CC BY
36
УДК 356 .102:495 .133
А. В. Лазарева, Т. Г. Шапошникова
выявление на ранних стадиях развития сцифомедузы
AURELIA AURITA (cNIDARIA) Структур, СВяЗЫВАЮщих АнТИТЕлА
к белку внеклеточного матрикса мезоглеину*
Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра цитологии и гистологии
Введение. Традиционно кишечнополостные (Coelenterata или Cnidaria) считаются одними из наиболее просто организованных многоклеточных животных, тело которых состоит из двух клеточных слоев, эктодермы и эндодермы, и характеризуется радиальной симметрией и единственной (орально-аборальной) осью [2, 9]. По этим признакам их часто объединяют с гребневиками в группу Radiata или Diploblastica, противопоставляемую Bilateria или Triploblastica. Однако данные, полученные с помощью методов сравнительной гистологии и молекулярной биологии, свидетельствуют о том, что приведенное деление является явным упрощением . Два слоя эпителия кишечнополостных разделены мезоглеей, которая не является структурой, гомологичной третьему зародышевому листку высших многоклеточных, но, по мнению некоторых авторов, сходна с соединительной тканью высших животных [3, 16]. Также было показано, что гидроидные обладают дополнительным слоем ткани, гомологичным мезодерме Bilateria — энтокодоном, который образуется между экто- и эндодермой при отпочко-вывании медузы от стенки тела полипа и дает впоследствии поперечнополосатую мускулатуру, подстилающую субумбреллу [6, 8]. У кишечнополостных обнаружены гены и белки, имеющие гомологи у высших многоклеточных . Это позволяет использовать представителей типа не только как надежную аутгруппу при проведении различных филогенетических анализов, но и как модель для изучения фундаментальных процессов, лежащих в основе реализации генотипа, а так же, как богатый материал для эволюционных построений [7, 8].
В мезоглее A. aurita, широко распространенной в водах Мирового океана и оказывающей существенное влияние на экосистему Белого моря, был выделен новый белок с молекулярной массой 45/47 кДа, названный мезоглеином [17]. Анализ аминокислотной последовательности белка показал, что он содержит домены Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) и Zona Pellucida (ZP), а также три сайта узнавания протеазы фурин (furin), два возможных сайта N-гликозилирования и один возможный сайт O-гликозилирования [13] . Домены DSL и ZP встречаются во многих экстраклеточных белках или в экстраклеточной части мембранных и трансмембранных белков высших многоклеточных Белки, содержащие ZP-домен, выделяют в отдельное семейство, они участвуют в различных процессах, связанных с взаимодействиями клеток и внеклеточного матрикса [10] . С функционированием
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № . 05-04-49578-а, № 07-04-10086-к) и гранта Правительства Санкт-Петербурга (конкурс 2008 г. ) .
© А. В . Лазарева, Т. Г. Шапошникова, 2008
белков, содержащих DSL-домен, связано определение направления дифференцировки клеток на различных этапах развития организмов [11].
Поскольку мезоглеин был впервые обнаружен у взрослой медузы, и, кроме того, было показано, что экспрессия его гена на завершающих этапах онтогенеза сохраняется лишь в мезоглеальных клетках, цель данного исследования — выяснить время появления в онтогенезе мезоглеина и/или его возможных предшественников .
Материалы и методы исследования. Взрослых самок отлавливали в июле-августе 2006-2007 гг в прибрежной зоне Чупинской губы Белого моря в окрестностях ББС ЗИН РАН Картеш на глубине до 2 м и содержали в небольших резервуарах с морской водой при +10 °С в течение нескольких дней до выхода планул из выводковых карманов ротовых лопастей . Препланул и планул собирали с помощью пипетки и содержали в чашках Петри при +10 и +19 °С, отслеживая их дальнейшее развитие. Для выявления динамики появления структур, связывающих антитела к мезоглеину, отбирали животных, достигших следующих стадий развития: препланул сразу по завершении гаструляции, имеющих округлую форму, сформированных подвижных планул, сцифистом с развитыми четырьмя, восьмью, шестнадцатью щупальцами и полностью сформированных сцифистом Часть полученного материала фиксировали 4%-ным раствором параформа на солевом буфере, изотоничном морской воде, часть замораживали для хранения при -20 °С . В ряде случаев для увеличения концентрации белкового материала и снижения концентрации солей в пробе проводили экстракцию с метанол-хлороформом [15] . Гомогенизированные пробы подвергались разделению в условиях SDS-электрофореза по Леммли с последующим полусухим переносом на нитроцеллюлозную мембрану [12, 18] и иммуноблоттингом по следующей схеме: неспецифические сайты связывания инактивировали, инкубируя мембрану в растворе TBS-Tween, содержащем 10 % лиофилизированного обезжиренного молока; затем добавляли антитела к мезоглеину (RA45/47, в конечном разведении 1:12000) и инкубировали в течение часа; несвязанные с антигеном антитела отмывали в нескольких сменах TBS-Tween; затем производилась инкубация в растворе вторых антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой (GAR-AP, Sigma) в разведении 1:20000; после нескольких отмывок TBS-Tween, а затем буфером для щелочной фосфатазы (рН 9,5) производилась визуализация иммунных комплексов раствором, содержащим 0,02 % 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP, Sigma) и 0,03 % нитро-синего тетразолия (NBT, Sigma) [14]; фиксированный материал заливали в парафин и изготовляли срезы толщиной 5 мкм; проводили окрашивание гемотоксилином-эозином и окрашивание по Унна [5]; для выявления в теле животных структур, которые могут являться антигенными детерминантами для сыворотки поликлональных антител RA45/47, полученной против мезоглеина, проводили непрямое иммунохимическое окрашивание срезов по схеме, аналогичной описанной выше для имму-ноблота; в качестве отрицательного контроля использовали срезы, не инкубированные с сывороткой антител, положительным контролем служил материал мезоглеи взрослых медуз
результаты исследования. Разделение белковых проб в условиях денатурирующего электрофореза по Лэммли показало наличие нескольких белковых зон в их составе (рис . 1, А) . После переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану и вестерн-гибридизации с поликлональными антителами против мезоглеина сыворотки RA45/47 в гомогенате материала препланул и планул были выявлены две антигенные детерминанты, соответствующие белковым полосам в геле с молекулярной массой 210 и 180 кДа. В пробах, содержащих материал восьмищупальцевых и шестнадцатищупальцевых сцифистом, выявляется лишь одна белковая полоса, соответствующая массе 80 кДа, а у сформированных полипов — 55 кДа (см . рис . 1, Б) .
При непрямом иммуногистохимическом окрашивании парафиновых срезов метка выявлялась на всех стадиях развития A. аurita, но имела различную локализацию и интенсивность . Так, у препланулы окрашивается только межклеточное вещество (рис . 2, А), у поздней же планулы межклеточное вещество окрашивается в меньшей степени, зато в апикальной части клеток эпидермы и формирующейся гастродермы с антителами связываются отдельные гранулы, причем в гастродерме они содержатся в значительно большем количестве, чем в эпидерме (рис . 2, Б) . После прикрепления и развития у формирующейся
Рис. 1. Выявление белков, связывающих антитела к мезоглеину, из гомогенатов 1 — мезоглеи взрослой медузы; 2 — препланул; 3 — планул; 4 — сцифистом на стадии восьми щупалец; 5 — сформированных сцифистом . А — гель после SDS-электофореза, окрашенный Coomassie, Б — иммуноблот. Стрелками отмечена белковая полоса мезоглеина в геле и соответствующая ей окрашенная полоса на иммуноблоте . Справа указаны молекулярные веса белков, связывающих антитела к мезоглеину на разных стадиях развития А. аитШ.
Разъяснение см . в тексте .
сцифистомы четырех щупалец антигенная детерминанта выявляется в гастродерме, и в меньшей степени в эпидерме в виде гранул, не имеющих четкой локализации . У восьми- и шестнадцатищупальцевых сцифистом связывающиеся с антителами гранулы расположены в базальной части клеток как эпидермы, так и гастродермы, примерно в равных количествах . При этом окружающее межклеточное вещество также имеет окраску выше фоновой, поэтому создается впечатление секреции гранул в сторону утолщающейся мезоглеи (рис . 2, В-Д) . У сформированных полипов окрашивается вещество мезоглеи, гранулы в мезоглеальных клетках и гастродерме, в эпидерме же метка не сохраняется (см . рис . 2, Е-З) .
При сопоставлении этих данных с информацией, которую дают морфологические препараты с помощью классического способа окрашивания парафиновых срезов гемотоксилином-эозином, выяснилось, что именно гранулы, имеющие эозинофильную природу (или их часть), связываются с антителами ИА45/47.
Обсуждение результатов исследования. Таким образом, оформление гранул, связывающих антитела к мезоглеину в отдельные волокна, происходит лишь после полного развития сцифистомы и достижения ею значительных, по сравнению с предшествующими стадиями, размеров . Это логично согласуется с данными о том, что ZP-содержащие белки могут играть роль элементов, перераспределяющих механическую нагрузку [10], т. е . белки, связывающие антитела к мезоглеину и, возможно, являющиеся его предшественниками,
Рис. 2. Иммуногистохимичєскоє окрашивание парафиновых срєзов А — пpeплaнyл; Б — планул, В, Г, Д — сцифистом на стадии восьми щyпaлeц; Е, Ж, З — сформированных сцифистом . А — видно окрашивание мєжклєточного вeщecтвa . Салками oтмeчeнa окраска: Б — гранул в апикальных частях клєток эктoдepмы (экт) и в гастродерме (гастр); В, Г, Д — гранул в базальных частях клєток экто- и гастро-дepмы; Е — матрикса мєзоглєи; Ж — мeзoглeaльныx клєток; З — цитоплазмы клєток гастродермы . Масштаб 50 мкм, если не указан отдельно .
могут модифицировать механические свойства утолщающейся мезоглеи, делая ее роль в поддержании формы тела более значительной . Кроме того, показано, что мезоглея ранних сцифистом имеет слабобазофильную окраску, и оксифильной она становится лишь у сформированной сцифистомы, когда ее толщина может достигать 40 мкм [4].
Роль гранул в апикальных частях клеток на более ранних стадиях развития остается неясной, как и открытым остается вопрос, являются ли перечисленные выше белки (или хотя бы часть из них) предшественниками мезоглеина или их связывание с антителами RA45/47 обусловливается наличием в их структуре сходных функциональных доменов . Если белки, составляющие гранулы, действительно являются предшественниками ме-зоглеина, то вероятно, что они накапливаются в клетках параллельно с пролиферацией эпителиальных тканей и, по достижении животным определенного размера, довольно быстро секретируются, формируя материал мезоглеи и меняя тем самым ее свойства. Поскольку с функционированием белков, содержащих DSL-домен, связано определение направления дифференцировки клеток у беспозвоночных [11], возможно, что они играют роль в развитии, но при этом могут и не являться предшественниками мезоглеина
Существуют данные о том, что антитела сыворотки RA45/47 могут связываться с белками гомогената гонад самок медуз, имеющими массу 210 и 180 кДа [1]. Проведенные исследования пока не дают возможности судить о том, в какой момент онтогенеза начинается синтез мезоглеина или его предшественников за счет собственной активности развивающегося организма, хотя гистохимическое окрашивание по Унна показало наличие достаточного количества РНК в апикальных частях клеток поздних планул . Однако это не доказывает, что выявляемые в материале препланул и планул белки соответствующих молекулярных масс не были переданы материнским организмом в ходе оогенеза в виде белкового продукта или РНК . Поэтому в дальнейшей работе предполагается определить время начала экспрессии мезоглеина (или его предшественников) методом RT-PCR.
Авторы выражают глубокую признательность людям, без участия которых данная работа не смогла бы состояться: Л . С . Адонину, О . И . Подгорной, И . В . Матвееву, В . Ф . Синицыной, И . А . Тихомирову, а также всем сотрудникам ББС ЗИН РАН Картеш .
summary
Lazareva A. V., Shaposhnikova T. G. Identification of the structure binding antibodies to extracellular protein mesoglein at early developmental stages of scyphomedusa Aurelia aurita (Cnidaria)
A number of proteins obtained at early stages of medusa Aurelia aurita development are stained with polyclonal antibodies raised against the mesoglein (RA45/47) . They are suspected to be a mesoglein precursor In immunoblots of planula larvae RA45/47 two bands of 210 kDa and 180 kDa are shown . In case of the eight-tentacle or a full-grown polyp the only band having molecular masses of 80 kDa and 55 kDa respectively was observed. Immunostaining of the paraffin sections shows that the oxyphilic cell granules of early developmental stages and mesogleal matrix of the full-grown polyps are stained .
Key words: extracellular matrix, Aurelia aurita, mesoglein, Scyphozoa development
литература
1. Адонин Л. С., Шапошникова Т. Г. Структура анимального полюса ооцита сцифоидной медузы Aurelia aurita // Тез . докл . IX науч . сессии МБС СПбГУ СПб . , 2008. С . 71-72 .
2 . Догель В. А. Зоология беспозвоночных. М . , 1981.
3 . Заварзин А. А. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани . М . , 1945 .
4 . Напара Т. О., Оскольский А. А., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita . I . Морфология клеток и матрикса мезоглеи // Цитология . 1994 . С . 623-630 .
5 . Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная . М. , 1962.
6 . Agassiz L. Contributions to the Natural History of the United States of America. Vol . 3 . Boston, 1860.
7 . Ball E. E., Hayward D. C., Robert Saint R, Miller D. J. A simple plan — Cnidarians and the origins of developmental mechanisms // Nat. Rev. Genet. 2004. Vol . 5 . P. 567-577.
8 . BoeroF., Gravili C., PagliaraP., Piraino S., Bouillon J., Schmid. V. The cnidarian premises ofmetazoan evolution: from triploblasty, to coelom formation, to metamery // Ital . J. Zool . 1998 . Vol . 65 . P. 5-9 .
9 . Chapman D. M. Cnidarian histology. Coelenterate biology. Reviews and new perspectives . London,
1974 .
10 . Jovine L., Darie C. C., Litscher E. S., Wassarman P. M. Zona pellucida domain proteins // Annu. Rev Biochem 2005 Vol 74 P 83-114
11. Kiyota T., Kinoshita T. Cystein-rich region of X-Serrate-1 is required of Notch signaling in (Xenopus) primary neurogenesis // Int. J Dev Biol . 2002. Vol . 46, N . 8 . P. 1057-1060 .
12. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the essambly of the head of the bacteriophage T4 // Nature . 1970 . Vol . 4 . P. 680-682.
13 . Matveev I. V., Shaposhnikova T. G. , Podgornaya O . I . A novel Aurelia aurita protein mesoglein contains DSL and ZP domains // Gene . 2007. Vol . 399 . P. 20-25 .
14 . Riis T. Western blotting in Molecular biology problem solver: a laboratory guide . 2001.
15 . Rosenberg J. M. Protein analysis and purification Benchtop techniques . Boston; Basel; Berlin,
1996.
16 . Seipel K. and Schmid V. Mesodermal anatomies in cnidarian polyps and medusae // Int. J . Dev. Biol . 2006 . Vol . 50 . P. 589-599.
17 . Shaposhnikova T. G., Matveev I. V., Napara T. O., Podgornaya O. I. Mesogleal cells of the jellyfish Aurelia aurita are involved in the formation of mesogleal fibres // Cell Biol . Int. 2005 . Vol . 29, N . 11. P. 952-958.
18 . Towbin H., Staechelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // PNAS USA . 1979 . Vol . 76 . P. 4350-4354.
