концентрации на активность ми-
елопероксидазы нейтрофилов у больных муковис-цидозом.
Материалы и методы
Обследовано 18 детей, страдающих муковисци-дозом (мутация гена D F508) с тяжёлым или среднетяжёлым течением заболевания, в возрасте от 7 до16 лет. В исследование включали больных MB, находившихся на стационарном лечении с клиниколабораторными признаками обострения хронического бронхита. Контрольную группу составили 22 практически здоровых ребёнка (средний возраст 12,7±5,2 года) без проявлений хронического бронхита по результатам тщательного клинического обследования. Пациенты MB были поделены на 2-е подгруппы: в первую вошли дети, получавшие общепринятую базисную терапию, вторую составили больные, которым был дополнительно назначен азитромицин (Сумамед, “ПЛИВА”) по 250 мг в сутки через 2 дня в течение 3 месяцев с момента поступления в стационар.
Исследование крови больным MB проводили при поступлении и при выписке из стационара. Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной крови на двойном градиенте плотности фиколл-ве-рографина [4]. Активность мембранной НАДФЧН-оксидазы нейтрофилов и продукцию ими супероксидного анион-радикала оценивали по данным теста восстановления нитросинего тетра-золия (НСТ-тест), который проводился количественным спектрофотометрическим методом по Т.А. Gentle и R.A. Thompson [11]. Для изучения функциональной активности миелопероксидазы в нейтрофилах использовали спектрофотометрический метод по М.З. Саидову и Б.В. Пинегину [8]. В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма фагоцитов применялась взвесь убитых клеток Staphylococcus aureus штамма Р-209 в дозе 1-109/мл. О степени функциональной активности нейтрофилов судили по спонтанным, а о функциональном резерве клеток по стимулированным показателям НСТ-теста и МПО. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу A. Digean и В. Мауег в модификации В. Гашковой и соавторов [3]. Об активности процесса перекисного окисления липидов судили по уровню малонового диальдегида в плазме крови
[1]. Всем больным MB было проведено трёхкратное микробиологическое исследование мокроты.
Результаты и обсуждение
У больных MB из мокроты чаще высевался Ps. aeruginosae (65,7%), в том числе в ассоциации со Staphylococcus aureus (38%) и изолированно (27,7%), реже наблюдался высев ассоциации Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae (33%). При этом у больных с повторным обострением хронического бронхита в течение 3 месяцев наблюдения после выписки из стационара чаще высевался из мокроты Ps. aeruginosae (50%>12,5%), тогда как среди пациентов с ремиссией преобладал высев St. aureus и Str. pneumoniae (37,5%>0%). Была выявлена зависимость возникновения повторного обострения хронического бронхолёгочного процесса при MB от состояния кислородзависимого метаболизма нейтрофилов. Как видно из таблицы 1, у больных MB общей группы, по сравнению с контролем, наблюдалось достоверное снижение спонтанной активности фермента МПО нейтрофилов (р<0,05) на фоне повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов (р<0,05). У пациентов MB с повторным обострением хронического бронхита в течение 3 месяцев наблюдения отмечено дальнейшее достоверное снижение активности МПО в нейтрофилах по данным спонтанного (р<0,05) и индуцированного тестов (р<0,05), по сравнению с больными, вышедшими в ремиссию. Выявленное снижение спонтанной активности и резерва МПО в нейтрофилах коррелировало (г=0,4; р>0,05) с достоверным снижением уровня малонового диальдегида, который не отличался от контроля.
Известно, что основным компонентом антимикробной защиты нейтрофила считается система МПО азурофильных гранул, в то время как роль различных кислородных радикалов в киллинге микроорганизмов вызывает противоречивую интерпретацию [9]. В данном исследовании у больных MB с повторным обострением хронического бронхита обнаружено снижение в нейтрофилах спонтанной и индуцированной активности МПО, участвующей в образовании гипохлорит-аниона, которому принадлежит основная антимикробная функция. Это предполагает у определённой группы больных MB дефект мик-робиоцидной активности нейтрофилов вследствие
Табл. 1. СОСТОЯНИЕ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУК0ВИСЦИД030М В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗВИТИЯ ПОВТОРНОГО ОБОСТРЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО БРОНХИТА В ТЕЧЕНИЕ 3 МЕСЯЦЕВ
Показатель Контроль (п = 22) Общая группа больных (п = 18) Ремиссия (п =12) Повторное обострение (п =6)
Спонтанный НСТ-тест 121,3±65,2 96,2+19,7 97,8±25,8 92,9+12,5
Индуцированный НСТ-тест 141,3±56,9 104,2+37,8 93,7+30,8* 123,0+45,4
Спонтанный МПО 17,4±5,1 10,2+6,5* 11,4+7,3 8,1 ±4,8* **
Индуцированный МПО 18,7±3,0 13,4±6,7 15,5+7,1 9,5+2,7* **
ЦИК 21,0±5,2 58,4±34,1* 54,0+36,4 66,2±33,3*
Малоновый диальдегид 16,9+0,1 71,4+33,1 82,4+26,3* 54,9±39,1**
Примечание: * - р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе;
**- р< 0,05 по сравнению с показателями детей с ремиссией хронического бронхита в течение 3 месяцев.
2003, Т.5, № 1-2
Воспаление у больных муковисцидозом
их негативного кондиционирования. Поэтому были рассмотрены исходные показатели метаболизма ней-трофилов при MB в зависимости от качественного состава микрофлоры, высевавшейся из мокроты в количестве больше 106 КОЕ. Из таблицы 2 видно, что в группе больных с изолированным высевом Ps. aeruginosae, по отношению к контролю (р<0,05) и к ассоциации St. aureus и Str. pneumoniae (р<0,01), показатели спонтанного НСТ-теста нейтрофилов (образование супероксидного анион-радикала) были достоверно ниже, что сопровождалось и более низким уровнем циркулирующих иммунных комплексов, который не отличался от контроля. Выявленное снижение активности мембранной НАДФЧН-окси-дазы нейтрофилов у больных с изолированным высевом Ps. aeruginosae наблюдалось на фоне достоверно более низкой активности МПО, по сравнению с показателями контроля и пациентов, у которых высевались ассоциации Ps. aeruginosae + St. aureus (p<0,05) и St. aureus + Str. pneumoniae (p<0,05). Выявленное снижение активности МПО в нейтрофи-лах у пациентов данной группы сопровождалось более низким уровнем малонового диальдегида, который не отличался от контроля, что свидетельствует о недостаточной активности процесса перекисного окисления липидов, участвующего в повреждении
мембран микробной клетки. Таким образом, у больных МВ наблюдается связь развития повторных обострений хронического бронхита с более частой колонизацией дыхательных путей Рз. aeruginosae, негативным кондиционированием нейтрофилов (снижение образования супероксидного анион-радикала, активности МПО) и уменьшением уровня малонового диальдегида в плазме крови.
Доказано, что Рх. aeruginosae секретирует негативные хемотактические факторы [9], которые, вероятно, и могут обуславливать деактивацию преимущественно системы МПО нейтрофила, сохраняя при этом запас реактивности и даже гиперреактивности фагоцитов [7]. Кроме того, негативное кондиционирование фагоцитов может быть обусловлено совместным участием эластаз Рь\ aeruginosae и нейтрофила, способных модифицировать Бс-фрагмент иммунного комплекса, предотвращая его связывание с Бс-рецептором [10]. Также известно, что Рз. aeruginosae препятствует процессу опсонизации путём выработки мукоидного полисахарида - алгината, который экранирует бактерию от специфических антител и фагоцитов [17]. Производить алгинат способны только мукоидные штаммы Рл\ aeruginosae, образование которых провоцируют кислородные радикалы [15]. С другой стороны Рх. aeruginosae выделяет
Табл. 2. ИСХОДНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВЫСЕВА ИЗ МОКРОТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ В КОЛИЧЕСТВЕ > 106 КОЕ
Показатель Контроль (п = 22) I группа Ps. aeruginosae (n = 5) II группа Ps. aeruginosae + St. aureus (n = 7) III группа Str. pneumoniae + St. aureus (n = 6)
Спонтанный НСТ-тест 121,3+65,2 71,4±5,0Л 94,0+22,5 106,7±11,5 ***
Индуцированный НСТ-тест 141,3+56,9 98,5±12,0 105,8±52,5 104,4±30,4
Спонтанный МПО 17,4+5,1 6,0±0,9Л 11,6±5,6 ** 11,3±6,8***
Индуцированный МПО 18,7±3,0 10,1+0,9л 14,9±6,2 12,9±8,4
ЦИК 21,0±5,2 33,5±19 56,7±43,5 69,8±30,5л
Малоновый диальдегид 16,9±0,1 42,3±25,3 73,3+21,7л 81,9±38,8л
Примечание:л- р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе; **- р< 0,05 между I и II группами,
***- р< 0,05 между I и III группами.
Табл. 3. ДИНАМИКА КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ АЗИТРОМИЦИНОМ БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ
Показатель Контроль (п = 22) Муковисцидоз (п = 18)
Базисная терапия (п = 10) Азитромицин (п = 8)
При поступлении При выписке При поступлении При выписке
Спонтанный НСТ-тест 121,3+65,2 97,8± 20,6 112,7±30,6 85,6±25,2 97,2±8,8
Индуцированный НСТ-тест 141,3+56,9 104,4±41,1 97,2±16,2 94,6±17,6 76,7±15,2
Спонтанный МПО 17,4+5,1 10,7±6,9* 13,7±5,5* 6,8±1,9* 28,7±0,4* **
Индуцированный МПО 18,7+3,0 13,4±6,8 15,3±6 11,3±2,3* 25,9±0,1* **
ЦИК 21,0±5,2 66,3±32,7* 64,7±61,7* 43,0±4,2 10,5±0,7*
Малоновый диальдегид 16,9±0,1 73,5±37,2* 85,1 ±44,1* 63,0±3,9* 89,3±41,1*
Примечание: *- р< 0,05 по сравнению с показателями в контрольной группе; **- р< 0,05 между различными группами лечения.
протеазы, которые могут модифицировать комплексы трансферрин-железо и/или лактоферрин-желе-зо, стимулируя продукцию гидроксил-радикала внутри нейтрофила [9, 10]. Можно предположить, что перекись водорода в нейтрофилах начинает расходоваться на образование гидроксил-радикала в реакциях Фентона и Хабера-Вайса, что может вызывать снижение активности МПО, основным субстратом для которой и является перекись водорода. Поскольку основная антимикробная функция, выполняемая нейтрофилами в организме, принадлежит гипохлорит-аниону, образуемому с участием МПО, а не гидроксил-радикалу, это может препятствовать эффективному киллингу Ps. aeruginosae нейтрофи-лами и обусловливает развитие повторного обострения у больных MB.
Результаты лечения в обеих группах пациентов MB представлены в таблице 3. Исходные показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофи-лов в обеих подгруппах лечения были сопоставимы. У больных MB, дополнительно получавших азитромицин, к моменту выписки из стационара был выявлен достоверный рост активности МПО по данным спонтанного (р<0,005) и индуцированного тестов (р<0,05), как по сравнению с контролем, так и с показателями пациентов, находившихся на базисной терапии. Выявленный рост МПО сопровождался достоверным повышением уровня малонового диальдегида по сравнению с контролем. Известно, что макролиды действуют как си-нергисты кислородзависимых бактерицидных механизмов клетки [6, 9]. Кроме того, в исследованиях in vitro показано, что азитромицин в субингибирующих концентрациях способен снижать продукцию протеаз Ps. aeruginosa, что, вероятно, может приводить к росту активности МПО и образованию гипохлорит-аниона в нейтрофилах, способствуя повышению микробиоцидности фагоцитов [12,16]. Об этом свидетельствует более низкий процент (12%<25%) повторных обострений хронического бронхита у больных, получавших азитромицин, по сравнению с пациентами, находившимися на базисной терапии.
Список литературы
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации СПб: ИКФ. - Фолиант. -2000. -104 с.
2. Власова А.В., Кратнов А.Е., Марушков В.И. Биоцидность нейтрофилов и моноцитов при хроническом бронхите у детей с муковисцидозом и пороками развития лёгких // Медицинская Иммунология. - Т. 4. - №2. - С.219.
3. Гашкова В., Матл И., Кашлик И. Циркулирующие комплексы у больных иммунокомплексными заболеваниями и после трансплантации почек // Чех. Мед. - 1978. - № 2. - С.117-122.
4. Зурочка А.В., Долгушин И.И., Власов А.В. Изучение латексиндуцированной люминолзависимой
хемилюминесценции плазмы крови // Лабораторное дело. - 1989. - №3. - С.32-36.
5. Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю. Муковисцидоз (современные достижения и проблемы). Методические рекомендации - М.: Мед-практика - М. - 2001. - 76 с.
6. Лабро М. Противовоспалительная активность макролидов: новые терапевтические возможности? // Клиническая фармакология и терапия. - 1998. -№7(4). - С.55-62.
7. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о ней-трофиле и макрофаге. - Новосибирск. - 1989. - 344с.
8. Саидов М.З., Пинегин Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопе-роксидазы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. - 1991. - №3. - С.56-59.
9. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука. - 2001. - 231 с.
10. Doring G. Pulmonary aspects of cystic fibrosis: role of inflammation in lung distraction. An international simposium of the Forschungsgemeinschaft des Muk-oviszidose e. V. Held in Munich, on January 21-22,1994. - 1994. -91p.
11. Gentle T.A., Thompson R.A. Neutrophil function tests in clinical immunology // Clinical Immunology A Practical Approach. Eds. Gooi H.G., Chapel H. - New York: Oxford University Press. - 1990. - P. 57-59.
12. Grimwood К., To М., Rabin H.R., Woods D.E. Inhibition of pseudomonas aeruginosa exoenzym expression by subinhibitory antibiotic concentrations / / Antimicr. Agents. Chemother. - 1989. - Vol.33. -P.41-47.
13. Hand W.L., Hand D.L. Characteristics and mechanisms of azitromycin accumulation and efflux in human polimorphonuclear leucocytes // International J. of Antimicrobial Agents. - 2001. - Vol.18. -P.419-425.
14. Konstan M.W., Berger M. Current understanding of the inflammatory process in cystic fibrosis: onset and etiology // Pediatric Pulmonology. - 1997. -Vol.24. - P.137-142.
15. Mathee K., Sternberg C., Ciofu O. Oxigen radical induced phenotipic change from non-alginat producing to alginat-producing from Pseudomonas aeruginosa in biofilms //In Lorenzo V., ed. Pseudomonas ‘97. VI International Congress on Pseudomona: Molecular biology and biotechnology. Madrid, Spain. -1997. -116 p.
16. Molinari G., Guzman C.A., Pesce A., Schito G.C. Inhibition of pseudomonas aeruginosa virulence factors by subinhibitory concentrations of azithromycin and other macrolide antibiotics. // J. Antimicrob. Chemother. - 1993. - Vol.31(5). - P.681-688.
17. Perdersen S.S., Hoiby N., Espersen F., Koch C. Role of alginate in infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis //Thorax. - 1992. -Vol.47. -P.6-13.
18. Pier G.B., Grout М., Zaidi T.S. Cystic fibrosis transmembrane conductanc regulator is an epithelial cell receptor for clearance of Pseudomonas aeruginosa from the lung // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. -Vol.94(22). - P. 12088-12093.
поступила в редакцию 15.10.2002 принята к печати 20.01.2003
