CC BY
57
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ И ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ШТАММОВ ПРИ ОЦЕНКЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ
© Шестакова Н.В.*, Подшивалова О.В.
Вятский государственный университет, г. Киров
Для оценки антагонистических свойств пробиотических микроорганизмов необходим набор энтеропатогенных тест-штаммов, выделенных от больных животных. Статья посвящена комплексному исследованию биологических свойств патогенных и условно патогенных бактерий, выделенных из желудочно-кишечного тракта поросят. Получены изоляты энтеропатогенных бактерий, изучены их биологические свойства, проведена идентификация. Оценена их чувствительность к антагонистическому действию микроорганизмов, входящих в состав современных пробиотических препаратов ветеринарного назначения. По результатам этих исследований сформирован набор тест-штаммов, предназначенный для оценки эффективности пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro.
Ключевые слова: пробиотики, антагонистическая активность, энте-ропатогенные бактерии, тест-штаммы.
В последние годы отмечается повышенное внимание к проблемам профилактики и лечения дисбактериозов, возникающих у молодняка сельскохозяйственных животных, и наносящих значительный экономический ущерб сельхозпредприятиям. Для лечения дисбиотических состояний применяются пробиотики, которые не нарушают биоценоза нормальной микрофлоры, но при этом угнетают развитие патогенных энтеробактерий, повышают про-тивоинфекционную устойчивость, регулируют и стимулируют процессы пищеварения. Наиболее эффективно для лечения кишечной инфекционной патологии у молодняка сельскохозяйственных животных, в частности, у поросят применение пробиотиков.
При выборе пробиотического биопрепарата необходимо предварительно оценить его эффективность в условиях in vitro. Для этого целесообразно использовать культуры энтеропатогенных бактерий, циркулирующих среди животных конкретного сельхозпредприятия. Это обусловливает актуальность
* Аспирант кафедры Микробиологии.
проведения исследований по созданию набора тест-штаммов энтеропатоген-ных бактерий, имеющих эпидемическую значимость в настоящее время.
Целью данной работы является создание набора тест-штаммов, состоящего из патогенных и условно патогенных видов бактерий, которые в настоящее время наиболее часто вызывают кишечные инфекции у поросят.
Материалом для исследования служили культуры энтеробактерий, выделенные из содержимого толстого кишечника больных поросят. Было получено 53 изолята энтеробактерий, у которых были изучены культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства, подвижность, наличие факторов патогенности, устойчивость к антибактериальным препаратам. По результатам комплексного изучения биологических свойств выделенных культур энтеробактерий были идентифицированы следующие виды: Klebsiella ozaenae, Serratia odorífera biogroup 1, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Morganella morganii, Klebsiella oxytoca, Chriseobacterium meningosepticum, Escherichia coli.
Бактерии всех полученных изолятов по методу Грама красились отрицательно, имели форму палочек. При окраске по методу Гинса у 9 изолятов была выявлена капсула: 6 штаммов Klebsiella ozaenae, 1 штамм Klebsiella oxytoca, 1 штамм Serratia odorifera biogroup 1 и 1 штамм Serratia marcescens. Бактерии других видов капсулы не имели. При выращивании на плотных питательных средах изоляты формировали круглые блестящие непрозрачные колонии с ровным краем. Исключение составляли культуры Proteus vul-garis и Morganella morganii, которые на питательном агаре образовывали ползучий рост. Биохимические свойства изучали с использованием коммерческих биохимических тестов OXItest, ENTEROtest, NEFERMtest.
Для определения подвижности бактерий использовали полужидкую питательную среду, содержащую 0,1 % 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ). Микроорганизмы, обладающие подвижностью, в столбике агара росли в виде елочки. Микробы, не обладающие этим признаком, не диффундировали в толщу питательного агара и при посеве культуры рост наблюдался только по ходу укола бактериологической петлей. Было установлено, что подвижностью обладают бактерии 17 изолятов: 5 культур Serratia odorifera biogroup 1, 5 культур Proteus vulgaris, 2 культуры Escherichia coli, 2 культуры Serratia marcescens, 3 культуры Morganella morganii.
Для изучения гемолитической активности изолятов энтеробактерий использовали 5 % кровяной агар и суточные бульонные культуры исследуемых микроорганизмов. В результате проведенных исследований было установлено, что гемолитическими свойствами обладают бактерии 11 изолятов: Klebsiella ozaenae - 1 культура, Chriseobacterium meningosepticum - 2 культуры, Serratia odorifera biogroup 1 - 3 культуры, Escherichia coli - 5 культур. Вокруг колоний этих микроорганизмов формировалась четкая зона гемолиза, хорошо видимая в проходящем свете. Бактерии других изолятов не обладали способностью лизировать эритроциты.
Для определения адгезивных свойств изолятов энтеробактерий использовали фотоколориметрический метод [1]. Большинство культур исследованных бактерий (55 %) обладали средней степенью адгезивности, 20 % были низкоадгезивны, а 25 % были высокоадгезивны. Некоторые результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели адгезии выделенных изолятов энтеробактерий
№ HäcraaT Показатель адгезии, процент Степень адгезии Адгезивность культуры
1 Serratia odorifera biogroup 1 16,7 Средняя Среднеадгезивная
2 Chryseobacterium 22,6 Средняя Среднеадгезивная
3 Klebsiella ozaenae 22,5 Средняя Среднеадгезивная
6 Proteus vulgaris 41,0 Высокая Высокоадгезивная
7 Chryseobacterium meningosepticum 46,7 Высокая Высокоадгезивная
9 Klebsiella oxytoca 78,3 Высокая Высокоадгезивная
10 Proteus vulgaris 19,4 Средняя Среднеадгезивная
17 Chryseobacterium meningosepticum 21,0 Средняя Среднеадгезивная
18 Serratia marcescens 29,2 Средняя Среднеадгезивная
19 Serratia marcescens 33,4 Средняя Среднеадгезивная
23 Serratia odorifera biogroup 1 23,4 Средняя Среднеадгезивная
27 Klebsiella ozaenae 14,7 Низкая Низкоадгезивная
30 Proteus vulgaris 43,3 Высокая Высокоадгезивная
31 Klebsiella ozaenae 41,3 Высокая Высокоадгезивная
33 Escherichia coli 15,0 Низкая Низкоадгезивная
35 Escherichia coli 14,9 Низкая Низкоадгезивная
38 Serratia odorifera biogroup 1 28,7 Средняя Среднеадгезивная
47 Morganella morganii 19,6 Средняя Среднеадгезивная
49 Morganella morganii 33,7 Средняя Среднеадгезивная
53 Escherichia coli 14,9 Низкая Низкоадгезивная
Для оценки резистентности бактерий исследуемых культур к противо-микробным препаратам использовали антибиотики нескольких фармакологических групп: цефалоспорины, пенициллины, аминогликозиды, амфени-колы, макролиды, рифампицины, тетрациклины [2]. Большинство из полученных изолятов были устойчивы к антибактериальному действию двух и более антибактериальных препаратов. 10 исследуемых культур: 3 изолята бактерий рода Chryseobacterium, 2 изолята бактерий Klebsiella ozaenae, 1 изолят вида Proteus vulgaris и 1 изолят вида Escherichia coli не обладали устойчивостью ни к одному антимикробному препарату [3].
На последнем этапе исследований изучили отношение полученных культур энтеробактерий к антибиотическому действию бактерий, выделенных ранее из различных пробиотических препаратов ветеринарного назначения [3].
В опытах было использовано по 5 штаммов: Bifidobacterium bifidum (выделены из препарата «Зоонорм»), Lactobacilluc asidophilus («Acid pack-4-way») Lactococcus lactis («Биотек»), Bacillus subtilis («Olin»), Bacillus licheni-
formis («Olin»). Антагонистическую активность изучали с использованием двуслойной методики (Frederiq).
В таблице 2 приведены данные о выраженности антагонистической активности у штаммов выделенных из коммерческих пробиотических препаратов бактерий в отношении полученных нами культур патогенных и условно патогенных энтеробактерий.
В качестве контроля использовали штамм E.coli C600, обладающий чувствительностью к антагонистическому действию многих микроорганизмов (универсальный тест-штамм).
Таблица 2
Антагонистические свойства пробиотических бактерий по отношению к исследуемым тест-штаммам патогенных и условно патогенных энтеробактерий
Bifidobacterium Lactobacillus Lactococcus Bacillus Bacillus
bifidum acidophilus lactis subtilis licheniformis
1 + + + + +
2 + + + + +
3 + + + + -
Serratia odorifera 4 + + + + +
5 + + + + -
6 + + + + +
7 + + - + -
Serratia marcescens + + + + +
1 + + + + +
2 + + + - -
Proteus vulgaris 3 + + + + +
4 - + + + +
5 + + + + +
Proteus mirabilis + + + + +
1 + + + + +
Klebsiella ozaenae 2 + + + + -
3 + + + + +
4 + + + + +
1 + + + + +
2 + + + + +
3 + + + + -
4 + + + + +
Escherichia coli 5 + + + + +
6 - + + + +
7 + + + + -
8 + + + + +
9 + + + + +
Escherichia coli C600 (контроль) + + + + +
Из таблицы видно, что большинство культур были чувствительны к антагонистическому действию использованных в опытах штаммов пробиотиче-
ских бактерий. Наименьшим спектром антагонистической активности из исследуемых в данной работе пробиотических микроорганизмов обладал штамм Bacillus licheniformis, а штамм Lactobacillus acidophilus подавлял рост всех индикаторных культур энтеробактерий. Полученные результаты позволяют рекомендовать для лечения и профилактики кишечных инфекций у поросят пробиотический препарат на основе штамма Lactobacillus acidophilus как более эффективный для животных конкретного сельхозпредприятия.
На основании этих исследований было сделано заключение о перспективности использования полученного набора энтеробактерий для оценки антагонистических свойств пробиотических препаратов ветеринарного назначения. Выделенные изоляты будут использованы для оценки антагонистической активности пробиотических препаратов, рекомендованных для лечения поросят в животноводческих комплексах Кировской области.
Список литературы:
1. Оборин В.А. Фотоколориметрический метод изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами людей и животных. Методические рекомендации / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин. - Киров: ВятГУ, 2009. - 20 с.
2. Бакулин М.К. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Методические рекомендации / М.К. Бакулин, А.С. Груд-цына, А.Ю. Плетнева. - Киров.: ВятГУ, 2005. - 12 с.
3. Бакулин М.К. Определение антагонистической активности микроорганизмов. Бактериоциногения. Методы фаготипирования бактерий. Определение лизогении: Методические рекомендации / М.К. Бакулин, А.С. Груд-цына, А.Ю. Плетнева. - Киров: ВятГУ, 2005. - 25 с.
