CC BY
33
УДК 616.981.455(571.15)
А.Н.Мокриевич1, В.С.Тимофеев1, Т.Ю.Кудрявцева1, Г.И.Уланова2, С.Б.Карбышева2, Р.И.Миронова1, Г.М.Вахрамеева1, Т.И.Губарева2, В.М.Павлов1, ИА.Дятлов1
ВЫДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕАЗИАТСКОГО ПОДВИДА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА НА ТЕРРИТОРИИ АЛТАЙСКОГО КРАЯ
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск;
2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае», Барнаул
В рамках деятельности референс-центра ФБУН ГНЦ ПМБ по мониторингу за туляремией генетически охарактеризованы 4 изолята туляремийного микроба, выделенные в 2011 г. на территории Алтайского края. Эти бактерии вирулентны для мышей линии BALB/c (DCL меньше 10 КОЕ). Методами однопраймерного ПЦР-типирования и мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных повторов (MLVA) показана принадлежность трех изолятов к среднеазиатскому подвиду, а одного - к голарктическому. Среднеазиатский подвид туляремийного микроба впервые выделен на территории Российской Федерации.
Ключевые слова: Francisella tularensis, subspecies mediasiatica, Алтайский край.
A.N.Mokrievich1, V.S.Timofeev1, T.Yu.Kudryavtseva1, G.LUlanova2, S.B.Karbysheva2, R.I.Mironova1, G.M.Vakhrameeva1, T.I.Gubareva2, V.M.Pavlov1, LA.Dyatlov1
Isolation of Central Asian Subspecies of Tularemia Agent in the Altai Territory
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk; Center of Hygiene and Epidemiology in the Altai Territory, Barnaul
Within the frames of activities attributed to the Reference Center for tularemia monitoring at SRC AMB, genetically identified are 4 isolates of Francisella tularensis, isolated in 2011 in the Altai Territory. These bacteria prove to be virulent for BALB/c mice, DCL being lower than 10 CFU. Using single-primer PCR-typing and MLVA assay distinguished have been the subspecies of the isolates. Three of them refer to the Central Asian subspecies, one - to the Holarctic, the former being isolated in the territory of the Russian Federation for the first time ever.
Key words: Francisella tularensis, subspecies mediasiatica, Altai Territory.
Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция. Возбудитель туляремии, Francisella шШгеп-sis, инфицирует более 250 видов животных и передается человеку множеством способов - прямым контактом с зараженным животным, приемом внутрь контаминированной воды и пищи, аэрогенным путем, а также через укусы клещей, мух и комаров.
Возбудитель туляремии относится к семейству Francisellaceae. Семейство Francisellaceae включает в себя, кроме единственного рода Francisella, симбиотические бактерии рода Wolbachia, выделенные из клещей Argas arboreus, а также Francisella-подобные эндосимбионты, выделенные из клещей видов Amblyomma maculatum, Omithodomsporcinus, Omithodoms moubata и Dermacentor (О. variabilis, D. andersoni, О. ЫШеп, О. Шет, О. occidentalis и О. albipictus) [5].
К роду Francisella относят в настоящее время 2 вида: Е tularensis и Е philomiragia. Однако в последнее время появился целый ряд публикаций, в которых описаны случаи заболевания различных видов животных, вызванные новыми видами фран-циселл: Еrancisella hispaniensis, Еrancsiella asiatica и Еrancsiella noatunensis ^уп. Еrancisella piscicida) [7, 9, 10]. Последовательность гена 168 РНК возбудителей данных инфекций имеет до 99 % гомологии с последовательностью гена 168 РНК Еrancsiella tularensis и до 98 % гомологии с последовательно-
стью гена 168 РНК Еrancsiella philomiragia. Внутри вида Е tularensis различают 4 подвида: Е tularensis subsp. tularensis, Е tularensis subsp. holarctica, Е шШ-rensis subsp. mediasiatica и Е tularensis 8иЬ8р. novicida [5]. Следует отметить, что штаммы подвида mediasi-atica до настоящего времени выделялись только на территории Средней Азии [4].
Для бактерий Е tularensis характерен высокий консерватизм фенотипа (антигенная и биологическая однородность, невысокая биохимическая активность и др.) [4], поэтому детальное расследование вспышек заболевания для выявления источника инфекции в настоящее время затруднительно без комплекса молекулярно-биологических методов, способных однозначно относить выделенные изоляты к определенному подвиду и внутри подвида к определенному генетическому кластеру, что исключительно важно в свете требований современного здравоохранения и реальной угрозы биотерроризма. Для решения этой задачи нами был ранее предложен метод ПЦР-диагностики для подвидовой дифференциации ту-ляремийного микроба, основанный на применении праймера СЫ^ [2]. При этом нарабатывается спектр ампликонов, характерный как для вида Е tularensis в целом, так и для отдельных подвидов туляремийного микроба. Однако данный метод не позволяет внутри подвида отнести исследуемый изолят к определенному генетическому кластеру, что затрудняет как
бб
выявление связи с эндемичными штаммами туляре-мийного микроба, так и локализацию распространения конкретных штаммов в эндемичных по туляремии районах. Для решения данной задачи наиболее перспективно использование метода мультилокус-ного анализа числа тандемных повторов (MLVA). Общепринято для туляремийного микроба использовать с целью внутривидового субтипирования штаммов Е tularensis метод MLVA по 25 локусам [8].
На территории бывшего Советского Союза, в основном, обнаруживаются штаммы подвида Е Ш-larensis subsp. holarctica, однако индивидуальные различия геномов циркулирующих штаммов до сегодняшнего дня изучены мало. Анализ 352 штаммов всех подвидов возбудителя туляремии методом определения вариабельного числа тандемных повторов (VNTR) по четырем локусам позволил выявить 61 генотип и продемонстрировать генотипическую гетерогенность российских штаммов [3].
Целью работы являлось определение подви-довой принадлежности штаммов, поступивших в референс-центр по мониторингу за туляремией ФБУН ГНЦ ПМБ из Центра гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае, методом однопраймерной ПЦР, а также их генотипирование методом MLVA по 25 VNTR-локусам.
Материалы и методы
В работе использованы штаммы Е tularensis:
4 изолята, выделенные на территории Алтайского края, 12 штаммов различного географического происхождения из коллекции «ГКПМ-Оболенск» и 12 штаммов, типичных для сибирских очагов туляремии, полученных из коллекции Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (таблица).
Культивирование бактерий F. tularensis проводили при температуре 37 °С на среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ) с добавлением полимиксина В (Pm). Для определения чувствительности к эритромицину культуры высевали на среду, содержащую эритромицин 50 мкг/мл.
Выделение ДНК осуществляли методом нукле-осорбции на силикагеле в присутствии гуанидин-тиоцианата с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис») из биомассы суточной агаровой культуры.
В работе использовали мышей линии BALB/c. Определение DCL проводили по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [1]. Мышей (по 5 в группе, самцы и самки, возраст 6-8 нед., массой 18-20 г) инфицировали подкожно бактериальной суспензией в дозах 1-101, 1-102 и 1-103 КОЕ/мышь и наблюдали в течение 21 дня.
Для VNTR-анализа использовали 25 пар праймеров (Ft-M1 - Ft-M25), последовательности которых приведены в статьях [6, 8, 11]. Условия проведения ПЦР рассчитывали с помощью пакета программ Vector NTI. Размеры ампликонов определяли по их
Штаммы F. tularensis, использованные в работе
Подвид Штамм Место выделения Источник выделения Год выделения
Природный изолят А-554 Алтайский край, Ельцовский район, с. Мартыново Клещи H. concinna 2011
Природный изолят А-б78 Алтайский край, Первомайский район,. с Покровка Клещи їх. рєгзиїсаШз 2011
Природный изолят А-823 Алтайский край, Шелаболихинский район, с. Молоково Сибирская красная полевка 2011
Природный изолят А-1045 Алтайский край, Алейский район, п. Дружба Клещи В. гєґісиїаґиз 2011
tularensis Schu США Человек 1941
tularensis B399 A-Cole США Человек 1972
tularensis 8859 США Жеребенок 1958
holarctica 9 Московская область Обыкновенная полевка 1948
holarctica 21/400 Московская область Водяная крыса 1949
holarctica 15/10 Алма-Ата Водяная крыса 1942
holarctica 503 Московская область Клещи В. рісґт 1949
holarctica bv. japonica Miura Япония Человек 1975
holarctica bv. japonica Jasoe Япония Человек 1974
mediasiatica 117 Казахстан Клещи Hyalomma sp. 19б0
mediasiatica 120 Средняя Азия Человек 19б8
novicida 112 Юта, США Вода 1955
holarctica I-282 Читинская область Хомяк 1971
holarctica I-305 Читинская область Клещи В. пиґґаШ 1972
holarctica I-329 Республика Бурятия Восточная полевка 1973
holarctica I-346 Республика Бурятия Ондатра 1977
holarctica I-347 Республика Бурятия Ондатра 1978
holarctica I-349 Читинская область Полевка Брандта 1977
holarctica I-365 Республика Бурятия Ондатра 1988
holarctica I-367 Красноярский край Обыкновенная полевка 1989
holarctica I-373 Читинская область Даурская пищуха 1989
holarctica I-382 Республика Бурятия Бурозубка 1991
holarctica I-387 Новосибирская область Бурозубка 2010
holarctica I-388 Новосибирская область Вода 2011
электрофоретической подвижности в 3 % агарозном геле по отношению к подвижности молекулярных маркеров (шаг 20 п.о., BIO-RAD, США) с помощью программы PhotoCaptMw. Фотографирование гелей проводили с использованием системы гель-документирования Vilber Lourmat (Франция). При анализе локусов Ft-M1 и Ft-M25 определяли нуклеотидную последовательность ампликонов.
Результаты и обсуждение
Для первоначальной характеристики свойств четырех культур F. tularensis, выделенных в разных районах Алтайского края в летне-осенний период 2011 г. и поступивших из Центра гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае, была определена вирулентность для мышей и чувствительность к эритромицину. Все штаммы обладали фенотипом EryS и были высоковирулентными (DCL < 10 КОЕ).
Для молекулярно-генетического подтверждения принадлежности исследуемых штаммов к виду F. tularensis был проведен ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных к генам fopA (5' -GCAAATCTAGCAGGTCAAGCAACAGGT-3' и 5' -CATCACCATTTATTGTATAGCACGCGAC-3') и iglC (5-ACAGGTAACAAGTGGCGAGACC-3' и 5-AAACACCCATAAGTTCTGTTGGCTC-3) бактерии F. tularensis. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных с использованием праймера Chi1f и лизатов бактериальных образцов, приведена на рис. 1.
В дорожках всех изолятов присутствуют полосы с размерами ~280 и ~830 п.о., общие для бактерий вида F. tularensis, что подтверждает принадлежность исследуемых штаммов к виду Francisella tularensis. Наличие фрагмента размером ~570 п.о., характерного для голарктического подвида, у культуры А-1045 свидетельствует о ее принадлежности к подвиду hol-arctica. Дорожки с образцами, полученными из лизатов штаммов А-554, А-678, А-823, содержат ампли-кон размером ~950 п.о., специфичный для подвидов mediasiatica и tularensis, но не содержат ампликон размером ~500 п.о., что позволяет отнести изучаемые изоляты к подвиду mediasiatica.
Для выяснения филогенетических связей исследуемых штаммов со штаммами, депонирован-
Рис. 1. Электрофореграмма ампликонов, полученных ПЦР с праймером Chi1f и ДНК F. tularensis:
1, 9 - GeneRluer™ 100 bp Plus DNA Ladder; 2 - subsp. holarctica 15; 5 - subsp. holarctica 503; 4 - А-1045; 5 - А-554; 6 - А-678; 7 - А-823;
8 - subsp. mediasiatica 120
ными в «ГКПМ-Оболенск», в том числе со штаммами из сибирских очагов туляремии, полученными из Иркутского противочумного института, был проведен VNTR-анализ по схеме, предложенной AJohanson и соавт. [8]. По полученным данным было построено филогенетическое дерево на основе метода невзвешенного попарного арифметического среднего (UPGMA), который считается наиболее приемлемым для филогенетических построений (рис. 2). Проведенный анализ подтвердил установленную методом однопраймерного типирования подвидовую принадлежность изучаемых штаммов туляремийного микроба: штамм А-1045 относится к голарктическому, а штаммы А-554, А-678 и А-823 - к среднеазиатскому подвиду.
При этом штамм А-1045 находится в одном кластере со штаммами, типичными для сибирских очагов туляремии, незначительно отличаясь от них по своему VNTR-профилю. Географическое место выделения штамма А-1045 (рис. 3) находится на границе ареала распространения проанализированных штаммов, типичных для сибирских очагов туляремии. Территориальная и генетическая общность этих штаммов, на наш взгляд, позволяет выделить отдельно сибирскую популяцию возбудителя туляремии подвида holarctica.
Штаммы А-554 и А-678 являются генетически идентичными по 25 VNTR-локусам. Штамм А-823 отличается от них по длине трех локусов ^-М3, Ft-М7 и Ft-M20), в том числе гипервариабельного ло-куса Ft-M3, позволяющего выявлять различия между
МЛ/А25
JE
■с
Strain Subspecies Location
117 mediasiatica Kazakhstan
120 mediasiatica Middle Asia
А-554 mediasiatica Altai Te rritory
А-678 mediasiatica Altai Territory
А-823 mediasiatica Altai Te rritory
Jasoe holarctica bv. japonica Japan
М iura holarctica bv. japonica Japan
503 holarctica Moscow region
9 holarctica Moscow region
21/400 holarctica Moscow region
15 holarctica Alma-Ata
I-329 holarctica Buryat Republic
I-382 holarctica Buryat Republic
I-282 holarctica Chita region
I-305 holarctica Chita region
А-1045 holarctica Altai Te rritory
I-367 holarctica Krasnoyarsk Territory
I-373 holarctica Chita region
I-347 holarctica Buryat Republic
I-365 holarctica Buryat Republic
I-346 holarctica Buryat Republic
I-387 holarctica Novosibirsk region
I-388 holarctica Novosibirsk region
I-349 holarctica Chita region
112 novicida USA, Utah
В 399 tularensis USA
Schu tularensis USA
8859 tularensis USA
Рис. 2. Филогенетическое дерево штаммов F. tularensis
Рис.3. Карта распространения штаммов F. tularensis, полученных из ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае» и Иркутского НИПЧИ:
1 - I-346,1-347; 2 - I-382; 5 - I-365; 4 - I-329;
5 - I-349; 6- I-282, I-305, I-373; 7 - I-388;
8 - I-387; 9 - A-823; 10 - A-678; 11 - A-1045; 12 - A-554; 13 - I-367
близкородственными штаммами [8]. При этом различия в длине VNTR-локусов между штаммами А-554, А-678 и А-823 меньше, чем с двумя другими представленными в коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ штаммами среднеазиатского подвида туляремийного микроба (117 и 120). Данное наблюдение демонстрирует наличие в Алтайском крае генетически обособленной популяции F. tularensis subsp. mediasiatica, ареал распространения которой территориально перекрывается с западной частью ареала распространения сибирских штаммов голарктической расы туляремийного микроба (рис. 3).
Полученные данные свидетельствуют о циркуляции двух подвидов туляремийного микроба на территории Алтайского края. Алтайский изолят подвида holarctica генетически близок штаммам, типичным для сибирских очагов туляремии, тогда как три изо-лята подвида mediasiatica отличаются от ранее выделенных на территории Средней Азии штаммов (117 и 120). В литературе отсутствуют данные о выделении культур туляремийного микроба подвида mediasiati-ca на территории Российской Федерации, что может свидетельствовать либо о слабой изученности очагов туляремии, либо о дрейфе среднеазиатских штаммов в сторону Сибири.
Использование 25-локусного VNTR-анализа позволило выявить 25 генотипов среди 28 исследованных штаммов возбудителя туляремии, что существенно превышает разрешение, полученное при анализе 4 локусов [3]. Метод ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера [2] позволил с минимальными затратами определить подвидовую принадлежность свежевыделенных туляремийных культур.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 179 с.
2. Вахрамеева Г.М., Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. Пробл. особо опасных инф. 2011; 1(107):46-8.
3. Водопьянов А.С., Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Пичурина Н.Л. Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие коллекционных штаммов F. tularensis по данным VNTR-анализа их ДНК. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2007; 2:33-40.
4. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина; 1975. 192 с.
Источники 5-11 см. в References
References
1.AshmarinI.P., Vorob’evA.A. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: Medgiz; 1962. 179 p.
2. Vakhrameeva G.M., Lapin A.A., Pavlov VM, Mokrievich A.N., Mironova R.I., Dyatlov I.A. [PCR differentiation of Francisella tularensis subspecies using one primer]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; (107):46-8.
3. Vodop’yanov A.S., Mishan’kin B.N., Pavlovich N.V., Pichurina N.L. [Genotype heterogeneity and geographical diversity of F tularensis collection strains in accordance with VNTR-assay of their DNA]. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2007; 2:33-40.
4. Olsuf’evN.G. [Taxonomy, Microbiology and Laboratory Diagnostics of Francisella tularensis], M.: Meditsina; 1975. 192 p.
5. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. 2005. Vol. 2. P. 199-210.
6. Chanturia G., Birdsell D.N., Kekelidze M., Zhgenti E., Babuadze G., TsertsvadzeN., Tsanava S., ImnadzeP., Beckstrom-Sternberg S.M., Beckstrom-Sternberg J.S., Champion M.D., Sinari S., Gyuranecz M., Farlow J., Pettus A.H., Kaufman E.L., Busch J.D., Pearson T., Foster J.T., Vogler A.J., Wagner D.M., Keim P. Phylogeography of Francisella tularensis subspecies holarctica from the country of Georgia. BMC Microbiol. 2011; 11:139.
7. Huber B., Escudero R., Busse H.J., Seibold E., Scholz H.C., Anda P., Kampfer P., Splettstoesser W.D. Description of Francisella hispaniensis sp. nov., isolated from human blood, reclassification of Francisella novicida comb. nov. and emended description of the genus Francisella. Int. J. Syst. Evol. Micr. 2010; 60(Pt 8):1887-96.
8. Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., Chambers E., Bystrom M., Fox J., Chu M., Forsman M., Sjostedt A., Keim P. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 2004; 186:5808-18.
9. Mikalsen J., Colquhoun D.J. Francisella asiatica sp. nov. isolated from farmed tilapia (Oreochromis sp.) and elevation of Francisella philomi-ragia subsp. noatunensis to species rank as Francisella noatunensis comb. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. [Internet]. Published ahead of print 25 Sep 2009 [cited 19 Dec 2012]. Available from: http://ijsb.sgmjournals.org/ content/early/2009/09/25/ijs.0.002139-0.full.pdf
10. Soto E., Hawke J., Fernandez D., Morales J.A. Francisella sp., an emerging pathogen of tilapia (Oreochromis niloticus) in Costa Rica. J. Fish Dis. 2009; 32:713-22.
11. Vogler A.J., Birdsell D., Wagner D.M., Keim P. An optimized, multiplexed multi-locus variable-number tandem repeat analysis system for geno-typing Francisella tularensis. Lett. Appl. Microbiol. 2009; 48:140-4.
Authors:
Mokrievich A.N., Timofeev V.S., Kudryavtseva T.Yu., Mironova R.I., Vakhrameeva G.M., Pavlov V.M., Dyatlov I.A. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: info@obolensk.org
Ulanova G.I., Karbysheva S.B., Gubareva T.I. Center of Hygiene and Epidemiology in the Altai Territory. Barnaul.
Об авторах:
Мокриевич А.Н., Тимофеев В.С., Кудрявцева Т.Ю., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Павлов B.M., Дятлов ИА. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Московская обл., п. Оболенск. E-mail: info@obolensk.org
Уланова Г.И., Карбышева С.Б., Губарева Т.И. Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае. Барнаул.
Поступила 24.07.12.
б9
