Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе комбинированных сочетаний циннаризина и психотропных лекарственных средств

Чмелевская Наталья Владимировна; Илларионова Елена Анатольевна; Алферова Людмила Николаевна

Сибирский медицинский журнал, 2013, № 5

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В АНАЛИЗЕ КОМБИНИРОВАННЫХ СОЧЕТАНИЙ ЦИННАРИЗИНА И ПСИХОТРОПНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Наталья Владимировна Чмелевская1, Елена Анатольевна Илларионова1, Людмила Николаевна Алферова2 ^Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра фармацевтической и токсикологической химии, зав. — д.х.н., проф. Е.А. Илларионова; 2Иркутское областное бюро судебно- медицинской экспертизы, начальник — к.м.н. А.П. Зайцев)

Резюме. Предложены оптимальные условия качественного анализа комбинированных сочетаний циннаризи-на и психотропных лекарственных средств с использованием метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия анализа: градиентное элюирование в системе перхлорат лития, хлорная кислота и вода — ацетонитрил (МеCN), градиент линейный 800 мкл от 25 до 40%; 700 мкл 40%; 1500 мкл от 40 до 70% ацетонитрила при скорости потока 150 мкл/мин и температуре 35oC.

Ключевые слова: циннаризин, амитриптилин, аминазин, азалептин, галоперидол, трифтазин, неулептил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, градиент, ацетонитрил, лития перхлорат.

mGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ANALYSIS OF THE COMBINED COMBINATION OF CINNARIZINE AND PSYCHOTROPIC DRUGS

N.V. Chmelevskaya', E.A. Illarionova1, L.N. Alferova 2 ('Irkutsk State Medical University; 2Irkutsk Regional Bureau of forensic-medical examination)

Summary. The optimal conditions for qualitative analysis of the combined combination of cinnarizine and psychotropic drugs using the high-performance liquid chromatography have been proposed. Conditions of analysis: gradient elution system of lithium perchlorate, perchloric acid and water [4 M LiClO4 _ 0.1 M HClOJ — HO — acetonitrile (MeCN), the gradient line in 800 mcl of 25 to 40%, 700 mcl 40%, 1500 mcl of 40 to 70% acetonitrile at a flow rate of 150 ml / min and a temperature of 35oC.

Key words: Cinnarizine, amitriptyline, chlorpromazine, azaleptin, haloperidol triftazin, neuleptil, high-performance liquid chromatography method, gradient, acetonitrile, lithium perchlorate.

Циннаризин включен в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях» — приказ Минздрава РФ от 29.12.2000 г. №460 «Об утверждении учетной документации токсикологического мониторинга». Благодаря ноотропной активности циннаризин широко используют в разных областях медицины, в том числе в психиатрической практике [4]. Он часто применяются в комплексной терапии с антипсихотическими нейролептиками и трициклическими антидепрессантами. Встречаются случаи отравления циннаризином в сочетании с психотропными лекарственными средствами амитриптилином, аминазином, азалептином, галопери-долом, трифтазином, неулептилом. В литературе имеются сведения о химико-токсикологическом исследовании биологических объектов на наличие психотропных лекарственных веществ [5,6]. Однако в литературных источниках отсутствуют сведения по химико-токсикологическому исследованию циннаризина в сочетании с психотропными лекарственными веществами. Поэтому разработка методик химико-токсикологического анализа циннаризина в сочетании с психотропными лекарственными средствами амитриптилином, аминазином, азалептином, галоперидолом, трифтазином, неулепти-лом является актуальной проблемой.

Объектом настоящего исследования являются трехи четырехкомпонентные сочетания циннаризина и психотропных лекарственных средств.

Целью настоящей работы являлось разработка методики анализа комбинированных сочетаний цинна-ризина и психотропных лекарственных средств с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Материалы и методы

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова»,

Новосибирск) с ультрафиолетовым спектрофотометрическим детектором, снабженным стальной колонкой (75х2 мм), заполненной сорбентом ProntoSIL-120-5-C18 AQ («Bischoff Analysentechnik und Gerate GmbH», Германия) с размером частиц 5 мкм. Эффективность колонки — 3500 т.т. Температура колонки 35°С. Также использовали центрифугу «Eppendorf» (Германия), рН метр «Анион 4100» (РФ), ультразвуковую баню RK 100 «Bandelin electronic» (Германия).

В качестве стандартных (контрольных) веществ были использованы фармацевтические субстанции циннаризина, амитриптилина, аминазина, азалепти-на, галоперидола, трифтазина, неулептила, содержание основного вещества в которых не ниже 98%. Для приготовления элюентов и растворения образцов использовали: ацетонитрил «особой степени чистоты» (сорт 1) фирмы «Криохром» (Санкт-Петербург); перхлорат лития, хлорная кислота квалификации не ниже «х.ч». Метанол перегоняли перед использованием. Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы «Norganic, Millipore Corporation» (США).

При статистической обработке результатов анализа использовали методы Стьюдента и Фишера [3]. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05.

Результаты и обсуждение

Метод ВЭЖХ достаточно широко применяется в фармацевтическом и химико-токсикологическом анализе для идентификации и количественного определения лекарственных и наркотических веществ [2,7,8].

Для ВЭЖХ анализа смесей циннаризина в сочетании с психотропными лекарственными веществами был выбран обращенно-фазный вариант хроматографии. Оптимальными условиями хроматографирования исследуемых смесей являются: обращенная фаза ProntoSIL

Таблица 1

Длины волн максимального и минимального поглощения определяемых соединений. Растворитель: МеСЫ — 0,2 М ПСЮ4 (pH 2,8)

Определяемое соединение l нм мах, l . , нм мт' l , нм дет'

Азалептин 202, 242, 290 (плечо) 228 210, 230, 260, 280

Аминазин 200 (плечо), 256, 308 226, 280 210, 230, 260, 280

Амитриптиллин 206, 240 200, 230 210, 230, 260, 280

Галоперидол 194, 220 (плечо), 246 232 210, 230, 260, 280

Неулептил 200 (плечо), 232, 270 216, 248 210, 230, 260, 280

Трифтазин 258, 308 224, 282 210, 230, 260, 280

Циннаризин 194 (плечо), 230, 252 222, 236 210, 230, 260, 280

120-5C18AQ («В18сЬоА>>, Германия), градиентное элюирование в системе: Элюент A: 0,2 М лития перхлорат — хлорная кислота (рН 2,8); Элюент Б — ацетонитрил. При разделении стандартных смесей, содержащих циннари-зин, применяли градиентное элюирование: 800 мкл от 25 до 40% Б; 700 мкл 40% Б; 1500 мкл от 40 до 70% Б. Эти элюенты обладают высокой прозрачностью в коротковолновой области ультрафиолетового (УФ) спектра и не содержат УФ-поглощающие примеси, проявляющиеся в виде «лишних» пиков на хроматограмме. Известно, что присутствие в подвижной фазе кислоты (рН 2,8) и высокое содержание ионов лития улучшает хроматографирование азотсодержащих лекарственных веществ [1]. Таким образом, предложенная хроматографическая система является оптимальной для разделения цинна-ризина и психотропных лекарственных средств.

Пики циннаризина, амитриптилина, аминазина, азалептина, галоперидола, трифтазина, неулептила в выбранном элюенте симметричны. Величина коэффициентов асимметрии пиков, близка к единице, что свидетельствует об отсутствии значимых ионообменных взаимодействий.

Для записи УФ-спектров готовили стандартные растворы определяемых соединений с концентрацией 0,2 мг/мл. В качестве растворителя для приготовления стандартных растворов использовали метанол. Спектры регистрировали во время хроматографического анализа после остановки потока вблизи максимума пика (интервал дли волн 190-360 нм, шаг 2 нм). Для удобства использовали нормирование УФ-спектров, так как нормированный УФ-спектр не зависит от концентрации соединения.

Длины волн максимального и минимального поглощения всех исследуемых соединений приведены в табл. 1.

Дополнительные длины волн используются для расчета спектральных отношений, применение которых для идентификации пиков существенно повышает надежность определения. Спектральные отношения для определяемых соединений, рассчитанные как отношение площадей пиков, зарегистрированных при длинах волн 1х и 1, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Спектральные отношения для определяемых соединений.

Растворитель: MeCN- 0,2 М LiClO4, pH 2,8

Определяемое соединение Спектральное отношение, R=S x/S210

230 260 280

Азалептин 0,751 0,674 0,368

Аминазин 0,533 1,128 0,067

Амитриптиллин 0,331 0,099 0,016

Галоперидол 0,456 0,332 0,045

Неулептил 1,113 1,124 0,719

Трифтазин 0,591 1,542 0,088

Циннаризин 0,416 0,457 0,051

Проведена валидационная оценка разработанной методики. Результаты хроматографирования считаются правильными, если соблюдаются условия пригодности хроматографической системы. Для проверки пригод-

ности хроматографической системы была проведена апробация выбранных условий хроматографического анализа модельных смесей циннаризина и психотропных лекарственных веществ.

На рисунке 1 приведена хроматограмма на примере раствора модельной смеси циннаризина, аза-лептина, аминазина, амитриптилина.

Найденные условия использованы для разработки методики анализа комбинированных сочетаний циннаризина и психотропных лекарственных средств в извлечениях из мочи.

Методика качественного определения комбинированных сочетаний циннаризина и психотропных лекарственных веществ методом ВЭЖХ: в колбу вместимостью 100 мл вносят 50 мл мочи, содержащей смесь исследуемых веществ, настаивают в течение 2 часов при комнатной температуре, периодическом перемешивании и обработке на ультразвуковой бане RK 100 «Bandelin electronic» (Германия). Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют

0,1 М раствор хлористоводородной кислоты до рН=4,0, 20 мл хлороформа и затем проводят экстракцию двукратно в течение 20 минут. Хлороформные извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и хлороформом доводят объем раствора до метки. Исследуемый раствор вводят в колонку в объеме 2 мкл. Хроматографируют анализируемый раствор в следующих условиях: градиентное элюирование в системе: Элюент A: 0,2 M лития перхлорат — хлорная кислота (рН 2,8); Элюент Б — ацетонитрил. При разделении стандартных смесей, содержащих циннаризин, применяли градиентное элюирование: 800 мкл от 25 до 40% Б; 700 мкл 40% Б; 1500 мкл от 40 до 70% Б. Температура колонки в процессе разделения 35°С. Скорость потока элюента при всех режимах была 150 мкл/мин.

В табл. 3 указаны времена удерживания исследуемых соединений после извлечения их из мочи в предложенных условиях разделения.

Таблица 3

Времена удерживания разделяемых соединений после извлечения их из мочи

Лекарственное вещество Время удерживания, мин Метрологические характеристики

Азалептин 6,39; 6,41; 6,40; 6,38; 6,39; 6,41 О = 6,40; S ° = 0,005; DX= 0,013; Е = 0,20%

Аминазин 15,67; 15,66; 15,65; 15,66; 15,67; 15,68 О = 15,67; S ° = 0,0045; DX= 0,012; Е = 0,07%

Амитриптилин 14,35; 14,36; 14,34; 14,35; 14,36; 14,35 О = 14,35; S ° = 0,003; DX= 0,008; Е = 0,05%

Галоперидол 11,22; 11,23; 11,22; 11,23; 11,22; 11,23 О = 11,23; S ° = 0,0032; DX= 0,008; Е = 0,07%

Неулептил 10,42; 10,43; 10,44; 10,42; 10,43; 10,42 О = 10,43; S ° = 0,020; DX= 0,051; Е = 0,48%

Трифтазин 15,41; 15,42; 15,41; 15,41; 15,42; 15,43 О = 15,42; S ° = 0,0036; DX= 0,094; Е = 0,06%

Циннаризин 18,35; 18,35; 18,36; 18,35; 18,34; 18,35 О = 18,35; S ° = 0,0026; DX= 0,007; Е = 0,04%

На рисунке 2 приведена хроматограмма кислых извлечений из мочи азалептина, неулептила, галоперидола, амитриптилина, трифтазина, аминазина и циннаризина.

0 4 8 12 16 20

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора смеси — азалеп-тин (0,25 мг/мл), 2 — аминазин (1,25 мг/мл), 3 — амитриптилин (0,25 мг/мл), 4 — циннаризин (0,63 мг/мл) в метаноле.

»МА1

Рис. 2. Хроматограмма кислых извлечений из мочи: 1-азалептин, 2-неулептил, 3-галоперидол, 4-амитриптилин, 5-трифтазин, 6-аминазин, 7- циннаризин.

На основании вышеописанных исследований, можно сделать вывод, что разработанная методика позволяет обнаруживать циннаризин в моче как индивидуально, так и при совместном применении с психотропными лекарственными веществами. Соэкстрактивные компоненты мочи не мешают определению.

Таким образом, разработанная унифицированная методика позволяет использовать метод ВЭЖХ для идентификации циннаризина и психотропных лекарственных веществ в комбинированных сочетаниях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барам Г.И., Грачев С.А. Использование перхлората лития при выделении и анализе олиго- и полинуклеотидов. // Биоорганическая химия. — 1985. — Т. 11. №10. — С. 1420-1422.

2. Булатов Р.М., Малкова Т.Л. Разработка методики обнаружения рисперидона, галоперидола и аминазина при совместном присутствии на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа: материалы Российской научнопрактической конференции. — Пермь, 2009. — С. 65-67.

3. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. — 11-е. изд., доп. — М.: Медицина, 1987. — 336 с.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. — 15 изд., перераб., испр. и доп. — М.: Новая Волна, 2005. — 1200 с.

5. Саломатин Е.М., Николаева Э.Г. Судебно-химический анализ трупного материала на наличие лекарственных и нар-

котических соединений // Судебно-медицинская экспертиза. — 1999. — № 3. — С. 21-22.

6. Томилин В.В., Саломатин Е.М. Современное состояние и перспективы развития химико-токсикологических (судебно-химических) исследований в Российской Федерации // Судебно-медицинская экспертиза. — 2001. — №3. — С. 28-33.

7. Cutroneo P., Santoro M.I. R.M., Kassab N.M., at al. Optimization of the separation of some psychotropic drugs and their respective metabolites by liquid chromatography // J. pharmaceutical and biomedical analysis. — 2006. — Vol. 41, No.

2. — P. 333-340.

8. Esrafili A., Yamini Y., Shariati S. Hollow fiber-based liquid phase microextraction combined with high-performance liquid chromatography for extraction and determination of some antidepressant drugs in biological fluids // Anal. Chim. Acta. — 2007. — Vol. 604, No. 2. — P. 127-133.

Информация об авторах: Чмелевская Наталья Владимировна — аспирант кафедры; Илларионова Елена Анатольевна — заведующий кафедрой, профессор, д.х.н., 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания, 1, ИГМУ, кафедра фармацевтической и токсикологической химии, тел. (3952) 243447, e-mail: illelena@rambler.ru; Алферова Людмила Николаевна — судебно-химический эксперт.

ВИЗУАЛЬНО-ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЖЕЛУДОЧКОВОЙ ЭКСТРАСИСТОЛИИ НА ВОЗНИКНОВЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЛОКАД В СИСТЕМЕ ГИСА-ПУРКИНЬЕ ПРИ ПОСТИНФАРКТНОМ КАРДИОСКЛЕРОЗЕ

Виктор Максимович Яковлев1, Геннадий Яковлевич Хайт 2, Елена Сергеевна Фетисова2 ^Ставропольский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. В.Н. Муравьева;

2Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр, гл. врач — д.м.н., проф. Г.Я. Хайт)

Резюме. Аритмии при постинфарктном кардиосклерозе являются одной из ведущих причин развития внезапной сердечной смерти, и формировании механизмов развития фибрилляции желудочков и аритмической смерти. Однако, дополнительные изменения, вызванные желудочковой экстрасистолией, формирующие электромеханическое ремоделирование электродинамического процесса биоэлектрического поля сердца остаются не изученными. Используя электрокардиографическую систему (ЭКГ-12 отведений, ортогональных ЭКГ и ВКГ по МакФи — Парунгао и векторного сканирования сердца), разработана модель методологии дифференцированной визуально-биофизической топической диагностики желудочковой экстрасистолии, электромеханической диссинхронии и дисфункции миокарда при постинфарктном кардиосклерозе.

Ключевые слова: желудочковая экстрасистолия, компьютерная ЭКГ система, топическая диагностика.