CC BY
70
УДК 611.013
Выявление экспрессии Т-кадгерина в эмбриогенезе у мыши
К. А. Рубина1*, В. А. Смутова1, М. Л. Семенова2, А. А. Поляков3, S. Gerety4, D. Wilkinson3, Е. И. Суркова1, Е. В. Семина1, В. Ю. Сысоева1, В. А. Ткачук1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, кафедра биохимии и молекулярной медицины, 119192, Москва, Ломоносовский просп., 31, корп. 5
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
3Division of Developmental Neurobiology, MRC National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA
4Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge. CB10 1SA
*E-mail: rkseniya@mail.ru Поступила в редакцию 31.10.2014 После доработки 20.02.2015
РЕФЕРАТ В представленной работе изучена экспрессия Т-кадгерина на ранних этапах развития эмбриона мыши. С использованием методов гибридизации in situ и иммунофлуоресцентного окрашивания целых эмбрионов в сочетании с конфокальной микроскопией установлено, что экспрессия Т-кадгерина в развивающемся головном мозге выявляется, начиная со стадии Е8.75, а в сердце - со стадии Е11.5, что указывает на возможную роль Т-кадгерина в процессах формирования сосудов в эмбриогенезе. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ангиогенез, in situ-гибридизация, Т-кадгерин, эмбриогенез. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ T-cad - Т-кадгерин, ФСБ - фосфатно-солевой буфер.
ВВЕДЕНИЕ
Т-кадгерин впервые обнаружили более 20 лет назад в мозге куриного эмбриона [1]. В ранних работах Раншт [1] было показано, что экспрессия Т-кадгерина в развивающихся сомитах коррелирует с миграцией клеток нервного гребня из нервной трубки. Клетки нервного гребня представляют собой транзиторную мультипотентную популяцию клеток, из которых впоследствии формируются различные ткани, включая черепно-лицевые кости и хрящи, гладкомышеч-ные клетки, меланоциты, периферические нейроны, глию и другие. В более поздних работах этой лаборатории было обнаружено, что мигрирующие клетки нервного гребня и растущие к своим мишеням аксоны мотонейронов выбирают траекторию движения через ростральную часть сомитов, избегая по пути ка-удальную часть сомитов, где клетки экспрессируют Т-кадгерин. Эксперименты in vitro с использованием растворимого Т-кадгерина или Т-кадгерина в качестве субстрата показали, что Т-кадгерин подавляет формирование нейритов и рост аксонов мотонейронов. Это позволило предположить, что Т-кадгерин функционирует как молекула-навигатор для растущих аксонов и мигрирующих клеток нервного греб-
ня [2, 3]. Подобно другим навигационным молекулам, эфринам и их рецепторам [4], Т-кадгерин в развивающейся нервной системе действует как «молекула отталкивания» и негативно регулирует рост аксонов и миграцию клеток.
Следует отметить, что уровень экспрессии Т-кадгерина во взрослом мозге выше, чем в эмбриональном [5]. В нашей лаборатории обнаружено, что во взрослом организме Т-кадгерин экспрес-сируется не только в нервной системе, но и в сердечно-сосудистой [6, 7]. Иммуногистохимическое окрашивание срезов аорты выявило присутствие Т-кадгерина во всех слоях сосудистой стенки (интиме, медии и адвентиции), в эндотелии, гладкомы-шечных клетках и перицитах. В адвентиции высокий уровень Т-кадгерина отмечен в стенках vasa vaso-rum [6]. Мы наблюдали также повышение экспрессии Т-кадгерина в сосудах при различных патологиях: при формировании атеросклеротических поражений и постангиопластическом рестенозе - состояниях, связанных с патологическим ангиогенезом у человека [6, 7]. Кроме того, обнаружено, что повышенная экспрессия Т-кадгерина в стенке артерий после баллонной ангиопластики у крыс коррелирует с поздни-
ми стадиями формирования неоинтимы и совпадает с фазой активной миграции и пролиферации сосудистых клеток. Экспрессия Т-кадгерина в vasa vasorum адвентиции поврежденных кровеносных сосудов позволяет предполагать его участие в регуляции ан-гиогенеза или репарации повреждений сосудистой стенки [7].
Известно, что в эмбриогенезе формирование нервной и сердечно-сосудистой систем происходит параллельно, в результате чего сосуды и нервы часто располагаются в непосредственной близости друг от друга. Нервные и сосудистые клетки секретируют нейротрофические и ангиогенные факторы соответственно, что способствует их выживанию и определяет направление роста и миграции [8]. Механизмы регуляции направленного роста аксонов и миграции нервных клеток достаточно хорошо изучены [4, 9, 10], данных о факторах и механизмах, регулирующих направленный рост сосудов, существенно меньше. К навигационным молекулам, участвующим в регуляции формирования нервной и сосудистой систем, традиционно относят такие белки, как семафорины и их рецепторы (плексины и нейропилины), нейтри-ны и их рецепторы (DCC/неогенин и Unc5), слит-лиганды и их рецепторы (Robo) и некоторые другие белки [10]. Данные об экспрессии Т-кадгерина в сердечно-сосудистой системе в эмбриогенезе до сих пор не опубликованы. Не известно, экспрессируется ли Т-кадгерин в формирующемся сердце и сосудах в эмбриогенезе или его роль ограничивается регуляцией траектории роста аксонов и миграции клеток нервного гребня.
В этой связи, используя методы in situ-гибридизации и иммунофлуоресцентного окрашивания целых эмбрионов в сочетании с конфокальной микроскопией, мы анализировали экспрессию Т-кадгерина на разных стадиях развития мыши. Экспрессия мРНК Т-кадгерина в развивающемся головном мозге обнаруживается, начиная со стадии Е8.75. В сердце экспрессия Т-кадгерина выявлена на стадии Е11.5, что совпадает с процессами активного формирования и роста сосудов за счет васкуло-и ангиогенеза в сердечно-сосудистой системе и головном мозге.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение датированной беременности мыши
В работе использовали эмбрионы мышей, полученные от гибридов F1 CBA/С57Bl6. Мышей содержали в стандартных условиях при 14-часовом световом дне. В вечернее время суток к самкам подсаживали самцов, на следующее утро выявляли спарившихся мышей по наличию вагинальных пробок. День обна-
ружения вагинальной пробки считали 1/2 первого дня беременности.
Получение эмбрионов мыши на постимплантационных стадиях развития
Постимплантационные эмбрионы извлекали по стандартному протоколу, описанному Манк [11]. Самку умерщвляли путем дисклокации шейных позвонков, вскрывали брюшную полость, извлекали матку с децидуомами и помещали в чашку Петри с охлажденным фосфатно-солевым буфером (ФСБ, Sigma-Aldrich). Далее рога матки надрезали по антимезоме-триальному краю, обнажая децидуальные капсулы с зародышами, и отделяли их от мезометриальной стенки. Децидуомы переносили в чистую чашку Петри, содержащую холодный ФСБ. Децидуальную капсулу надрезали, захватив ее мезометриальный конец, и аккуратно выталкивали эмбрион в раствор. После этого препаровальными иглами эмбрион освобождали из амниотической оболочки и переносили пипеткой в чистую чашку Петри с ФСБ для отмывки. Эмбрионы фиксировали в 4% растворе формальдегида (PRS Panreac) на ФСБ при температуре +4 С в течение ночи.
Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши антителами против Т-кадгерина
После фиксации эмбрионы промывали 5 раз по 20 мин в ФСБ, содержащем 0.2% детергента Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Для блокирования неспецифического окрашивания образцы помещали в нормальную неиммунную сыворотку козы (Sigma-АЫп^) в разведении 1 : 10 и инкубировали их при температуре + 4°С на качалке в течение ночи. Затем эмбрионы инкубировали в растворе моно-клональных антител кролика против Т-кадгерина мыши (BioDesign) в разведении 1 : 25. В качестве контроля использовали неиммунные иммуноглобулины IgG кролика (Abd Serotec) в концентрации, эквивалентной концентрации специфических антител. Инкубацию проводили в течение дня при комнатной температуре и при постоянном покачивании. Антитела отмывали в 0.2% растворе Triton X-100 на ФСБ (3 раза по 20 мин при комнатной температуре), а затем (в четвертой смене раствора) на качалке в течение ночи при температуре +4°С. После отмывки эмбрионы помещали в раствор вторых антител козы, конъюгированных с флуорохромом Alexa Fluor® 594, в которых выдерживали весь день на качалке при комнатной температуре. Ядра клеток докрашивали флуоресцентным красителем DAPI (Sigma-АЫп^) в разведении 1 : 1000 в течение 30 мин, а затем промывали 3 раза по 20 мин в 0.2% Triton X-100 на ФСБ и оставляли на ночь в том же раство-
ре при температуре +4°С на качалке. На следующий день эмбрионы заключали в среду Aqua-Poly/ Mount (Polysciences). Готовые образцы анализировали при помощи конфокального мультифотонного микроскопа Leica SP5 и программного обеспечения Leica Application Suite Advanced Fluorescence 2.2.0 (Leica Microsystems).
Очистка плазмид для in situ-гибридизации
Очистку и выделение плазмид производили с помощью коммерческого набора EndoFree® Plasmid Maxi Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.
Линеаризация плазмид для in situ-гибридизации
In situ-гибридизацию с РНК-содержащими пробами к Т-кадгерину (sense и antisense) и Krox20 проводили на эмбрионах мыши по методике, разработанной ранее [12].
Для выявления экспрессии мРНК Т-кадгерина в эмбрионах мыши методом гибридизации in situ использовали плазмиду pFLCI (ImaGenes, Германия) со встроенной EST-последовательностью (expressed sequence tag) кДНК Т-кадгерина. Для положительного контроля использовали плазмиду Bluescript KS со встроенной EST-последовательностью кДНК Krox20. EST представляют собой короткие кДНК, используемые для выявления экспрессии генов и доступные в базе данных GenBank.
Для линеаризации плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазами: Notl (Fermentas) - для Krox20 и BamHl (Fermentas) - для Т-кадгерина. Состав реакционной смеси для линеаризации: 10-кратный буфер, деионизованная вода («Синтол»), плазмида (4 мкг), рестриктаза (Notl или BamHl). Смесь инкубировали в течение 12 ч при температуре +37 С. После инкубации ДНК очищали с использованием коммерческого набора GFX PCR DNA and Gel Purification Kit (GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя. Линеаризованные и нелине-аризованные плазмиды анализировали с помощью электрофореза в 1.2% агарозном геле.
Синтез РНК-содержащей пробы для in situ-гибридизации
Реакционная смесь для синтеза меченной дигок-сигенином РНК-содержащей пробы включала: 5-кратный транскрипционный буфер, деионизо-ванную свободную от РНКаз воду, линеаризованную плазмиду, смесь нуклеотидов, меченных DIG (10 мМ АТР, 10 мМ СТР, 10 мМ GTP, 6.5 мМ UTP, 3.5 мМ DIG-11-UTP, pH 7.5, Roche), ингибитор РНКаз (Merck Biosciences), РНК-полимеразу. Смесь инкубировали в течение 2 ч при температуре +37°С.
Для синтеза РНК-содержащей пробы с линеаризованной плазмиды, содержащей последовательность Krox20, использовали РНК-полимеразу Т3 (Fermentas). Для синтеза РНК-пробы прямой последовательности Т-кадгерина (отрицательный контроль) с линеаризованной плазмиды использовали РНК-полимеразу Т7 (Promega), а для синтеза обратной РНК-пробы для выявления мРНК Т-кадгерина использовали РНК-полимеразу Т3 (Fermentas). Полученные РНК-пробы очищали на коммерческой колонке RNAspin Mini (GE Healthcare) в соответствии с протоколом изготовителя.
Гибридизация эмбрионов мыши in situ Гибридизацию эмбрионов мыши проводили с РНК-пробой (antisense), которую синтезировали на матрице гена Т-кадгерина. РНК-проба antisense (обратная последовательность) позволяет выявлять экспрессию на уровне транскрипции. Sense-проба (прямая последовательность) не связывается с мРНК в клетке, поскольку она некомплементарна мРНК и используется в качестве отрицательного контроля. Положительным контролем служила РНК-проба, синтезированная на матрице гена Krox20, уровень экспрессии которого высок в клетках центральной нервной системы эмбрионов мыши на этих стадиях развития.
Гибридизацию проводили на эмбрионах мыши стадий Е8.75, Е9.5 и Е10.5.
Эмбрионы фиксировали в течение ночи в 4% растворе формальдегида (PRS Panreac) на ФСБ, содержащем также 1% Tween-20 (Sigma-Aldrich) при температуре + 4°С, затем отмывали (2 раза по 5 мин) холодным ФСБ и последовательно фиксировали в растворах метанола возрастающей концентрации (25, 50, 75 и дважды 100%). После этого эмбрионы замораживали и хранили для последующих исследований при температуре -20С. Непосредственно перед проведением гибридизации зародышей подвергали регидратации в растворах метанола с понижающейся концентрацией (75, 50 и 25%), отмывали 3 раза в ФСБ, обрабатывали про-теиназой К при комнатной температуре (Qiagen, в концентрации 10 мкг/мл на ФСБ). Затем эмбрионы отмывали в ФСБ, фиксировали в 4% формальдегиде (PRS Panreac) на ФСБ в течение 20 мин и отмывали 2 раза по 5 мин в ФСБ. Далее эмбрионы постепенно переводили в гибридизационный буфер, содержащий 50% формамид (Sigma-Aldrich), 5-кратный буфер SSC (исходный раствор: 20-кратный буфер SSC содержит 3 М NaCl, 0.3 M цитрат натрия, рН 7.0), 0.1% Triton X-100 («ДиаЭм»), 50 мкг/мл гепарина (Sigma-Aldrich), 1 мг/мл РНК из дрожжей типа IV (Sigma-Aldrich), 5 мМ EDTA (Applichem),
Рис. 1. In sifu-гибридизация эмбрионов мыши на стадии Е8.75. Экспрессия мРНК Т-кадгерина (T-cad): 1 - в области среднего мозгового пузыря; 2 - в основании формирующегося глазного пузыря; 3 - во внутренней выстилке конечного мозга; 4 - в продолговатом мозге; 5, 6 - в слуховых пузырях. Отсутствие специфического окрашивания в отрицательном контроле (control). Увеличение в 3.2, 5 и 6 раз
2% блокирующий раствор (Roche) и 0.1% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane-sulfonate) (Sigma-Aldrich). Эмбрионы инкубировали при комнатной температуре в смеси (1 : 1) гибридизационного буфера и ФСБ, затем -в гибридизационном буфере. Эмбрионы оставляли в гибридизационном буфере на ночь при температуре + 650С. Утром эмбрионы помещали в свежий гибридизационный буфер, добавляли РНК-пробу (0.5 мкг пробы на 1 мл буфера) и инкубировали в течение 24 ч при температуре +650С. После этого эмбрионы отмывали в гибридизационном буфере (3 раза по 30 мин при температуре +650С), а затем в смеси гибридизационного буфера и буфера МАВТ (1 : 1) в течение 30 мин при температуре +650С. Состав буфера MABT: 100 мМ малеиновая кислота (Sigma-Aldrich), pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich). Далее эмбрионы промывали в буфере MABT 3 раза по 10 мин при комнатной температуре, помещали в блокирующий раствор (2% блокирующий раствор (Roche), содержащий 20% сыворотки овцы (Abd Serotec) и MABT) на 2 ч при комнатной температуре, после чего инкубировали в течение 12 ч при +4°С с раствором антител против дигоксигенина, конъюгированных с щелочной фосфатазой в разведении 1 : 200 (Roche), приготовленном на 10% сыворотке овцы. После инкубации с антителами эмбрионы промывали при комнатной температуре в MABT, а затем в буфере NTMT до появления окрашивания. Состав буфера NTMT на 1 мл: 100 мМ трис-HCl (Sigma-Aldrich), pH 9.5,
50 мМ MgCl2 (Sigma-Aldrich), 100 мМ NaCl, 0.1% Tween-20 (Sigma-Aldrich), 4.5 мкл NBT (4-nitro-blue tetrasodium chloride, Vector Laboratories) и 3.5 мкл BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, Vector Laboratories). Реакцию окрашивания останавливали многократным промыванием в ФСБ, после чего эмбрионы фиксировали в 4% формальдегиде (PRS Panreac) на ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре. Съемку эмбрионов производили с использованием стереомикроскопа (Olympus SZX 16, камера AxioCam HRc, Carl Zeiss) и программы Axio Vision 3.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Используя методы in situ-гибридизации и иммуно-флуоресцентного окрашивания целых эмбрионов в сочетании с конфокальной микроскопией, мы оценили экспрессию Т-кадгерина на стадиях Е8.75-Е11.5 раннего эмбрионального развития мыши.
Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном головном мозге мыши
Экспрессия мРНК Т-кадгерина обнаружена в формирующемся головном мозге, начиная со стадии Е8.75, в частности, в промежуточном и переднем мозге - во внутренней выстилке полости конечного мозга (telencephalon) (рис. 1). мРНК Т-кадгерина выявлялась также в области глазных пузырей - в месте перехода промежуточного мозга в развивающиеся зрительные бугры. В отрицательном контроле (проба sense) наблюдали неспецифическое фоновое
Рис. 2. In sifu-гибридизация эмбрионов мыши на стадии Е9.5. Окрашивание участков головного мозга соответствует локализации мРНК Т-кадгерина (T-cad). Экспрессия наблюдается в основании формирующихся глазных пузырей; в области теменного и затылочного изгибов. Маленькие стрелки указывают на основание формирующегося глазного пузыря. Control - отрицательный контроль. Увеличение в 3.2, 5 и 6 раз
ш
T-cad
Control
Рис. 3. In sifu-гибридизация эмбрионов мыши на стадии Е10.5. Интенсивная экспрессия Т-кадгерина (T-cad) в формирующейся крыше мозга, в латеральных областях диэнцефалона. Стрелкой указано специфическое окрашивание сосудистого сплетения в области конечного мозга.Отсутствие специфического окрашивания в отрицательном контроле (control). Увеличение в 3.2, 5 и 6 раз
диффузное окрашивание в переднем мозге, отличное от специфического окрашивания с использованием положительного контроля и ап^е^е-пробы на Т-кадгерин.
На стадии Е9.5 экспрессия мРНК Т-кадгерина выявлена в переднем мозге, в утолщающейся обонятельной плакоде, в основании глазных пузырей, в области теменного изгиба, в месте перехода продолговатого мозга в спинной - в области затылочного изгиба (рис. 2).
На стадии Е10.5 экспрессия мРНК Т-кадгерина наблюдалась в среднем мозге, в формирующейся эпен-димной крыше промежуточного мозга (диэнцефалон, diencephalon) и его латеральных областях (рис. 3 и 4). Специфическое окрашивание обнаружено также в области сосудистого сплетения конечного мозга (рис. 3).
В отрицательном контроле специфического окрашивания не обнаружили. В положительном контроле наблюдали характерный для гена Кгох20 паттерн специфического окрашивания (рис. 3 и 4).
Рис. 4. In s/tu-гибридизация эмбрионов мыши на стадии Е10.5. T-cad - специфическое окрашивание Т-кадгерина в крыше мозга в области затылочного изгиба, во внутренней выстилке конечного мозга; control -отсутствие специфического окрашивания в отрицательном контроле; Krox20 - окрашивание структур центральной нервной системы в положительном контроле. Увеличение в 3.2 раза
Белок Т-кадгерин детектировали методом имму-нофлуоресцентного окрашивания антителами против Т-кадгерина на целых эмбрионах мыши в сочетании с конфокальной микроскопией. Т-кадгерин выявляли, начиная со стадии Е9.5, при этом специфическое окрашивание наблюдалось в выстилках развивающегося головного мозга (рис. 5), в том числе в основании формирующихся глазных пузырей.
Уровень экспрессии Т-кадгерина во внутренней выстилке головного мозга был высоким, начиная со стадии Е11.5: интенсивное специфическое окрашивание наблюдалось в области промежуточного мозга, формирующегося глазного бокала, а также в области среднего и заднего мозга (рис. 6).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия Т-кадгерина на уровне мРНК начинается со стадии Е8.75 и выявляется в разных отделах эмбрионального головного мозга. Белок Т-кадгерин в эмбрионах детектируется, начиная со стадии Е9.5. Максимальная интенсивность экспрессии Т-кадгерина выявляется во внутренней выстилке головного мозга.
Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном сердце
В сердце эмбрионов мыши Т-кадгерин экспресси-руется, начиная со стадии Е11.5 (рис. 7). На стадиях Е8.75, Е9.5, Е10.5 ни экспрессии мРНК Т-кадгерина, ни самого Т-кадгерина в формирующемся сердце не обнаружено (рис. 8).
ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, полученные в нашей работе, свидетельствуют о том, что в формирующемся головном мозге мРНК Т-кадгерина экспрессируется, начиная со стадии Е8.75 - во внутренней выстилке полости конечного мозга и в промежуточном мозге. До этой стадии экспрессию Т-кадгерина выявить не удалось. Известно, что в области изгибов головного мозга на ранних этапах развития происходит ак-
1
2
Рис. 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши на стадии Е9.5 (1) и Е12.5 (2). Специфическое окрашивание (красная флуоресценция) соответствует экспрессии Т-кадгерина в выстилках мозга на обеих стадиях; экспрессия Т-кадгерина в формирующемся глазном пузыре у эмбриона Е9.5. Синяя флуоресценция соответствует ядрам, докрашенным DAPI. Увеличение в 5 раз
тивное формирование и рост кровеносных сосудов [13]. Возможно, экспрессия Т-кадгерина на стадии Е9.5 в этих областях формирующегося мозга связана с интенсивными процессами ангиогенеза и потенциальным участием этого белка в процессах регуляции направленного роста кровеносных сосудов так же, как это происходит при росте аксонов мотонейронов к своим мишеням в нервной системе.
Позднее, на стадии Е9.5, мРНК Т-кадгерина была идентифицирована в переднем мозге, в обонятельной плакоде, в основании глазных пузырей, в области теменного и затылочного изгибов. Известно, что в области изгибов головного мозга на этой стадии развития происходит активное формирование и рост кровеносных сосудов, что позволяет предполагать возможное участие Т-кадгерина в васкуляризации этих структур [13]. Характерно, что экспрессия Т-кадгерина на уровне мРНК в области глазных пузырей выявлялась еще на стадии Е8.75. Мы предполагаем, что экс-
1 2 3
Рис. 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши на стадии Е11.5. Специфическое окрашивание (красная флуоресценция) соответствует экспрессии белка Т-кадгерина. Синяя флуоресценция соответствует ядрам, докрашенным DAPI. 1 - специфическое окрашивание в области промежуточного мозга, а также в области формирующегося глазного бокала; 2 - специфическое окрашивание в области среднего и заднего мозга; 3 - тот же участок, что и на 2 - на другом уровне оптической плоскости. Увеличение в 5 раз
прессия Т-кадгерина в основании формирующихся глазных пузырей связана с эпителизацией структур будущих глазных бокалов, или Т-кадгерин участвует в формировании сосудистой оболочки глаза. Однако для точного определения роли Т-кадгерина в формировании этих структур необходимы дополнительные исследования.
Далее на стадии Е10.5 интенсивное окрашивание, соответствующее мРНК Т-кадгерина, было выявлено в среднем мозге, в формирующейся эпендимной крыше промежуточного мозга и его латеральных областях. Специфическое окрашивание обнаружено также в области сосудистого сплетения конечного мозга. Окрашенные области морфологически соответствовали областям формирования сосудистых сплетений в стенках формирующейся системы желудочков мозга.
Полученные методом гибридизации in situ результаты определения экспрессии Т-кадгерина на уровне белка подтверждали с помощью имму-нофлуоресцентного окрашивания целых эмбрионов мыши. Конфокальная микроскопия в сочетании с анализом изображения позволила обнаружить белок Т-кадгерин в выстилках развивающегося головного мозга, начиная со стадии Е9.5. Экспрессия Т-кадгерина выявлена, в том числе, и в основании формирующихся глазных пузырей, что соответствует данным, полученным методом in situ-гибридизации. Экспрессия Т-кадгерина в формирующемся глазном бокале указывает на возможное участие этого белка в развитии сосудистой оболочки глаза.
Окрашивание эмбрионов антителами выявило интенсивную экспрессию Т-кадгерина во внутренней выстилке головного мозга, начиная со стадии Е11.5.
T-cad, DAPI ■ DAPI
1 2
Рис. 7. Иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов мыши на стадии Е11.5. Специфическое окрашивание (красная флуоресценция) соответствует экспрессии белка Т-кадгерина (T-cad). Синяя флуоресценция соответствует ядрам, докрашенным DAPI. 1 - специфическое окрашивание, отражающее экспрессию Т-кадгерина в области сердца; 2 - контрольное окрашивание антителами к иммуноглобулину G. Увеличение в 5 раз
А именно, интенсивное специфическое окрашивание наблюдалось в области промежуточного мозга, формирующегося глазного бокала, а также в области среднего и заднего мозга. Мы предположили, что Т-кадгерин участвует в формировании системы желудочков головного мозга, а именно сосудистых сплетений в стенках желудочков, поскольку известно, что на этом этапе эмбрионального развития здесь происходит активное формирование сосудов мозга [13].
Таким образом, использование методов ш situ-гибридизации и иммунофлуоресцентного окраши-
Рис. 8. Отсутствие мРНК Т-кадгерина в формирующемся сердце эмбрионов мыши на стадиях Е8.75-Е10.5 (1, 2, 3). Стрелки и выделенная область указывают на зону формирующегося сердца. Увеличение в 5 (1, 2) и 6 раз (3)
вания в сочетании с конфокальной микроскопией впервые позволило выявить Т-кадгерин в эмбрионах мыши и определить стадию, с которой начинается экспрессия Т-кадгерина на уровне мРНК и белка, а также морфологические области экспрессии этого белка. Экспрессия Т-кадгерина на уровне мРНК обнаруживается, начиная со стадии Е8.75, в разных отделах формирующегося головного мозга. Экспрессия белка Т-кадгерина выявляется, начиная со стадии Е9.5. Наибольшая экспрессия Т-кадгерина при этом наблюдалась во внутренней выстилке головного мозга, что предполагает возможное участие Т-кадгерина в формировании сосудистых сплетений в стенках желудочков в развивающемся головном мозге.
Методы 1п эйи-гибридизации и иммунофлуорес-центного окрашивания целых эмбрионов мыши позволили выявить экспрессию Т-кадгерина в сердце на уровне белка, начиная со стадии Е11.5. На стадиях Е8.75, Е9.5, Е10.5 ни экспрессии мРНК Т-кадгерина, ни белка Т-кадгерина в формирующемся сердце не обнаружено.
Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном сердце, впервые выявленная на стадии Е11.5, отражает, по всей видимости, активные процессы формирования и роста сердца и его отделов, а также ангиогенеза
[14].
Предположительно, между стадиями Е10.5-Е11.5 эмбрионального развития мыши происходит активация синтеза мРНК Т-кадгерина, после чего происходит быстрое и интенсивное накопление белка Т-кадгерина. Вполне вероятно, что Т-кадгерин также принимает участие в установлении синаптических контактов в формирующейся проводящей системе сердца.
Ранее в лаборатории Раншт были получены мыши с дефицитом Т-кадгерина [15]. Такие мыши были жизнеспособны и фертильны, что характерно для це-
лого ряда животных с нокаутом и указывает на возможные компенсаторные механизмы, реализующиеся в эмбриогенезе. Однако в условиях эксперимента на различных животных моделях, воспроизводящих заболевания сердечно-сосудистой системы у человека, обнаружено, что Т-кадгерин играет важную роль в процессах восстановления кровоснабжения при повреждении. На модели ишемии-реперфузии показано, что Т-кадгерин выполняет кардиопротективную функцию, поскольку размер инфаркта у контрольных мышей был значимо меньше, чем у животных с дефицитом Т-кадгерина [16, 17]. На модели ишемии задней конечности с использованием этих же мышей обнаружено, что Т-кадгерин необходим для полноценной реваскуляризации ишемизированных мышц
[18]. Полученные в настоящей работе данные о роли Т-кадгерина как навигационной молекулы, регулирующей рост сосудов в эмбриогенезе, согласуются с результатами, полученными на экспериментальных животных моделях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Данные об экспрессии Т-кадгерина в развивающемся головном мозге и сердце мыши свидетельствуют о том, что начало экспрессии Т-кадгерина совпадает с активизацией процессов формирования и роста сосудов за счет васкуло- и ангиогенеза в сердечно-сосудистой системе и головном мозге в эмбриогенезе
[19]. Эти результаты позволяют выдвинуть предположение о роли Т-кадгерина как молекулы-регулятора процессов формирования и направленного роста сосудов в эмбриогенезе. Механизм, по которому Т-кадгерин осуществляет регуляцию роста нейронов в нервной системе в эмбриогенезе, как показано ранее, заключается в гомофильном узнавании и последующем «отталкивании» Т-кадгеринов на клетках [2, 3]. Нами установлен сходный механизм регуляции
2
3
роста сосудов in vivo в модельных экспериментах на мышах и регуляции миграции эндотелиальных клеток in vitro [20]. Возможно, сходный механизм имеет место и при регуляции роста кровеносных сосудов с участием Т-кадгерина в эмбриогенезе. •
Работа выполнена за счет гранта Российского
научного фонда (проект № 14-24-00086) с использованием оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ranscht B., Dours-Zimmermann M.T. // Neuron. 1991. V. 7. № 3. P. 391-402.
2. Fredette B.J., Ranscht B. // J. Neurosci. 1994. V. 14. P. 73317346.
3. Fredette B.J., Miller J., Ranscht B. // Development. 1996. V. 122. P. 3163-3171.
4. Eichmann A., Makinen T., Alitalo K. // Genes Devel. 2005. V. 19. № 9. P. 1013-1021.
5. Takeuchi T., Misaki A., Liang S.B., Tachibana A., Hayashi N., Sonobe H., Ohtsuki Y. // J. Neurochem. 2000. V. 74. P. 14891497.
6. Ivanov D., Philippova M., Antropova J., Gubaeva F., Iljinskaya O., Tararak E., Bochkov V., Erne P., Resink T., Tkachuk V. // Histochem. Cell. Biol. 2001. V. 115. P. 231-242.
7. Kudrjashova E., Bashtrikov P., Bochkov V., Parfyonova Ye., Tkachuk V., Antropova J., Iljinskaya O., Tararak E., Erne
P., Ivanov D., et al. // Histochem. Cell Biol. 2002. V. 118. № 4. P. 281-290.
8. Carmeliet P. // Nat. Rev. Genet. 2003. V. 4. № 9. P. 710-720.
9. Poliakov A., Cotrina M., Wilkinson D. // Developmental Cell. 2004. V. 7. № 4. P. 465-480.
10. Weinstein B.M. // Cell. 2005. V. 120. P. 299-302.
11. Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы. М.: Мир, 1990. 406 с.
12. Wilkinson D. In situ hybridization: a practical approach. Oxford: Oxford Univ. Press, 1998. P. 212.
13. Vasudevan A., Bhide P. // Cell Adhesion Migration. 2008. V. 2. № 3. P. 167-169.
14. Burggren W., Keller B. Development of cardiovascular systems. Cambridge, UK. Cambridge Univ. Press, 1997. P. 360.
15. Hebbard L.W., Garlatti M., Young L.J.T., Cardiff R.D., Oshima R.G., Ranscht B. // Cancer Res. 2008. V. 68. № 5. P. 1407-1416.
16. Denzel M., Scimia M., Zumstein P., Walsh K., Ruiz-Lozano
P., Ranscht B. // J. Clin. Invest. 2010. V. 120. № 12. P. 4342-4352.
17. Parker-Duffen J., Walsh K. // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2014. V. 28. № 1. P. 81-91.
18. Parker-Duffen J., Nakamura K., Silver M., Zuriaga M.A., MacLauchlan S., Aprahamian T.R., Walsh K. // Biol. Chem. 2013. V. 288. № 34. P. 24886-24897.
19. Gilbert S.F. Developmental Biology. 6th edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates, 2000. P. 817.
20. Rubina K., Kalinina N., Potekhina A., Efimenko A., Semina E., Poliakov A., Wilkinson D.G., Parfyonova Y., Tkachuk V. // Angiogenesis. 2007. V. 10. № 3. P. 183-195.
