CC BY
165. А.М. Рахманов, А.В. Акулов, В.М. Апатенко и др.; под ред. В.П.Шишкова и др. Патологоанатоми-ческая диагностика болезней крупного рогатого скота. М.: Агропромиздат, 1987. 399 с.
6. L. Joubert, C. Mackowiak. La fievre aphteuse. V 1-3. Lyon, 1968.
7. Б.В. Боев, В.М. 1уленкин, А.В. Семенов. Система моделей и компьютерных программ для оперативного анализа и прогноза эпизоотий // Вет. па-
тол. 2004. № 4 (11). С. 73-83.
8. К.Н. Груздев, Т.З. Байбиков, В.Н. Герасимов и др. Эпизоотическая ситуация по ящуру типа Азия-1 в России в 2005 году и анализ эффективности мер борьбы / Труды Федерального центра охраны здоровья животных (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). Т. 4. Владимир, 2006. (в печати).
УДК 619:616.98:578.835.2:616-076 Н.Е. Камалова
ЗНАЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В БОРЬБЕ С ЯЩУРОМ
До настоящего времени ящур является мировой проблемой, о чем свидетельствуют ежегодные данные Международного эпизоотического бюро по фактам вспышек ящура во многих странах мира [10]. Его опасность обусловлена высокой кон-тагиозностью, изменчивостью, генетическим разнообразием возбудителя, множественностью путей передачи инфекции, узкой специфичностью приобретенного иммунитета, ограничивающегося рамками определенного иммунологического серо-типа и способностью вируса поражать разнообразные виды животных [8]. Ситуацию осложняют бессимптомные формы течения болезни, длительное вирусоноситель-ство, даже среди высокоиммунных животных, а также целый ряд встречающихся клинически сходных болезней вирусной этиологии [3].
Экономический ущерб при ящуре измеряется гибелью животных, потерями от вынужденного убоя больных животных, уничтожения контаминированной продукции, снижения продуктивности зараженных животных, затратами на вакцинопро-филактику, карантинированием и другими различными ограничениями, ветеринарно-санитарными мерами, направленными на ликвидацию вспышек заболевания.
Особую важность в борьбе и профилактике ящура приобретают вопросы быстрой и точной диагностики. В зависимости от конкретных условий диагностика любого инфекционного заболевания осуществляется в двух направлениях. В основе первого, именуемого "прямой" диагностикой, лежат методы выделения и идентификации этиологического фактора. Вторым направлением, именуемым "ретроспектив-
ной" диагностикой, являются методы выявления специфических антител как следствие реакции организма на внедрение патогенного агента (серодиагностика) и метод выделения возбудителя из органов и тканей вирусоносителя [2].
В настоящее время исследователи многих стран стремятся к внедрению в практику как более чувствительных, так и более специфичных лабораторных методов, в которых предусматривается автоматизированный учет результатов.
В лабораторной диагностике ящура иммуноферментный анализ (ИФА) и по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) имеют преимущество перед другими иммунохи-мическими реакциями. Быстрое внедрение в России ИФА для осуществления серомо-ниторинга логически предусматривает его неоспоримое применение и для выявления антигена вируса ящура в патматериале, мясопродуктах и других объектах.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является сравнительно новым методом, базирующимся на использовании антител, ко-нъюгированных различными ферментами, и по многим параметрам превосходит традиционные методы иммунодиагностки [9].Особого внимания заслуживает его высокая чувствительность и специфичность, экспрессность, объективность учета результатов. В настоящее время этот метод рекомендован Всемирной справочной лабораторией МЭБ по ящуру (Пербрайт, Великобритания).
В 1990 г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» Ж.А. Шаж-ко и соавт. был разработан диагностический набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА, в состав которого входят все необходимые для постановки анализа
специфические и неспецифические компоненты.
В 1999 году была изготовлена и испытана серия таких наборов. Наборы с положительным результатом прошли во ВНИИЗЖ лабораторную и межинститутскую апробации.
Наборы можно применять вместо или наряду с реакцией связывания комплемента (РСК) и биопробой на первичной культуре клеток (СП). Недостатком РСК является низкая чувствительность, а недостатком биопробы — необходимость особых условий при работе с живым возбудителем, в то время как в ИФА исследования проводятся с инактивированным антигеном, а чувствительность метода выше, чем РСК.
В период с 1998 года по настоящее время с помощью наборов исследовались материалы, поступающие в лабораторию диагностики ящура и других везикулярных болезней ФГУ «ВНИИЗЖ» для установления диагноза на ящур. Полученные результаты сопоставимы с результатами биопробы.
В течение 2000-2005 гг. в лабораторию на исследование для выявления и идентификации вируса ящура поступило 45 проб патматериала и более 1000 проб мяса. Патологический материал поступал из различных регионов РФ, стран СНГ и других государств. В результате лабораторных исследований в 16 пробах было выявлено наличие антигена/ генома вируса ящура типа О, в трех — типа А, в 14 — типа Азия-1. В ряде случаев из-за малого или некачественного патматериала типирование было произведено только с помощью имму-ноферментного анализа и/или ПЦР [4]. На основании полученных данных нами была предложена новая схема выявления и идентификации антигена вируса ящура, которая стала основой при разработке Методических указаний [5]. В этом документе предусматривается и подробно описывается использование для выявления и идентификации вируса ящура комплекса диагностических методов, наиболее чувствительных и экспрессных (ИФА, РСК и ПЦР).
Основная причина вспышек ящура в России — занос вируса из соседних неблагополучных государств. В течение последних 12 лет (1995-2006 гг.), ящур в России был зарегистрирован во время или после эпизоотий в Китае (в 1995 г. — в Московской обл., в 2000 г. — в Приморском крае, в 2004-2005 гг. — в Амурской обл., в 2005 г. — в Хабаровском, Приморском краях и в 2006 г. — в Амурской и Читинской облас-
тях). Это обстоятельство диктует необходимость осуществления профилактической иммунизации животных против ящура, в первую очередь в пограничных регионах Дальнего Востока, Сибири, а также Северного Кавказа.
В связи с вышеизложенным другим важным направлением в профилактике ящура и при ликвидации эпизоотии является контроль за вакцинацией сельскохозяйственного поголовья. По рекомендациям МЭБ, проведение иммуномониторинга при массовых обследованиях должно осуществляться с помощью ИФА, в частности его жидкофазного блокирующего варианта [7] или в последнее время также используемого твердофазного конкурентного варианта. В случае получения сомнительных результатов исследования предусмотрено осуществлять с помощью реакции микронейтрализации (РМН).
Наиболее подходящим, на наш взгляд, для эпизоотологического мониторинга при ящуре является комплексное использование на первом этапе непрямого жид-кофазного блокирующего двойного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа (ЖБ ИФА), с помощью «Набора для определения противоящурных антител в сыворотках крови сельскохозяйственных животных в ИФА», разработанного в ФГУ «ВНИИЗЖ».
На втором этапе исследований применение метода 3ABC-ELISA Института экспериментальной зоопрофилактики (Бре-шия, Италия), (E.Broixi, M.Amadori et al., 1993), с помощью 3ABC-ELISA набора, производства фирмы Bommeli Diagnostics (Швейцария) или 3A-ELISA — набора, разработанного в ФГУ ВНИИЗЖ (Щербаков А.В. и соавт., 2003 г.). ЖБ ИФА позволяет выявлять противоящурные постинфекционные и поствакцинальные антитела и определять их типовую принадлежность. Метод ЗАВС-ELISA основан на использовании моноклональных антител, полученных против неструктурного ЗА-FM-DV протеина, для улавливания рекомби-нантного 3АВС полипептида, экспресси-рованного в E.coli. Он выявляет антитела независимо от их типовой принадлежности к неструктурным белкам вируса, которые образуются в организме животного при инфицировании вирусом ящура и поэтому представляется наиболее подходящим и перспективным для дифференцирования животных, переболевших от вакцинированных. Сочетанное применение двух вариантов ИФА позволяет выявлять в сыво-
ротках крови животных наличие противо-ящурных антител, их типовую принадлежность и дифференцировать постинфекционные антитела от поствакцинальных [1].
Этот метод был использован при ликвидации вспышки ящура типа Азия-1 в Амурской области в 2005 г. с целью контроля над эпизоотической ситуацией в соседних с очагом районах, где проводили обследование животных для выявления возможных серопозитивных особей в отношении ящура типа Азия-1. Ранее в области весь скот был привит противоящур-ной моновалентной вакциной типа О. Всего было исследовано 847 проб сывороток крови от сельскохозяйственных восприимчивых к ящуру животных на наличие про-тивоящурных антител к типу Азия-1. Пробы были отобраны из 14 районов, главным образом, сопредельных с Китаем и близлежащих к Свободненскому району, где возникла вспышка ящура. Из всех исследуемых проб 97,9% были отрицательными в жидкофазном блокирующем (ЖФБ) ИФА с антигеном вируса ящура Азия-1. Положительные или сомнительные пробы, составившие 2,1% от общего количества исследованных проб, вторично были тестированы на наличие постинфекционных антител в ЗАВС-ELISA с набором Bommeli Diagnostics (Швейцария) и только одна проба показала сомнительный результат (остальные были отрицательными). Кроме того, все сомнительные пробы также были исследованы в РМН для определения про-тивоящурных антител и в ИФА на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с диагностическими наборами Cidit-est (Нидерланды). В двух пробах сыворотки крови КРС выявлены постинфекционные антитела. Ветеринарными специалис-
Результаты серомониторинга в буф
тами были клинически обследованы все животные, пробы сывороток крови которых дали положительные или сомнительные результаты. Однако результаты этих обследований были отрицательными. Вероятно, 2,1% проб дали в ИФА неспецифическую реакцию, что вполне допустимо при массовых исследованиях.
В связи с тем, что закавказские страны Азербайджан, Армения и Грузия, которые длительное время являлись регионами, неблагополучными по ящуру, и откуда возбудитель может попасть на территорию юга России, в 1999-2003 гг. для них была разработана программа по буферной зоне Закавказья. В этот период проведена большая работа по исследованию около 10 тысяч проб сывороток крови от животных из этих стран на наличие антител к вирусу ящура типов А, О, Азия-1.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
Как видно из данных таблицы 1, процент иммунных животных в Закавказском регионе был невысоким, в среднем, в пределах 50-60% к ящуру типов А, О, еще ниже к типу Азия-1 (от 28,4 до 58,8%). Исключением являются показатели процента иммунных животных по Азербайджану (99,9%) за 2003 год, что, вероятно, связано с неблагополучной эпизоотической обстановкой в этой стране.
Данные исследований периодически представлялись в МЭБ, в Европейскую комиссию ФАО по борьбе с ящуром [6].
Важным моментом испытания набора была оценка иммунного фона у животных при анализе профилактических мероприятий, проведенных в Приморском, Хабаровском краях и в Еврейской автономной области. При исследовании 890 проб сыворо-
Таблица 1
юй зоне Закавказья в 2000 и 2003 гг.
№№ п/п Страна Год Вид жив. Всего исследовано проб Положительные в ЖФБ ИФА (кол-во/%) к типам
А О Азия-1
1. Азербайджан 2000 КРС 766 388/50,6 372/48,6 285/37,2
МРС 322 122/37,9 101/31,4 116/36
2003 КРС 1433 727/50,7 816/56,9 1432/99,9
2. Армения 2000 КРС 504 343/68,2 322/63,9 н/и
МРС 538 338/62,8 263/48,9 н/и
2003 КРС 1285 684/53,2 908/70,6 755/58,8
3. Грузия 2000 КРС 816 417/51,1 414/50,7 232/28,4
МРС 94 38/40,4 37/39,4 20/21,3
2003 КРС 1544 872/56,4 949/61,5 722/46,6
Таблица 2
Результаты исследования проб сывороток крови от с/х животных, отобранных в различных районах Приморского края
№№ п/п Наименование районов Общее кол-во иссл. проб % положительных проб
1. Пожарский 48 н/им.
2. Кировский 51 100
3. Дальнереченский 57 80
4. Октябрьский 110 84
5. Хорольский 40 68
6. Спасский 130 90
7. Ханкайский 110 82
8. Уссурийский 95 95
9. Хасанский 54 48
10 Лазовский 50 100
11. Пограничный 81 70
12 Черниговский 10 н/им.
Примечание: н/им. — животных невакцинировали. ток крови от КРС, отобранных в разных районах Приморского края, граничащих с Китаем, с помощью ЖФБ ИФА установлены различные уровни положительных проб (табл. 2).
Как видно из данных таблицы 2, в районах Приморского края, где проводилась профилактическая вакцинация КРС и МРС, процент иммунных к вирусу ящура типа О животных колебался в пределах 48-100%, в зависимости от времени, прошедшего между вакцинацией и отбором сывороток крови. Наличие антител у животных, где значения были 70% и ниже, наблюдалось в том случае, когда этот интервал превышал 6 месяцев. В таких районах, как Хасанский (48%), Хорольский (68%) и Пограничный (70%) — вакцинация была проведена за 9 месяцев до отбора проб.
Подобные результаты получены и при исследовании около 2000 проб сывороток крови от животных из Амурской области, Хабаровского края и из Еврейской автономной области.
Заключение Особую важность в борьбе с ящуром и его профилактике приобретают вопросы быстрой и точной идентификации возбудителя. Разработан комплекс методов для выявления антигена вируса ящура и его идентификации. Рекомендуется проведение серомониторинга в угрожаемых зонах и при ликвидации ящура осуществлять комплексно с помощью ЖФБ ИФА на наличие вирусспецифических антител с последующей дифференциацией постинфекционных антител от поствакцинальных в ЗАВС^КА.
РЕЗЮМЕ
Разработан комплекс методов для выявления антигена вируса ящура и его идентификации. Рекомендуется проведение серомониторинга в угрожаемых зонах и при ликвидации ящура осуществлять комплексно с помощью ЖФБ ИФА на наличие вирусспецифических антител с последующей дифференциацией в 3АВС -ELISA постинфекционных антител от поствакцинальных.
SUMMARY
A reliable combination of methods for detection of FMD virus antigen and its identification was developed. It is recommended to carry out seromonitoring in zones under threat and during FMD eradication campaigns using a liquid-phase blocking ELISA for the detection of virus specific antibodies and further differentiation between post-infectious and post-vaccinal antibodies by 3ABC-ELISA.
Литература
1. Н.Е. Камалова, Т.А.Фомина, А. Щекотова Ком-плесное исследование двух вариантов ИФА для эпизоотологического мониторинга при ящуре // Роль вет. науки в разв. жив-ва: матер. междун. научно-произв. конференции. Алматы, 2000. С. 115-116.
2. Ж.А. Шажко. Направления совершенствования лабораторной диагностики заболевания, протекающих с везикулярным синдромом // Акт.пробл. вет.вирусол. Наука производству. Владимир, 1987.
Ч. 2. C. 41-44.
3. Ж.А. Шажко. Обеспечение методических основ современных схем лабораторной диагностики ящура и других везикулярных болезней // Соврем. аспекты вет. патол. ж-ных: матер. конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. Владимир, 1998. C. 23-31.
4. А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчикова, В.В. Дры-гин, А.А. Гусев, под ред. А.А. Гусева, А.Н. Панина. Методические указания по индикации генома и
штаммовой дифференциации вируса ящура методом полимеразной цепной реакции и секвени-рования гена Vp // Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом ПЦР Владимир, 1998. C. 31-41.
5. Сост. А.А. 1усев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ. М., 2002. 31 с.
6. Fomina Т.А., Zakharov \.М., Gusev А.А. [e.a.] / Results of seromonitoring in FMD buffer zone in the CIS countries // Europ. Commiss. Control FMD: Rep. Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. Boro-
vets, Bulgaria, 2000. Rome, 2000. P. 126-130.
7. Hamblin C., Barnet I.T.R.& Crowther J.R. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I.Development and method of ELISA // Immunol. Methods 1986. V 93. P. 115-121.
8. Hedger R.S. Foot-and-mouthe disease Ames, Jowa, 1981. P. 87-96.
9. Kitching R.P., Rendle R., Ferris N.P. Rapid correlation between field isolates and vaccine strains of foot-and-mooth disease virus // Vaccine. 1988. V 6, № 5. P. 403-408.
10. OIE Disease Information. V. 13-18, №№ 1-52.
УДК 619:578.835.2:616-076 М.В. Жильцова
ИЗУЧЕНИЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1, ВЫДЕЛЕННЫХ В РОССИИ ВО ВРЕМЯ ВСПЫШЕК В 2005-2006 гг.
RSK (кожа кролика) и ВНК-21 (почка сирийского хомячка).
Изоляты репродуцировали в пластиковых культуральных матрасах объемом 50 см3. Для культивирования вируса использовали питательные среды Игла, 0,5% ГЛА (гидролизат лактальбумина) на растворе Хенкса, ПСС (питательная среда синтетическая) и ПСП (питательная среда полусинтетическая). Во флаконы со сформировавшимся монослоем вносили свежую порцию поддерживающей среды без сыворотки и 10% афтозную вирусную суспензию в объеме 0,5 см3. Вирус культивировали при 37° С до появления признаков ци-топатического действия (ЦПД). Проводили до 6 пассажей. При отсутствии ЦПД в течение 72-96 часов делали «слепые» пассажи. Адаптированным считали вирус, вызывающий 90-100% ЦПД в течение 18-24 часов.
Адаптированные материалы вируса ящура титровали с использованием пер-вично-трипсинизированной культуры клеток СП (почка поросенка). Титр вируса выражали в ^ТЦД50/мл и расчитывали по Риду и Менчу [4, 6].
Специфический антиген вируса ящура выявляли в непрямом двойном сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием диагностического набора, выпускаемого ФГУ «ВНИИЗЖ», согласно «Временному наставлению по выявлению антигена вируса ящура в пробах материала иммунофермен-
Введение
Возникновение в России ящура экзотического типа Азия-1 обусловило необходимость проведения исследования изолятов, отобранных во время этих вспышек [1, 2]. До этого очаги ящура типа Азия-1 регистрировались с марта 2005 г. сначала в Гонконге, а затем и на территории континентального Китая.
В июне 2005 г. заболевание, вызванное вирусом ящура типа Азия-1, возникло среди КРС частного сектора пограничного с Китаем села Буссе Свободненского района Амурской области. В августе 2005 г. ящур типа Азия-1 был зарегистрирован в Монголии в аймаке Дорнод, граничащем с Китаем [2, 7, 8, 9]. В то же время были установлены вспышки ящура, вызванные вирусом того же типа в Приморском и Хабаровском краях. В начале 2006 г. по одному очагу было зарегистрировано на границе с Китаем в Читинской и Амурской областях. [1, 2].
Материалы и методы
Для изучения репродукции выделенных изолятов вируса ящура Азия-1 № 1987 «Амурский», Азия-1 № 1991 «Монгольский», Азия-1 № 1994 «Приморский», Азия-1 № 2002 «Читинский» были использованы перевиваемые культуры клеток (КК) различного происхождения — СПЭВ (свиная почка), ПСГК-30 (почка сибирского горного козерога), IB-RS-2 (почка поросенка); КСТ (коронарные сосуды теленка), ПТ (почка теленка), СЬ-91 (гонады козы);
