CC BY
69
Химия растительного сырья. 2013. №2. С. 101-106. DOI: 10.14258/jcprm.1302101
УДК 547.477.2:582.284.06:543.429.23
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АГАРИЦИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МИЦЕЛИЯ FOMITOPSIS OFFICINALIS (VILL. FR.:) BOND. ET SING.
© А.Ю. Айрапетова1, Т.И. Громовый
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал Волгоградского государственного медицинского университета, пр. Калинина, 11, Пятигорск, 357532 (Россия), e-mail: asyapgfa@mail.ru
2Московский государственный университет пищевых производств, ул. Талалихина, 33, Москва (Россия), E-mail: tigromovykh@rambler.ru
Из мицелия трутовика лекарственного (Fomitopsis officinalis (Vill Fr.:) Bond. et Sing), полученного твердофазным культивированием, выделена агарициновая кислота и подтверждена ее структура методом ЯМР 1Н и 13С спектроскопии в сравнении со стандартным образцом (SIGMA ALDRICH). Способ выделения - экстракция смесью 95%-ный этиловый спирт - хлороформ, упаривание, выдерживание при температуре -5 °С, очистка. C помощью протонного спектра установлена структура неразветвленного алкильного радикала. Спектр ЯМР 13С и двумерные корреляционные диаграммы {13C, *H} показали наличие гидроксильной (2-й четвертичный атом углерода) и трех карбоксильных (1, 2 и 3-й атомы углерода) групп. Спектр выделенного образца идентичен спектру стандартного образца агарициновой кислоты.
Ключевые слова: мицелий трутовикалекарственного, агарициновая кислота, выделение, структура, спектры ЯМР.
Введение
Интерес к высшим базидиомицетам (Basidiomycetes) как источникам ценной биомассы, содержащей различные биологически активные вещества, непрерывно возрастает. В связи с этим изучение активных метаболитов базидиомицетов и определение их биологического действия представляют важную задачу.
Один из грибов, относящихся к классу базидиальных грибов, паразитирующих на стволах лиственниц, - лиственничная губка (агарик, трут лекарственный, трутовик лекарственный) - Fomitopsis officinalis (Vill.) Bond, et Sing. /Poliporus officinalis Fries, Fomes laricis (Jacg.) Murr/. Основным действующим веществом плодового тела лиственничной губки (Agaricus albus) является агарициновая кислота, оказывающая снотворное, успокаивающее, противотуберкулезное, слабительное и кровоостанавливающее действие [1]. Зарубежные исследователи установили, что агарициновая кислота - это соединение, оказывающее разобщающее действие на дыхание и фосфорилирование, улучшающее проницаемость митохондрий путем взаимодействия с адениннуклеотид транслоказой. Установлено, что агарициновая кислота способна инги-бировать процессы перекисного окисления липидов [2-4].
Известно, что биологически активные вещества высших грибов содержатся не только в базидиоми-цетах, но и вегетативном мицелии гриба, получаемого путем жидкофазного и/или твердофазного культивирования. Сбор плодовых тел в природных условиях лимитирован множеством неконтролируемых факторов - сезонность, погодные условия, техногенное загрязнение окружающей среды. Кроме того, слабая экологическая пластичность вида, массовый неконтролируемый сбор плодовых тел трутовика лекарствен-
АйрапетоваАся Юрьевна - старший преподаватель ного ведут к исчезновению биологического вида.
кафедры фармацевтической химии, кандидат В связи с этим получение биомассы мицелия с по-
фармацевтических наук, e-mail: asyapgfa@mail.ru Громовых Татьяна Ильинична - профессор кафедры биотехнологии, доктор биологических наук, состава в сравнении с природными плодовыми тела
мощью биотехнологии и изучение ее химического состава в сравнении с природными плоде e-mail: tigromovykh@rambler.ru ми является важным преимуществом [5].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Цель настоящего исследования - выделение агарициновой кислоты из мицелия, полученного твердофазным культивированием, и изучение ее структуры.
Экспериментальная часть
Для изучения возможности получения мицелия путем твердофазного культивирования в качестве растительных субстратов использовали кору и древесную зелень пихты, лиственничные опилки, гидролизный лигнин и зерно злаков. Исходное сырье измельчается на лабораторном измельчителе шнекового типа и методом квартования отбирается средняя проба, которую затем фракционируют на ситах. Для исследований необходимо использовать сырье размером 1,5-2,0 мм, так как очень маленькие частицы упаковываются очень тесно, образуя материал с высокой плотностью и узкими порами, что снижает скорость процесса биодеструкции. После чего одна часть субстратов увлажняется дистиллированной водой, другая - 1% раствором сульфата аммония. Добавление 1% раствора соли NH4NO3 в субстрат ингибирует колонизацию субстрата колонией гриба, но мицелий формируется более высокий и плотный. Стерилизация субстратов осуществляется в автоклаве при 1 атмосфере в течение часа дважды.
Инокуляция субстратов проводится агаровым блоком семисуточной культурой продуцента диамет-ром 8 мм, выращенной на сусло-агаре и переносится в центр чашки Петри с субстратами. Учет результатов проводится измерением диаметра колонии гриба [6].
Для выделения агарициновой кислоты использовали мицелий штамма Tyv-2006 Fomitopsis officinalis, полученного твердофазным культивированием. Образец мицелия экстрагировали многократно смесью 95%-ный этиловый спирт - хлороформ в аппарате Сокслета. Полученный экстракт упаривали. Отделение агарициновой кислоты проводили выдерживанием экстракта при температуре -5 °С в течение 12 чс последующим отделением осадка кислоты и его очисткой. Выход агарициновой кислоты составил 5,8% в пересчете на массу сухого мицелия [7].
Подтверждение структуры агарициновой кислоты (I) было проведено с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [8]. Регистрацию ЯМР спектров проводили на спектрометре UNITY-300 «Varian». Для получения спектров ЯМР использовалась стандартная 2-импульсная последовательность с последующим Фурье преобразованием. Химические сдвиги ЯМР сигналов определялись относительно сигнала остаточных протонов соответствующего дейтерорастворителя (ДМСО).
Результаты и их обсуждение
Наличие в спектре ЯМР :Н (рис. 1) трехпротонного триплетного сигнала при 0,86 м.д. однозначно свидетельствует о наличии только одной концевой метальной группы и, следовательно, об отсутствии ветвления алкильного радикала. Сигнал изолированной СН2 группы в первом положении должен наблюдаться в виде двух дублетов, а сигнал СН2 группы в четвертом положении - в виде двух мультиплетов вследствие наличия двух хиральных центров при втором и третьем атомах углерода. Действительно, 1-СН2 группа резонирует при 2,90 и 2,50 м.д., а 4-СН2 группа - при 1,64 и 1,42 м.д. Протон СН группы в третьем положении представлен дублет-дублетным сигналом из-за наличия спин-спинового взаимодействия с соседней диастереотопной 4-СН2 группой.
Сигналы остальных СН2 групп расположены в районе 1,05-1,35 м.д. с общей интегральной интенсивностью, равной (CH2)i4. Таким образом, протонный спектр на первый взгляд соответствует структуре I.
COOH
COOH
H3C—CH2-(CH2)13-CH^CH—C—CH^COOH (I)
319 18 3 4 2 3 2 1 2
OH
Тем не менее, поскольку спектр регистрировался в диметилсульфоксиде, то сигналы кислых протонов СООН и ОН групп не наблюдаются вследствие межмолекулярного обмена с протонами воды, содержащейся в ДМСО. Для того чтобы наглядно показать наличие гидроксильной и трех карбоксильных групп были получены спектры ЯМР 13С как с развязкой, так и без развязки от протонов, а также двумерные {13C, :H} корреляционные спектры с использованием констант непрямого спин-спинового взаимодействия 13С-1Н (HETCOR LR).
Рис. 1. Спектр ЯМР 1Н агарициновой кислоты в ДМСО^б
Как следует из анализа спектров ЯМР 13С (рис. 2, 3) и двумерных корреляционных диаграмм (рис. 4, 5), сигналы ядер углерода в районе 171,50-175,00 м.д. принадлежат трем СООН группам: сигнал при 175,50 м.д. относится к углероду 2-СООН (дает кросс-пики с одним из протонов 1-СН2 группы и 3-СН протоном), при 173,48 м.д. к углероду 3-СООН (кросс-пики с протонами 3-СН и 4-СН2 групп) и при 171,58 м.д. к углероду группы СООН (триплет в спектре без развязки от протонов и кросс-пики с 1-СН2 группой в HETCOR LR диаграмме) (рис. 4). Сигнал при 75,02 м.д. однозначно свидетельствует о наличии четвертичного атома углерода 2-СОН (наличие в корреляционной диаграмме кросс-пиков с протонами 1-СН2 и 3-СН групп). Сигнал при 53,57 м.д. принадлежит 3-С ядру (дублет в спектре без развязки с J = 131,5 Гц) и сигнал углерода 1-СН2 группы находится при 40,82 м.д., сигнал СН3 - при 13,83 м.д., 18-СН2 - при 22,07, а все оставшиеся СН2 группы проявляются в районе 22,00-31,30 м.д.
Рис. 2. Спектр ЯМР 13С соединения I с полной развязкой от протонов
Я} 03
«л чг го со о
w П п
О
1 J
175 . О
174. О
13
1 1 ' 1 173.0
172 . О
--' ■ ^^ВЩЩЧрЦЩЩЧ^^ИЩ^ЩР«»)»).!
ррт 7 5,4 ? 4. 5
|11I<|I|IF||IF1|MM|IIFI^I4|II
55.0 s 4 , 5 53.0 рргп
Рис. 3. Спектр ЯМР 13С соединения I без развязки от протонов
Рис. 4. Корреляционная диаграмма НЕТСОЯ ЬЯ для сигналов слабопольной части спектра 13С агарициновой кислоты
75 70 65 60 55 50 45 40 35
СРРт)
Рис. 5. Корреляционная диаграмма НЕТСОЯ ЬЯ
13
для сигналов средней части спектра С агарициновой кислоты
Выводы
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено наличие агарициновой кислоты в образца мицелия штамма Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Vill. Fr.:) Bond. et Sing., полученного твердофазным культивированием в количестве 5,8%. На основании анализа спектров ЯМР 1Н и 13С полностью подтверждена структура агарициновой кислоты, выделенной из вегетативного мицелия, так как спектр стандарта оказался идентичен спектру агарициновой кислоты, выделенной из мицелия.
Список литературы
1. Белова Н.В. Перспективы использования биологически активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. 2004. Т. 38, №2. С. 1-4.
2. Chavez E. The effect of agaric on citrate transport in rat liver mitochondria // Life Sciences. 1978. Vol. 23, N14. Pp. 1423-1429.
3. Garcia N., Zazuete C., Pavon N., Chavez E. Agaric acid induces mitochondrial permeability transition through its interaction with the adenine nucleotide translocase. Its dependence on membrane fluidity // Mitochondrion. 2005. N5. Pp. 272-281.
4. Сергеева E.O., Айрапетова А.Ю., Айрапетова K.A. Изучение антиоксидантной активности агарициновой кислоты // Вестник Самарского государственного университета. 2010. №4. С. 2097-2099.
5. Сидоренко М.Л. Биотехнология трутовика лекарственного // Актуальные проблемы технологии живых систем: мат. II междунар. науч.-техн. конф. молодых ученых. Владивосток, 2007. С. 73-76.
6. Громовых Т.И., Ковалева Г.К. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Vill. Fr.:) Bond. et Sing // Вестник КрасГАУ. 2009. №1. С. 68-75.
7. Патент 2330676 (РФ). Способ получения агарициновой кислоты / А.Ю. Айрапетова, П.А. Цуканова, М.В. Гаврилин, Т.А. Шаталова. 10.08.2008.
8. Хеберлен У., Меринг М. ЯМР высокого разрешения в твердых телах. М., 1980. 325 с.
Поступило в редакцию 5 апреля 2012 г.
После пераработки 7 мая 2013 г.
Ayrapetova A.U.1*, Gromovih T.I.2 AN ISOLATION OF AGARIC ACID FROM THE MYCELIUM OF FOMITOPSIS OFFICINALIS (VILL. FR. :) BOND. ET SING., OBTAINED BY SOLID-PHASE CULTIVATION
1Piatigorsky Medical and Pharmaceutical Institute, a branch of the Volgograd State Medical University, pr. Kalinina,
11, Pyatigorsk, 357532 (Russia), e-mail: asyapgfa@mail.ru
2Moscow State University of Food Production, ul. Talalikhina, 33, Moscow (Russia), e-mail: tigromovykh@rambler.ru
Agaric acid (2-hydroxy-1,2,3-nonadecane tricarboxylic acid) - a biologically active compound is isolated by the extraction with a mixture of ethyl alcohol 95% and chloroform, and subsequent purification of the mycelium of Fomitopsis officinalis (Vill Fr.:) Bond. et Sing), obtained by solid-phase cultivation. Its content in the mycelium is 5,8%. The study of the structure of the selected sample is performed by 1H and 13C NMR spectroscopy. The spectra of selected samples and the standard agaric acid (Sigma Aldrich) are completely identical. Consequently, the mycelium Fomitopsis officinalis, along with the fruit bodies of tinder, can be used as a source of biologically active compounds, the main of which is agaric acid.
Keywords: Fomitopsis officinalis mycelium, agaric acid, isolation, structure, NMR spectra.
* Corresponding author.
106
A.ro. AHPAnETOBA, T.H. TPOMOBMX
References
1. Belova N.V. Mikologiia ifitopatologiia, 2004, vol. 38, no. 2, pp. 1-4. (in Russ.).
2. Chavez E. Life Sciences, 1978, vol. 23, no. 14, pp. 1423-1429.
3. Garcia N., Zazuete C., Pavon N., Chavez E. Mitochondrion, 2005, no. 5, pp. 272-281.
4. Sergeeva E.O., Airapetova A.Iu., Airapetova K.A. Vestnik Samarskogo gosudartvennogo universiteta, 2010, no. 4, pp. 2097-2099. (in Russ.).
5. Sidorenko M.L. Aktual'nye problemy tekhnologii zhivykh sistem: materialy II mezhdunarodnoi nauchno-tekhnicheskoi konferentsii molodykh uchenykh. [Actual problems of the technology of living systems: Proceedings of the II International Scientific and Technical Conference of Young Scientists.]. Vladivostok, 2007, pp. 73-76. (in Russ.).
6. Gromovykh T.I., Kovaleva G.K. VestnikKrasGAU, 2009, no. 1, pp. 68-75. (in Russ.).
7. Patent 2330676 (RU). 10.08.2008. (in Russ.).
8. Kheberlen U., Mering M. IaMR vysokogo razresheniia v tverdykh telakh. [High-resolution NMR in solids]. Moscow, 1980, 325 p. (in Russ.).
Received April 5, 2012 Revised May 7, 2013
