CC BY
214
УДК 549.544-414.6:547.91
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКВАЛЕНА В СЕМЕНАХ НЕКОТОРЫХ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА AMARANTHACEAE
© Л.А. Дейнека , В.И. Дейнека, И.А. Гостищев, В.Н. Сорокопудов, А.А. Сиротин
Белгородский государственный университет, ул. Победы, 85, Белгород,
308015 (Россия) E-mail: deineka@bsu.edu.ru
В работе показано, что использование обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием позволяет при простой пробоподготовке: а) выполнять одновременное определение сквалена и триглицеридов в семенах растений; б) исследовать подлинность препаратов (по методам относительного анализа удерживания и «отпечатков пальцев»). Сопоставлено накопление сквалена в семенах ряда растений семейства амарантовых и установлено, что по уровню накопления сквалена в семенах щирица запрокинутая практически не уступает некоторым культурным сортам амаранта.
Ключевые слова: сквален, триглицериды, обращено-фазовая ВЭЖХ, рефрактометрическое детектирование, определение, установление подлинности, семена растений, Amaranthaceae.
Введение
Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-тетракоза-2,6,10,14,18,22-гексаен) относится к очень важным биологически активным веществам. Это соединение было впервые обнаружено в печени акулы (название сквален происходит от squalus - акула) [1]. Оно содержится также в оливковом, хлопковом и льняном маслах, в масле из зародышей пшеницы, во множестве животных и растительных тканей. Биологическая активность сквалена достаточно разнопланова [2]: прежде всего, как предшественник стероидов он влияет на метаболизм стероидов, что может быть использовано в диетотерапии сердечно-сосудистых заболеваний [3]. Опыты in vitro свидетельствовали о высокой антиоксидантной активности сквалена (по отношению к синглетному кислороду) в кожном покрове и в сетчатке глаз; существует также экспериментальное подтверждение способности сквалена выводить из организма липофильные ксенобиотики. Наконец, противораковый эффект оливкового масла связывают с относительно высоким содержанием в нем именно сквалена [4].
Для определения сквалена в сумме липидов известно использование газожидкостной хроматографии. Однако при этом необходимо предварительное омыление экстрактов тканей и плазмы человека с последующей экстракцией неомыляемых веществ и отделение стероидов при помощи колоночной хроматографии на Al2O3 [5]. При такой предварительной обработке газовая хроматография может быть заменена на обращенно-фазовую жидкостную хроматографию с УФ-детектированием; сообщается то, что при этом удается добиться высокой чувствительности [6], несмотря на отсутствие в молекуле сквалена хромофоров с Xmax >190 нм. Была показана возможность определения сквалена и с использованием рефрактометрического детектирования [7].
Уникальным источником сквалена являются семена растений семейства амарантовые (Amaranthaceae) или масла этих семян. Амарант - одна из древнейших зерновых культур, интерес к которой в настоящее время велик во всем мире благодаря накоплению в семенах высококачественного белка и сквалена. Употребление семян амаранта (или его масла) позволяет существенно (до 50% - в опытах на животных) снизить накопление холестерина в липопротеинах низкой плотности [8]. Однако хорошо известно, что накопление биологически активных веществ зависит (в том числе и в случае амарантов) от условий выращивания. Данная работа посвящена разработке метода определения сквалена без предварительного омыления липидной фракции и использования разработанного метода для исследованию накопления сквалена в семенах некоторых растений (семейства амарантовые), выращенных в условиях Белгородской области.
*Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
В работе использовали жидкостной хроматограф, составленный из насоса высокого давления Altex 110A, крана дозатора Rheodyne 7100 с петлей объемом 20 мкл, рефрактометрического детектора RI-401 (Waters). Хроматограммы регистрировали и обрабатывали ПП Мультихром 1.5 (Ampersand Ltd. 2005). Хроматографическая колонка 250^4 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм. Для приготовления подвижных фаз использовали ацетон (имп., РЕАХИМ) и ацетонитрил (х.ч., компонент-реактив). В качестве стандартного образца использовали сквален (97 %, Alfa Aestar, Lancaster).
Обозначения: Лн - а-линоленовая; Л - линолевая; О - олеиновая, П - пальмитиновая и С - стеариновая кислоты; пример обозначения триглицеридов: Л2О - триглицерид, в котором содержится два радикала ли-нолевой и один - олеиновой кислот.
Семена амарантов и целозий были собраны с растений, выращенных в 2006-2007 гг. в Белгороде, или были предоставлены фермером Л.В. Лагоденко (Белгородская область).
Методика определения сквалена в семенах. Навеску семян (0,20-0,35 г) растирают в фарфоровой ступке с 0,2-0,3 г кварцевого песка, просеянного через сито с диаметром отверстий 0,25 мм до визуальной гомогенности порошка. Полученный порошок переносят в колбу вместимостью 10 см3 и настаивают при периодическом перемешивании в течение 30 мин. После оседания основной части твердой фазы раствор фильтруют через тефлоновый фильтр МФФКГ-3 в фильтрующем патроне и хроматографируют порциями 20 мкл.
Подвижная фаза: в мерную колбу вместимостью 250 мл добавляют 25 мл ацетонитрила и раствор доводят до метки ацетоном при перемешивании. Скорость подачи: 1 мл/мин. Остальные условия см. выше. Для градуировки отклика детектора готовят растворы сквалена в элюенте с концентрацией в диапазоне
0,075^0,200 мг/мл. Полученные растворы хроматографируют, как и исследуемые образцы.
Обсуждение результатов
Жидкостная хроматография широко используется в качестве аналитического метода при фармакопейном анализе многокомпонентных смесей. При этом в фармакопейных статьях имеется раздел, определяющий методы установления подлинности препаратов. В случае использования хроматографических методов этот вопрос решается сопоставлением времени удерживания компонентов разделяемой смеси с временем удерживания стандартных веществ. Это позволяет компенсировать непостоянство времен удерживания веществ при смене хроматографических колонок, заполненных стационарными фазами даже одного и того же производителя, а также вследствие возможных различий в составах подвижных фаз или иных условий хроматографирования (например температуры). Поэтому практически при каждой новой серии измерений необходимо приготовление растворов стандартных образцов (СО), если эти вещества относятся к нестабильных соединениям. При труднодоступности СО возрастает стоимость анализов и время, требуемое на их выполнение.
Недавно разработанный метод относительного анализа удерживания [9] позволяет предложить альтернативный вариант установления подлинности препаратов. В соответствие с этим методом относительное удерживание веществ в координатах lgk(i) vs lgk(A), где сопоставляются логарифмы факторов удерживания, а А -вещество сравнения, является линейной функцией. Для определения аналитического вида такой зависимости измерения проводят в нескольких различных составах подвижной фазы. При этом в принципе, достаточно двух точек, т.е. данных, полученных для двух различных составов подвижных фаз. На рисунке 1 показано удерживание некоторых триглицеридов и сквалена относительно трилинолеата, Л3. Кроме важного момента -линейности, имеется еще одна закономерность - для относительно малополярных веществ полученная прямолинейная зависимость мало изменяется при смене стационарных фаз. На рисунке 1 точки, полученные для одинаковых сорбатов, укладываются на общую прямую линию для двух стационарных фаз различных производителей: Диасфер-110-С18 (БиоХимМак, Москва) и Сепарон-130-С18 SGX (Чехия). Для сквалена, например, получена следующая функциональная зависимость:
lg к (сквален) = -0,0638 + 0,6466 • lg к (Л 3).
Различия в свойствах двух использованных стационарных фаз весьма велики, если в качестве критерия такого различия использовать изменение логарифмов факторов удерживания сорбатов на сопоставляемых фазах (порядка 0,25) для одного и того же элюента.
Рис. 1. Удерживание триглицеридов и сквалена относительно удерживания трилинолеата. Ъ = триолеат (1), линолеат-диолеат (2); дилинолеат-олеат (3); (а-)линоленоат-дилинолеат (4); ди(а-линоленоат)-линолеат (5); сквален (6). 0 - координатная биссектриса. Незаполненные знаки -стационарная фаза Диасфер-110-С18; заполненные знаки: Сепарон-130-С18 ЯвХ
По нашему опыту, эта функциональная зависимость сохранится в течение длительного времени (до потери эффективности) использования колонки. А это позволяет использовать и ретроанализ: в нашем случае были переоценены хроматограммы множества масел (более 300) семян, записанные в течение 5-летнего исследования растительных масел. При этом только в случае масел семян растений семейства ЛтагапЛасвав (в частности, злейшего сорняка нашего региона - щирицы) подтверждено присутствие сквалена. Отметим, что по ходу прямых линий на рисунке 1 можно сделать вывод о том, что пик сквалена может совпадать с пиками триглицеридов, содержащих радикалы триеновых кислот (но при этом всегда существует возможность изменением состава подвижной фазы, чтобы добиться разделения таких пиков). Вероятно, это послужило причиной заблуждения авторов работы [10], которые пришли к выводу о том, что в состав масла семян амаранта входит ди(а-линоленоат)-линолеат, ЬпЬпЬ, причем не только в качестве одного из основных компонентов триглицеридного комплекса, но и единственного триглицерида, содержащего радикалы триеновой кислоты. А на хроматограмме масла амаранта, приведенной в работе [11] по детальному изучению профиля масла амаранта, большой пик пред группой триглицеридов не удостоен внимания. но положение этого пика в относительных координатах (рис. 1) совпадает с линией для сквалена, в то время как сквален в цитируемой работе определяли по сложной многостадийной процедуре с конечным определением методом капиллярной газовой хроматографии.
Следовательно, метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием прост и удобен не только для определения сквалена в экстрактах семян амарантов, но и для одновременного контроля тригли-церидного состава экстрагируемого со скваленом масла. Триглицеридный состав масла легко рассчитывается с использованием инкрементного подхода [12]. При этом масла семян нескольких сортов и видов амарантов (и целозий) легко идентифицируются по хроматографическому профилю (рис. 2-3), поскольку они отличаются специфично высоким содержанием триглицеридов с радикалами пальмитиновой кислоты.
Следовательно, для таких масел возможно применение широко развиваемого в настоящее время в хроматографии метода «отпечатков пальцев», позволяющего по качественному соотношению пиков идентифицировать препараты, обнаруживать их фальсификацию и т.д. Так, например, по хроматограммам, представленным на рисунке 3, можно утверждать следующее:
- масло под названием «Роз-Амарант», приобретенное в киоске (Белгород), специализирующемся на продаже БАД, оказалось трудно отличимым от торговых марок пищевого кукурузного масла;
- амарантовое масло производства одной из частных фирм (Воронеж) действительно содержало и сква-лен и амарантовое масло, но в смеси с маслом типа подсолнечного.
Рис. 2. Хроматограммы масел семян некоторых растений семейства амарантовые. Сорта амаранта:
А - Зеленая сосулька; Б - Сэм;
В - Крепыш; Г - Валентина;
Д - Celosia argentea f. plumosa (агрофирма «АЭЛИТА»),
Е - C. cristata (Сортсемовощ);
Ж - Л. retroflexus
Рис. 3. Хроматографический профиль некоторых масел:
А - экстракт семян амаранта сорта «Кизлярец», Б - масло под названием «Роз-Амарант», В - амарантовое масло частного производства (Воронеж). 1 - сквален, 2 - Л3,
3 - Л2О, 4 - Л2П, 5 - ЛО2,
6 - Л2С + ЛОП, 7 - ЛП2, 8 - О3,
9 - ЛОС + О2П
Поскольку в масле семян амаранта невелико содержание триглицеридов, содержащих радикалы октаде-катриеновых кислот, то выбор состава элюента для определения сквалена на фоне сопутствующих тригице-ридов довольно прост - можно воспользоваться элюентами с небольшой (порядка 10 об.%) добавкой ацетонитрила к ацетону.
По изложенной выше методике сквален экстрагируют из семян ацетоном. Сквален не содержит полярных функциональных групп, поэтому ацетон является достаточно сильным элюентом для экстракции этого углеводорода с любой полярной матрицы. Возможность неполярного удерживания сквалена исходной матрицей также исключается благодаря полной растворимости масла, содержащегося в семенах, в добавляемом ацетоне при выполнении указанного в методике соотношения между массой семян и объемом ацетона. Действительно, как показали исследования, площадь пика сквалена была прямо пропорциональна массе использованных семян с нулевым интерсептом. При увеличении массы семян до 0.450 г получено заметное уменьшение (до 15%) выхода сквалена, что, по всей вероятности, связано с неполной экстракцией высоко насыщенных триглицеридов при увеличении навески семян. Наиболее критичной стадией в методике является способ измельчения семян. При измельчении без добавок кварцевого песка нами было обнаружено уменьшение выхода сквалена на 20-
30%. Растворы сквалена, использовавшиеся для градуировки, оставались стабильными при хранении без особых мер предосторожности (вне прямого доступа солнечного света) в течение по крайней мере 6 ч.
Результаты исследования семян некоторых растений семейства амарантовые, выполненные в данной работе, представлены в таблицах 1-2. Эти данные в среднем соответствуют уровню накопления сквалена в семенах Лmaranthus сг^пШ' Ь., выращенных в Испании [11] и Китае [1]. Наиболее высокое содержание сквалена было найдено для сортов Крепыш и Кизлярец. Отметим, что известно более высокое накопление сквалена в семенах видов Л. hypochondricus (до 0,73%) и Л. ритИи' (до 1,32%) [13], что может быть использовано для селекции новых сортов. В семенах единственного вида амарантов, естественно произрастающего в Белгородском регионе, - щирицы запрокинутой, Л. retroflexus, также найдено довольно высокое содержание сквалена (0,42-0,48%), причем его содержание увеличивается в случае семян щириц с багряной окраской стеблей. Появление таких растений, вероятнее всего, стало следствием широкого использования в декоративном садоводстве Белгорода амарантов с багряной окраской всего растения и естественной гибридизации их с дикорастущими видами.
Триглицеридный состав масел семян амарантов, найденный в настоящей работе, принципиально совпадает с известными литературными данными. Но в масле щирицы доля радикалов линолевой кислоты настолько велика, что хроматографический профиль масла уже нельзя отнести к специфичным. Следовательно, масло семян щирицы напоминает многие линолевые масла (ближе всего - масло семян тыквы) и остается только одна особенность - значительный пик сквалена.
Указанное изменение жирнокислотного состава для вида, характерного для нашей климатической зоны, соответствует известной тенденции к росту ненасыщенности при снижении среднегодовой температуры региона произрастания [14].
Таблица l. Содержание сквалена и масел (масс.%) в семенах растений сем. Amaranthaceae
ю, % G,G2 ± —— % G,4G Celosia Сортовые амаранты (сезон 2GG6 г.) А. retroflexus
crist. arg. МФ Кз В В* Кр С У б з
сквален G,35 G,2G G,64 G,64 G,32 G,34 G,64 G,53 G,4l G,4S G,42
масло l,93 l,33 4,2G S,l4 3,5б н/о l,55 5,S4 5,ll н/о н/о
Crist. - cristata;. arg. - argente: МФ - Магический фотан; Кз - Кизлярец; В - Валентина; Кр - Крепыш; С - Сэм; У -Ультра; ЗС - Зеленая сосулька; * - сезон 2GG1 г. б - с багровыми пятнами; з - зеленая. н/о - не определяли.
Таблица 2. Тригилицеридный и жирокислотный состав масел семян
Celosia Сортовые амаранты Щирица
ю, моль % crist. arg. МФ Кз В Кр С У (з.)
Триацилглицеролы (моль %, ± G.5 %)
Лз б,б S,l S,l 5,l lG,3 4,б 5,4 lG,9 2l,5
лр ll,l ll,9 13,9 l2,S l4,l l3,2 l2,5 l3,3 2l,l
Л2П ll,3 lS,S И,б ^,9 21,6 16,2 l4,3 l9,2 lS,l
Л2С l,9 l,l 4,5 4,4 3,4 4,б 3,9 5,l l,l
ЛO2 S,9 l,3 9,l ll,l l,l ll,9 l2,l S,6 lG,5
ЛОП ^,9 ll,l l2,5 l5,S l2,5 l5,3 l5,G И,б lG,l
ЛОС 3,2 2,l 3,l 2,б 3,G 2,l 3,б 3,S <G,5
ЛП2 S,l S,6 S,S l,l 9,2 1,6 l,S S,5 l^
ЛПС <G,5 <G,5 l,3 3,2 2,б 2,l 2,5 4,2 G,2
O3 4,3 l,4 4,S 5,G 3,G 5,3 6,1 4,3 G,9
O2n 6,1 3,S 5,2 l,5 3,l б,9 6,1 4,2 G,5
O2C 3,б G,9 4,2 1,6 4,G 2,4 2,9 2,l <G,5
On2 3,l 3,б 4,2 3,9 3,G 5,G 4,G 2,9 <G,5
One l,G l,2 l,l l^ 2,3 2,l 3,G G,l <G,5
Жирные кислоты (моль %, ± l.5 %)
Лн <G,5 <G,5 <G,5 <G,5 <G,5 <G,5 <G,5 <G,5 <G,5
Л 43,2 4б,2 44,5 4l,4 4l,S 4G,3 39,5 4S,G 61,1
O 3l,G 29,l 29,2 3l,l 24,l 32,l 33,l 25,3 2G,9
П 2l,S 2^ 2l,2 22,5 22,2 22,5 2l,l 2G,S ll,l
С 3,б 2,2 4,l 4,S 5,l 4,б 5,3 5,5 G,6
Обозначения см. табл. l
Предварительные исследования семян еще одного вида растений семейства Amaranthaceae - гомфрены (Gomphrena), показали, что по триглицеридному составу масло семян этого растения напоминает масло семян амарантов, но ярко выраженного пика сквалена на хроматограмме обнаружено не было.
Выводы
В работе предложена методика определения сквалена в семенах растений с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. Определен уровень накопления сквалена в семенах некоторых растений семейства амарантовые. Показано, что по уровню накопления сквалена в семенах щирица запрокинутая практически не уступает некоторым культурным сортам амаранта.
Список литературы
1. He H.-P., Cai Y., Sun M., Corke H. Extraction and purification of squalene from Amaranthus grain // J. Agric. Food Chem. 2002. V. 50. P. 368-372.
2. Kelly G.S. Squalene and its potential clinical uses // Altern Med Rev. 1999. V. 4. P. 29-36.
3. Применение масла амаранта в диетотерапии сердечно-сосудистых заболеваний / под ред. В.А. Тутельяна. М., 2006. 32 с.
4. Newmark H.L. Squalene, olive oil, and cancer risk: a review and hypothesis // Cancer Epidem. Biomark. Prevent. 1997. V. 6. P. 1101-1103.
5. Liu G.C.K., Ahrens E.H., Jr., Schreibman P.H., Crouse J.R. Measurement of squalene in human tissues and plasma: validation and application // J. Lipid Res. 1976. V. 17. P. 38-45.
6. Spanggord R.J., Sun M., Lim P., Ellis W.Y. Enhancement of an analytical method for the determination of squalene in anthrax vaccine adsorbed formulations // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 42. P. 494-499.
7. Murkovic M., Lechner S., Pietzka A., Bratacos M., Katzogiannos E. Analysis of minor components in olive oil. // J. Bio-chem. Biophys. 2004. V. 61(1-2). P. 155-160.
8. Berger A. et al Cholesterol-lowering properties of amaranth grain and oil in hamsters // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2003. V. 73(1). P. 39-47.
9. Дейнека В.И. Карта хроматографического разделения и инкрементные зависимости в методе относительного анализа удерживания в ВЭЖХ // Журнал физической химии. 2006. Т. 80. №3. С. 511-516.
10. Dhellot J.R., Matouba E., Maloumbi M.G., Nzikou J.M. et al. Extraction, chemical composition and nutrional characterization of vegetable oils: Case of Amaranthus hybridus (var 1 and 2) of Congo Brazzaville // African J. Biotechnol. 2006. V. 5(11). P. 1095-1101.
11. Leon-Camacho M., Garcia-Gonzalez D.L., Aparicio R. A detailed and comprehensive study of amaranth (Amaranthus cru-entus L.) oil fatty profile // Eur. Food Res. Technol. 2001. V. 213. P. 349-355.
12. Дейнека В.И., Староверов В.М., Фофанов Г.М., Балятинская Л.Н. Инкрементный подход при определении состава триглицеридов // Химико-фармацевтический журнал. 2002. Т. 36. №7. С. 44-47.
13. Marcone M.F. First report of the characterization of the threatened plant species Amaranthus pumilus (seabeach amaranth) // J. Agric. Food Chem. 2000. V. 48. P. 378-382.
14. Linder C.R. Adaptive evolution of seed oils in plants: Accounting for the biogeographic distribution of saturated and unsaturated fatty acids in seed oils // Amer. Naturalist. 2000. V. 156. №4. P. 442-458.
Поступило в редакцию 25 февраля 2008 г.
После переработки 2б марта 2008 г.
