CC BY
74
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ • Сектор молодых ученых • № 6 (10) 2008 г.
УДК 612.015
ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА ХИМЕРНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА КАВЕОЛИНА-1- FC
Ю. Ф. ДАРКИНА, К. А. ГЛУХОВА, И. П. БЕЛЕЦКИЙ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского
кафедра биохимии
Получение генетической конструкции Signal pIgplus, предназначенной для экспрессии гибридного/химерного белка кавеолина-1-Fc, изучение экспрессии в трансфицированных клетках и получение его в очищенном в виде - является важнейшей предпосылкой для изучения ассоциированных с ним белков, участвующих в реализации апоптоза.
Белок кавеолин-1 принимает участие в регуляции сигнальных процессов. Показано что, различные белки (эндотелиальная синтаза оксида азота (eNos), протеинкиназа А (PKA), нейрональная синтаза оксида азота (nNos) и др.) связываются с кавеолином-1 [6]. Такие взаимодействия имеют большое значение в проявлении функциональной активности белков, выступая при этом в роли их активаторов.
Кавеолин-1, белок размером 22 кДа, относящийся к семейству кавеолинов [6], является главным структурным белком мембранных кавеол. Экспрессируется в виде двух изоформ: кавеолин-1 а (24кДа) и кавеоли-на-lß (21кДа). Повышенная экспрессия наблюдается в адиопоцитах, эндотелиальных и эпителиальных клетках, фибробластах и клетках гладкой мышечной ткани [6].
Известно, что экспрессия кавеолина-1 снижена или отсутствует в клетках карциномы простаты, яичников, почек и толстой кишки. Для 16 % опухолей молочной железы человека показана мутация кавеоли-на-1 (про132лей), которая приводит к неправильному сворачиванию белка и нарушению процесса транспорта в плазматической мембране [4].
Кавеолин-1 обладает шпилеподобной структурой с N и С-концами, расположенными в цитоплазме [6]. Показано, что С-конец кавеолина-1 пальмитолииро-ван, а N-конец фосфорилирован по тирозину. Однако, большой интерес представляет scaffolding-домен (CSD) кавеолина-1, принимающий участие в белок-белковых взаимодействиях. Было показано, что белки, в составе которых имеются последовательности связывающиеся с кавеолином, способны взаимодействовать с ним [3]. Связывающий домен (Scaffolding-домен) кавеолина играет двойственную роль, действуя и как якорь, удерживающий различные белки внутри кавеол, и как регуляторный элемент, способный либо ингибировать, либо усиливать сигнальную активность белков. Существуют данные о том, что связывание сигнальных молекул с кавеолином приводит к их инактивации. Так было показано, что scaffolding-домен опосредует взаимодействие с а-субъединицей G-белков и тирозиновыми киназами [3]. Это приводит к ингиби-рованию АТФ-азной активности G-белков и снижает самоактивацию тирозиновых киназ. Показано так же, что взаимодействие кавеолина-1 с рецептором фактора роста эндотелиальных клеток (EGFR), PKA инги-бирует активацию этих белков [6].
Кавеолин-1 играет значительную роль в регуляции сигнальных процессов, а наличие большого числа посттрансляционных его модификаций, наводят на мысль о существовании других функциональных свойств ка-веолина-1, отличных от уже описанных.
Цель работы заключалась в получении гибридного человеческого белка кавеолина-1 с использованием плазмидного вектора Signal pIgplus клонированного в культуру клетк почки африканской зеленой мартышки (COS).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Трансформация компетентных клеток плазмид-ным вектором SpIgCav (кодирующего белок каве-олин-1 в единой рамке считывания с Fc фрагментом IgG человека)
Компетентные клетки доставали, размораживали в ледяной бане в течение 15-20 минут, затем добавляли 5-20 мкл раствора трансформируемой ДНК, перемешивали и инкубировали в ледяной бане 30-60 минут. После этого проводили тепловой шок в течение 90 сек при 42°С и охлаждали в ледяной бане 5 минут. Далее к клеткам добавляли 0.6 мл среды 2ЧYT(содержащей 16 г пептона-140, 10г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl), перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Клетки высевали на чашки Петри с агароз-ной средой LB (Luria-Bertani) с селективным антибиотиком и инкубировали при 37°С до появления единичных клонов.
Имунноаффинная хроматография
Очищенный препарат белка получали с помощью имунноаффинной хроматографии на протеин-G сефа-розе [2]. Перед нанесением на колонку в образцы добавляли 200мМ фосфатный буфер pH 7.2-7.4 до 20мМ концентрации. Колонку уравновешивали 10 объемами стартового буфера (20мМ фосфатный буфер pH 7.2-7.4, 150мМ NaCl). Образец наносили на колонку со скоростью 2 мл/мин. После нанесения, колонку промывали 5V стартового буфера. Элюцию проводили 100мМ р-ром глицина pH 2.7. Собирали фракции по 300 мкл. Нейтрализовали добавлением 30мкл 1М Трис-Cl pH 9.0. Фракции анализировали с помощью иммуноблотинга.
Иммуноблотинг
После электрофоретического разделения в 12%-ПААГ (12%-полиакриламидный гель) [1] в денатурирующих условиях проводили электроперенос
ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ ►►►►►
на нитроцеллюлозную мембрану при 130В в течение
1 часа Multiphor II (LKB). Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией мембраны в 2% БСА в течение 1 часа. Мембрану инкубировали с моноклональными анти Cav-антителами в течение
2 часов. После отмывок (3 раза по 10 мин) буфером, содержащим 10мМ Трис-HCl, рН 7.5; 0.1% Tween 20; 0.1М NaCl, мембрану инкубировали 1 час с анти-IgG антителами, конъюгированными с пероксидазой. Окрашивали мембрану при помощи ECLplus набора (Amersham, Англия).
окраска геля с использованием кумаси G-250
После электрофоретического разделения в 12%-ПААГ в денатурирующих условиях гели помещали в ванночку с красителем Кумасси G-250, содержащего: 0.23% G-250; 45% EtOH; 10% CH3COOH и нагревали в течение 10-15 минут. После этого отмывали гели от избытка красителя несколькими сменами дистиллированной воды.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для образования нативной третьичной структуры кавеолина-1 требуется множество посттрансляционных модификаций, поэтому для получения функционально активного рекомбинантного белка кавеоли-на-1 использовали плазмидный вектор Signal pIgplus (6341 bp). Данный вектор предназначен для экспрессии химерного белка кавеолин-1 - Fс-фрагмент IgG человека в эукариотических клетках. Наличие Fс-фрагмента позволяет использовать иммуноаффин-ную хроматографию на протеин-G сефарозе для очистки рекомбинантного белка.
Раннее в лаборатории была получена конструкция, предназначенная для экспрессии гибридного белка кавеолина-1 - Fс-фрагмент IgG человека (SpIgCav). Данными конструкциями трансформировали компетентные клетки E.coli. Очистку плазмидной ДНК проводили по методу Birnboim&Doly (1979). Чистоту полученной ДНК оценивали с помощью электрофоретического разделения в 0.8% агарозном геле. Количество выделенной плазмидной ДНК составило 200 мкг/30 мл ночной культуры.
После трансфекции полученным вектором клеток COS проводился анализ уровня экспрессии реком-бинантного белка в среде культивирования и в клеточных фракциях: растворимой или нерастворимой в 1% тритоне Х-100.
Рис. 1. Электрофореграмма плазмидной ДНК (0.8 % агарозный гель)
Рис. 2. Анализ экспрессии белка кавеолина-1-Рс (50кДа).
1 - нерастворимая фракция; 2 - растворимая фракция;
3 - среда культивирования (окраска кроличьими анти-кавеолин1 антителами)
Кавеолин-1^с выделяли из клеточной фракции, растворимой в 1 % Тритоне Х-100, т. к., выделение белка из фракции нерастворимой в 1% Тритоне Х-100, где содержится основная доля белка, требует дополнительных затрат, а в среде для культивирования уровень его чрезвычайно низкий (рис. 2).
После иммуноаффиной хроматографии на про-теин-С сефарозе фракции наиболее богатые белком (5, 6 фракции кавеолин-1- Fс) при покраске Кумасси С-250 или специфическими антителами выглядят следующим образом:
Рис. 3. Окраска 1. - Кумаси G-250 и 2. - специфическими антителами (кроличьи анти-кавеолин-1 антитела).
В результате проделанной работы был получен чистый препарат белка кавеолин-1^с. Выход конечного препарата белка составляет 6мкг/40Ч106 клеток. количество и качество очищенного белка позволяет использовать его в дальнейшей работе по поиску белков, взаимодействующих с кавеолином-1.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гааль Э., Медьеши Г.,Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. С. 448.
2. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С. 358.
3. Alex W. Cohen, Robert Hnasko, William Schubert, Michael P. Lisanti. Role of Caveolae and Caveolins in Health and Disease // Physiol Rev. 2004. Vol. 84. P. 13411379.
4. Lee H., Park D.S., Razani B. et al. Caveolin-1 Mutations (P132L and Null) and the Pathogenesis of Breast Cancer // American Society for Investigative Pathology. 2002. № 4. P. 1357-1369.
_ИЗВЕСТИЯ ПГПУ • Сектор молодых ученых - № 6 (10) 2008 г._
5. Couet J., Li Sh., Okamoto T. Et al. Identification of Pep- 6. Krajewska W. M., Maslowska I. Caveolins: structure and tide and Protein Ligands for the Caveoline-scaffolding Do- function in signal transduction // Cell mol. biol. 2004. №9.
main // Biological Chemistry. 1997. № 10. P. 6525-6533. P. 195-220.
УДК 621.367:5.02.7
Физико-химичЕскиЕ методы снижения агрессивности отработанных электролитов путем перевода СЯ (VI) в СЯ (III)
С. и. ЕЛАНЁВА
Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского кафедра химии и теории и методики преподавания химии
Приведены сравнительные данные по технологическим схемам глубокой очистки хромсодержащих сточных вод гальванического производства от Сг (VI) с применением реагентного, электрохимического, флотационного, мембранного, ионообменного методов. Определена дальнейшая перспектива развития данной области.
Многообразие производств, огромное число хи- ний. В случае с органическими восстановителями это
связано с дефицитностью, высокой стоимостью реагентов и необходимостью очистки сточных от избытка реагентов; фосфином - токсичностью газообразного восстановителя; водородом - высокой стоимостью катализатора. Кроме того, осуществление последних двух процессов связано с дополнительной стадией получения восстановителя.
В качестве реагентов-восстановителей большее применение получили натриевые соли сернистой кислоты, в частности, сульфит натрия Ыа2^О3 [2]. Процесс осуществляется в кислой среде при 20 °С, обычно в присутствии молибдата натрия Ыа2Мо04. Реакция восстановления хрома в данном случае протекает по схеме:
ь 3 БСИг + 8Н+ ^ 2Сг3+ + 3С + 4НС.
мических продуктов, применяемых и получаемых в технологических процессах, приводит к образованию большого количества загрязненных сточных вод. Потому остро стоит проблема их очистки от наиболее опасных веществ. Одним из самых токсичных компонентов гальванического производства является Сг, ПДК которого не превышает 0,1 мг/дм3 по Сг (III) и 0,05 мг/дм3 по Сг (VI) [17].
К настоящему времени разработано огромное количество методов очистки сточных вод от Сг (VI). Как правило, технологическая схема очистки хромсодержащих сточных вод от Сг (VI) включает стадию восстановления Сг (VI) до Сг (III) обработкой стоков химическими реагентами или электрохимическими методами с последующим осаждением Сг (III) в виде гидроксида и отстаивание. Естественно, наиболее перспективными из предложенных методов являются те, которые обеспечивают достаточное восстановление шестивалентного хрома для возврата очищенных стоков в оборотную систему промышленного водоснабжения при минимальных экономических затратах.
С экономической точки зрения наиболее выгодным представляется реагентный метод.
Известны способы переведения Сг (VI) в Сг (III) путем взаимодействия соединений хрома с соляной кислотой в присутствии органических восстановителей - глюкозы, формалина, спиртов, альдегидов [1, 3]. Возможно восстановление шестивалентного хрома и неорганическими восстановителями в присутствии катализатора. Так, описано взаимодействие дихромата натрия с соляной кислотой в присутствии катализатора хлорида меди и восстановителя - фос-финсодержащего газа [3]. Восстановление Сг (VI) до Сг (III) идет по реакции:
4Ыа2Сг2С1 + 3РН 3 + 32НС1 ^ ^ 8МаС! + 3Н3РСА + 8СгС13 + 16Н2С.
Предложено также в качестве восстановителя использовать водород, а в качестве катализатора - платиновую чернь [4].
В настоящее время данные способы не вышли за пределы лабораторных и полупромышленных испыта-
Сг2Сз а 2
Однако этот способ дает только 62-66 %-ную степень очистки. Кроме того, длительность процесса составляет 2-7 ч. Лёгкая окисляемость восстановителя в процессе хранения затрудняет его правильную дозировку и вызывает повышенный расход в сравнении с теоретически необходимым в 2,5 и более раз. В качестве восстановителей применяются также гидросульфит ЫаИ503, пиросульфит Ыа252О}, дитионит натрия Ыа2Б2О4. Возможно восстановление дихромата щелочного металла в растворе древесного угля в избытке серной кислоты при 115-120 °С. При использовании активированного угля в количестве 200-300 г/л процесс ведут при нормальной температуре [5]. Описано восстановление хрома (VI) в кислой среде (рН < 2) древесными опилками [17]:
Cr2O7
+ 7H 2O.
+ 14Н + + 6ё ^ 2Сг3+
При рН 3-7 протекает процесс адсорбции Сг (VI), вероятно, связанный, с реакцией поликонденсации:
пС гСб~ +2(и " 1)Н + = СгпС3п+12~ + (п - 1)Н 2С.
Практически полное восстановление Сг (VI) достигается при расходе опилок 10 г на дм3 раствора дихромата за 1 ч при рН = 0 (остаточная концентрация Сг (VI) в растворе составляет 0,02-7,57 мг/дм3), за сутки и более - при рН 1-3 (остаточная концентрация Сг (VI) 1,3-29,5 мг/дм3 соответственно увеличению
