CC BY
107
2012 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 3 Вып. 1
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 577.112
Е. Г. Богомолова, М. Н. Верпов, Я. А. Дубровский, Е. С. Кораблева, В. Н. Кокряков
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИМИКРОБНЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ГОЛУБОГО ПЕСЦА А1ОРЕХ ЬАвОРШ
Введение
Антимикробные белки и пептиды являются частью механизмов врожденного иммунитета, который обеспечивает немедленную реакцию организма на проникшую инфекцию [1, 2]. Уже не вызывает сомнений ведущая роль в инактивации микроорганизмов и оболочечных вирусов группы разнообразных по химической структуре пептидов (дефенсины, кателицидины, цекропины, магейнины и др.) и белков (лизоцим, серпроцидины, бактерицидный белок, увеличивающий проницаемость, лактоферрин, пероксидазы и др.), продуцируемых фагоцитами и эпителиальными клетками человека и животных [2-7]. Данные агенты действуют посредством нарушения целостности клеточной мембраны и ингибирования метаболических процессов микроорганизмов. Многие антимикробные белки и пептиды способны ингибировать провоспалитель-ную активность липополисахаридов грамотрицательных бактерий [2, 4-6].
Изучение антимикробных катионных белков и пептидов как молекулярных факторов врожденного иммунитета имеет, в частности, большое практическое значение в плане их потенциального применения в медицине как нового класса антибиотиков, препаратов для борьбы с сепсисом. Также интересны фундаментальные исследования по выявлению спектров антимикробных агентов, содержащихся в лейкоцитах крови различных животных, их сравнения у эволюционно близких видов [2, 3, 7].
Голубой песец составляет основу пушного промысла в северных регионах, а также является объектом клеточного разведения. В условиях интенсификации звероводства усиливается негативное влияние стресс-факторов различной природы, сопровождающееся заболеваниями животных и снижением их продуктивности. В последнее время получают популярность работы, связанные с исследованием влияния гуморального звена иммунной системы при заболеваниях пушных зверей. В частности, Л. В. Аникие-ва и соавторы [8] в своей работе показали важную роль факторов врожденного иммунитета при токсаскаридозе песцов на примере лизоцима, бета-лизинов, и компонентов комплемента. Известен также ряд других работ, косвенно свидетельствующих о наличии лизоцима в сыворотке крови голубого песца, показанного по ферментативной
© Е. Г. Богомолова, М. Н. Берлов, Я. А. Дубровский, Е. С. Кораблева, В. Н. Кокряков, 2012
активности [9-11]. Выделение белка и его характеристика в этих работах не проводились. В различных базах данных белков (UniProt, Protein Data Bank) сведения о лизо-циме песца также отсутствуют. Кроме того, не удалось найти в литературе работ, описывающих другие антимикробные белки и пептиды из лейкоцитов этого вида. В связи с этим было особенно интересно изучить спектр антимикробных белков, присущих голубому песцу. В настоящей работе впервые выделен в гомогенном виде лизоцим, а также выделен и охарактеризован антимикробный белок, предположительно принадлежащий к группе NK-лизинов.
Методы исследования
Выделение белков. Белки выделяли из лейкоцитарной фракции крови голубого песца Alopex lagopus путем двух последовательных экстракций 10%-ной уксусной кислотой. Лейкоциты были получены из крови песца путем гемолиза эритроцитов 0,85% NH4Cl с последующим центрифугированием при 400 g 10 мин. Суспензия лейкоцитов в дистиллированной воде хранилась при температуре -20 °С. Для получения экстрактов материал разморозили и центрифугировали в течение 40 мин при 10 000 g. Затем к осадку добавили 10%-ную уксусную кислоту (из расчета 4 мл на 1 г клеток), гомогенизировали с помощью гомогенизатора Поттера (стекло-тефлон) и инкубировали 90 мин при температуре 4 °С, после чего центрифугировали в течение 40 мин при 10 000 g. Отобранный супернатант представляет собой первый экстракт.
К осадку прибавили то же количество 10%-ной уксусной кислоты, гомогенизировали с помощью гомогенизатора Поттера и инкубировали 12 ч при температуре 4 °С, после чего центрифугировали в течение 40 мин при 10 000 g. Отобранный после этого супернатант представляет собой второй экстракт.
Очистка белков. Для выделения индивидуальных фракций антимикробных белков использовали следующие хроматографические методы. Гель-фильтрация применялась для разделения белкового материала экстрактов. Использовали колонку длиной 83 см, диаметром 2,2 см, заполненную биогелем Р-10, уравновешенным 5%-ной уксусной кислотой. Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография (офВЭЖХ) проводилась на колонке C18 (Agilent Technologies Zorbax SB) длиной 15 см, диаметром 0,46 см, с диаметром гранул 5 мкм. Разделение проводили на хрома-тографической системе Beckman System Gold. Использовали следующую систему растворителей: А — 0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ) в высокоочищенной воде, В — 0,1%-ная ТФУ в ацетонитриле; они подавались градиентно, как описано в таблице.
Схема постановки градиента растворителя
Время разделения, мин А, % В, %
0 100 0
10 80 20
60 30 70
75 0 100
Ионообменная хроматография использовалась на заключительных стадиях очистки лизоцима песца. Пробу наносили на колонку длиной 4 см, диаметром 1,3 см, за-
полненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную 0,02 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,65). Для элюции белков применяли линейный градиент концентрации NaCl 0,2-0,8 М в 0,02 М натрий-ацетатном буфере (рН 4,65).
Определение антимикробной активности белков. Для анализа антимикробной активности применяли два вида антимикробных тестов: метод наложения гелей и метод радиальной диффузии [12] против грамположительных и грамотрицательных бактерий — Listeria monocytogenes (штамм EGD) и Escherichia coli (штамм ML-35р) соответственно и гриба Candida albicans (штамм 820). При использовании метода наложения гелей на чашки Петри, залитые агарозой, содержащей клетки микробов, помещали гели после проведения электрофореза в кислой буферной системе (методика приведена ниже). Согласно методу радиальной диффузии, делали в агарозе лунки диаметром 4 мм, куда вносили анализируемые пробы. В качестве положительного контроля использовали ультрафильтрат экстракта из лейкоцитов крови кролика, содержащий дефенсины, а в качестве отрицательного — 0,01%-ную уксусную кислоту. В обоих методах чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 3 ч, после чего добавляли агарозу с питательной средой и инкубировали 18 ч при температуре 37 °С. В результате размножения микробов агароза мутнеет. Зоны ее просветления (зоны ингибирова-ния роста) являются участками, на которых бактерии не выросли, и свидетельствуют о проявлении пробой антимикробной активности.
Для оценки минимальной ингибирующей концентрации использовали результаты четырех независимых экспериментов. Данные приводятся как среднее арифметическое ± стандартная ошибка.
Электрофорез. Спектр белков в различных фракциях, а также гомогенность полученных препаратов оценивали двумя электрофоретическими методами: электрофорез в кислой буферной системе (5%-ная уксусная кислота) в 12,5%-ном ПААГ в присутствии 6,25 М мочевины по методу С. Паньима и Р. Челкли [13] и в 16%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по методу Г. Шаггера и Г. фон Джагова [14].
Выявление углеводного компонента в белковых пробах. Для анализа присутствия углеводного компонента в интересуемой пробе использовали окраску гелей реактивом Шиффа после проведения электрофореза в кислой буферной системе и окисления гли-копротеинов иодной кислотой [15]. В качестве положительного контроля использовали препарат гликопротеина — лактоферрин человека, а в качестве отрицательного — лизоцим человека.
Выявление дисульфидных связей. Для выявления дисульфидных связей в анализируемом белке проводили окисление пробы надмуравьиной кислотой [16] и алкили-рование [17].
В случае окисления надмуравьиной кислотой пробы инкубировались на ледяной бане с реагентом (450 мкл муравьиной кислоты и 50 мкл 30%-ного пероксида водорода, предварительно инкубированных 1 ч при комнатной температуре) в течение 2 ч. Затем избыток надмуравьиной кислоты удаляли двумя промывками дистиллированной водой, пробы сушили с помощью аппарата SpeedVac Savant. Результаты анализировали электрофорезом в кислой буферной системе. В качестве положительного контроля использовали белок, содержащий 4 дисульфидные связи — лизоцим человека.
Алкилирование проводилось с использованием восстанавливающего (0,025 M ди-тиотреитол, 0,1 M Трис-HCl, pH 7,8) и алкилирующего (0,078 M иодоацетамид, 0,1 M
Трис-HCl, pH 7,8) реагентов. Проба, высушенная с помощью аппарата SpeedVac Savant, перерастворялась в 10 мкл 6 М мочевины в 0,1 M Трис-HCl, pH 7,8. Затем к ней добавляли 5 мкл восстанавливающего раствора и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После этого добавляли 5 мкл алкилирующего раствора и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Далее для инактивации не прореагировавшего иодоцетамида добавляли 20 мкл восстанавливающего раствора и также инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Полученную смесь очищали от реагентов на картридже ZipTip C18 и высушивали с помощью аппарата SpeedVac Savant. Результаты опыта анализировали с помощью масс-спектрометрического анализа.
Масс-спектрометрический анализ. Образцы для проведения анализа растворяли в 10 мкл 0,1%-ной ТФУ в воде. На мишень наносили 0,5 мкл матрицы (синапиновой кислоты) (20 мг/мл в 0,1%-ной ТФУ в 50%-ном ацетонитриле) и 0,5 мкл образца. Затем высушили на воздухе.
Использовали времяпролетный масс-спектрометр Axima Performance с источником MALDI, оснащенном УФ-лазером (337 нм). Детектировали положительные ионы в диапазоне m/z от 4000 до 20 000 Д. Масс-спектры регистрировали при помощи программы MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). В качестве внешнего стандарта использовали смесь, содержащую пептид LL-37 (кателицидин человека), цито-хром с лошади и лизоцим человека (МН + 4494,4, 12359,1 и 14701,6 Д соответственно). Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF Axima, проводили в программе MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония).
Определение ферментативной активности лизоцима. Ферментативную активность лизоцима определяли по гидролизу клеточной стенки бактерии Micrococcus lysodeikticus [18]. В качестве субстрата использовали лиофилизированный препарат бактерий ("Sigma", США). При определении оптимума рН ферментативной активности использовали 0,1 М натрий-цитратный буфер с различными значениями рН (в диапазоне 3,0-6,2).
Результаты исследования
С помощью описанных методов удалось выделить индивидуальные фракции двух антимикробных белков из лейкоцитов крови голубого песца Alopex lagopus. Один из выделенных белков — лизоцим был идентифицирован по электрофоретической подвижности и характерной ферментативной активности — способности лизировать клеточную стенку чувствительных бактерий Micrococcus lysodeikticus. Второй выделенный белок предположительно является NK-лизином, однако наши данные не позволяют утверждать это с уверенностью, поэтому в дальнейшем он обсуждается как «неизвестный белок». Были охарактеризованы некоторые физико-химические и функциональные свойства выделенных белков.
Лизоцим. Данный белок был выделен из первого экстракта. Для очистки использовали сначала гель-фильтрацию на биогеле Р-10, затем высокоэффективную жидкостную хроматографию (рис. 1, а) для выделения лизоцима в гомогенном виде. Мы получили несколько фракций, содержащих лизоцим и незначительное количество примесных белков, для удаления которых использовали ионообменную хроматографию. Для обессоливания полученного препарата осуществляли диализ против дистиллированной воды. Гомогенность лизоцима оценили методами электрофореза в кислой среде и в присутствии SDS (рис. 2, а и 2, б).
60
Время, мин
Рис. 1. Хроматограммы разделения проб с помощью офВЭЖХ: а — проба, полученная из первого экстракта; б — проба, полученная из второго экстракта. По оси абсцисс — время разделения в минутах; по оси ординат — значение поглощения проб при длине волны 225 нм.
46
29
20
14
6
3
1 маркер молекулярных масс 2
Рис. 2. Электрофореграммы очищенного лизоцима: а — после проведения электрофореза в кислой буферной системе; б — после проведения электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. 1, 2 — порядковые номера фракций лизоцима песца. На рис. 1, б приведены значения молекулярных масс стандартных белков в кД.
Был определен оптимум рН ферментативной активности лизоцима песца (рис. 3), равный 5,8. В качестве сравнения использовали лизоцим человека, его рН-оптимум также оказался равным 5,8. Согласно литературным данным, лизоцим человека обладает оптимальной ферментативной активностью при рН 6,0 [19], что близко к полученному нами значению. Известны лизоцимы, содержащиеся в желудочном соке некоторых животных, обладающие оптимальной активностью при существенно меньших значениях рН, что говорит о значительной вариабельности рН-оптимума лизоцимов. Полученный результат показывает, что гомологичные белки из лейкоцитов крови голубого песца и человека обладают сходными ферментативными свойствами.
С помощью антимикробного теста методом радиальной диффузии была определена минимальная ингибирующая концентрация данного белка против L. monocytogenes, равная 6,0 ± 1,2 мкг/мл (0,42 ± 0,08 мкМ); против E. coli вплоть до концентрации 2 мг/мл (140 мкМ) лизоцим не активен.
« 100
о
и
J
i« ffi о ц м
Ü а а
03 о S
80
S 60
в4
40
20
и 1 2 3 4 5 6 7
рн
Рис. 3. Результат опытов по определению минимальной ингибирующей концентрации лизоцима против L. monocytogenes За минимальную ингибирующую принималась концентрация, соответствующая точке пересечения экспериментальной кривой с осью абсцисс [8].
100 г
14 635,4
80
60
40
20
0 L
14 000
14 500
15 000
15 500
Рис. 4. Масс-спектр лизоцима песца По оси абсцисс — отношение молекулярной массы (Д) к заряду иона (m/z); по оси ординат — интенсивность сигнала, в процентах от максимальной (то же для рис. 7 и 9). Значение m/z 14 635 для однозарядного иона соответствует значению молекулярной массы 14 634 Д.
С помощью масс-спектрометрического анализа (рис. 4) удалось определить молекулярную массу выделенного лизоцима песца, оказавшуюся равной 14 634 Д.
Выделенный неизвестный антимикробный белок. Данный белок выявлен как в первом, так и во втором экстрактах. Полученные экстракты были последовательно подвергнуты гель-фильтрации и офВЭЖХ. Ниже представлены результаты разделения с помощью офВЭЖХ проб из первого и второго экстрактов (см. рис. 1, а и 1, б). На первой хроматограмме (см. рис. 1, а) следует отметить пики, соответствующие лизоциму и исследуемому в дальнейшем белку. Лизоцим элюировался на 35-37 мин, что соответствует 45-47% ацетонитрила, а исследуемый белок — на 46-53 мин при разделении проб из пер-
27
17«»
6,5 А
51 31 маркер мол. масс 52
Рис. 5. Электрофореграммы фракций, полученных с помощью офВЭЖХ: а и б — пробы, полученные из первого экстракта; в и г — пробы, полученные из второго экстракта; а и в — после проведения электрофореза в кислой буферной системе; б и г — после проведения электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Числами обозначены номера проб в порядке их выхода с хроматографической колонки (46-54 — порядковые номера фракций антимикробного белка). На рис. 5, б и 5 г приведены значения молекулярных масс стандартных белков в кД.
вого экстракта (57-63% ацетонитрила) и 51-54 мин при разделении проб из второго экстрактов (61-64% ацетонитрила) (см. рис. 1, а и 1, б). Поскольку время задержания белков на колонке при данном способе разделения коррелирует со степенью гидрофобности, можно сделать вывод о высокой гидрофобности выделенного нами белка.
Результаты разделений оценивали методами электрофореза в кислой буферной системе и в присутствии SDS (рис. 5), а затем проводили антимикробный тест методом радиальной диффузии против E. coli и L. monocytogenes (рис. 6). Согласно этому эксперименту наибольшую антимикробную активность проявляют пробы выделенного неизвестного белка, причем как против грамотрицательной, так и против грамполо-жительной бактерий.
Рис. 6. Результаты антимикробного теста фракций, полученных с помощью офВЭЖХ, методом радиальной диффузии против E. coli (а) и L. monocytogenes (б): Числами обозначены номера проб в порядке их выхода с хроматографической колонки
(46-50 — порядковые номера фракций белка).
На геле после электрофореза в кислой среде в присутствии мочевины выделенный из обоих экстрактов белок выглядит в виде одной полосы, существенно опережающей лизоцим человека по подвижности к катоду. Поскольку разделение белков данным методом происходит не только по их молекулярной массе, но и в зависимости от величины их положительного заряда, можно сделать вывод, что данный белок представляет собой высококатионную молекулу. Интересно, что после электрофореза в присутствии SDS белок, выявленный в первом экстракте, разделяется на две полосы на уровне около 18 и 9 кД с заметной зоной между ними, что не наблюдается в случае белка из второго экстракта. Такая картина может иметь место вследствие того, что белки из первого и второго экстрактов являются изоформами, одна из которых (выделенная из первого экстракта) склонна к димеризации.
По данным масс-спектрометрического анализа (рис. 7) удалось определить молекулярную массу выделенного нами белка, она оказалась равной 9035 Д. Для опыта использовали препарат, полученный после разделения пробы из второго экстракта.
8900 9000 9100 9200 9300 m/z
Рис. 7. Масс-спектр изучаемого белка Значение m/z 9036 для однозарядного иона соответствует значению молекулярной массы 9035 Д.
Этот белок был проанализирован для выявления наличия в его структуре углеводного компонента. Эксперимент показал, что углеводный компонент в выделенном белке отсутствует (данные не приведены).
Выделенный белок проанализировали с целью обнаружения присутствия в нем дисульфидных связей. Результат эксперимента по окислению белка надмуравьи-ной кислотой анализировали с помощью электрофореза в кислой буферной системе (рис. 8). Как видно на электрофореграмме, после окисления выделенный белок существенно изменил электрофоретическую подвижность и разделился на три полосы. Согласно данному эксперименту, в состав выделенного белка входят серосодержащие
Рис. 8. Электрофореграмма после электрофореза в кислой буферной системе белков, подвергнутых окислению
надмуравьиной кислотой: 1 — нативный лизоцим человека; 2 — нативный исследуемый белок; 3 — исследуемый белок после окисления; 4 — лизоцим человека после окисления.
аминокислотные остатки, а наличие нескольких полос может отражать различную степень окислительных модификаций белка.
Для определения количества дисульфидных связей мы провели алкилирование исследуемого белка. Результат оценивали масс-спектрометрически (рис. 9). С помощью этого эксперимента нам удалось определить, что в состав изучаемого белка входят три дисульфидные связи. При восстановлении дисульфидных связей и алки-лировании белка иодоацетомидом молекулярная масса возрастает на 58 Д в расчете на один остаток цистеина. Молекулярная масса нативного белка — 9035 Д (см. рис. 7), модифицированного — 9383 Д (см. рис. 9), разница составляет 348 Д, что соответствует
шести остаткам цистеина в молекуле. Можно предположить, что они образуют три ди-сульфидные связи, так как разница в 348 Д соответствует именно такой ситуации, хотя величина возможной погрешности измерения и не позволяет считать это доказанным. Тем не менее в большинстве секретируемых белков и во всех известных антимикроб-
9397,1
9250 9300 9350 9400 9450 9500 9550 9600 m/z
Рис. 9. Масс-спектр алкилированного антимикробного белка
0,45 0,40 0,35 0,30
ных белках и пептидах лейкоцитов остатки цистеинов замыкаются дисульфидными связями [1-3, 7], что позволяет нам допустить наличие трех дисуль-фидных связей в молекуле изучаемого белка.
0
-0,05
0,10 0,05
200 220 240 260 280 300 320 340
Длина волны, нм
Рис. 10. Спектр поглощения изучаемого белка
С помощью спектрофотометра Вескшап DU 720 был определен спектр поглощения изучаемого белка в диапазоне длин волн от 200 до 320 нм (рис. 10). В диапазоне 200-240 нм наблюдается нисходящее плечо пика, максимум которого находится в области менее 200 нм, что
характерно для молекул белковой природы. Незначительные изменения оптической плотности в интервале 230-300 нм говорят об отсутствии в структуре белка остатков таких ароматических аминокислот, как тирозин и триптофан, а также об отсутствии или незначительном количестве фенилаланина, поскольку боковые группы данных аминокислот обладают максимумами поглощения в указанном диапазоне.
С помощью антимикробного теста методом радиальной диффузии мы определили минимальные ингибирующие концентрации данного белка. Против E. coli проба активна, начиная с концентрации 1,7 ± 0,3 мкг/мл (0,19 ± 0,3 мкМ), а против L. monocytogenes — с 2,4 ± 0,7 мкг/мл (0,27 ± 0,8 мкМ). Против гриба Candida albicans вплоть до концентрации 300 мкг/мл (33 мкМ) белок не активен.
Обсуждение результатов исследования
В данной работе впервые осуществлено выделение лизоцима и неизвестного антимикробного белка из лейкоцитов крови голубого песца. Полученные препараты охарактеризованы по ряду физико-химических и функциональных свойств.
Выделенный неизвестный белок представляет собой мажорную фракцию в экстракте из лейкоцитов песца, кроме того, он обладает мощной антимикробной активностью как против грамположительных бактерий, так и против грамотрицательных. Эти факты позволяют сделать предположение о его ведущей роли в инактивации патогенных микроорганизмов, способных вызывать различные заболевания животного.
По наличию в составе молекулы трех дисульфидных связей выделенный нами белок сходен с такими антимикробными пептидами лейкоцитарного происхождения, как дефенсины. Однако дефенсины позвоночных в отличие от рассматриваемого белка, имеют значительно меньшую молекулярную массу, в среднем 3-4 кД [1-3, 5-7].
По целому ряду признаков (молекулярная масса около 9 кД, три дисульфид-ные связи, отсутствие остатков триптофана и тирозина) данный белок напоминает NK-лизин свиньи. NK-лизины и гранулизины млекопитающих локализованы в гранулах лейкоцитов не миелоидного, а лимфоидного ряда (NK-клетки, цитотоксиче-ские T-лимфоциты) и принимают участие как в инактивации микробов, так и в ци-тотоксическом действии по отношению к опухолевым клеткам. Данные молекулы относятся к семейству сапозино-подобных белков, для представителей которых характерна способность взаимодействовать с липидами, но лишь некоторые группы (NK-лизины, гранулизины, амебопоры) обладают антимикробной активностью [20-22]. К настоящему времени единственным примером NK-лизина, выделенного из природного источника в виде белковой молекулы, является NK-лизин свиньи [23]. Для ряда млекопитающих и представителей других классов позвоночных было показано наличие гена NK-лизина [24-27]. В лимфоцитах человека содержится гомолог NK-лизина — гранулизин, включающий, в отличие от большинства представителей семейства, только 5 остатков цистеина и содержащий две дисульфидные связи [21, 22]. Согласно информации из базы данных Uniprot (URL: http://www.uni-prot.org) NK-лизины или гранулизины у представителей отряда хищных до сих пор описаны не были.
Фракция, соответствующая данному белку, являлась доминирующей в белковом спектре экстрактов из лейкоцитов голубого песца. Вместе с тем по результатам экспериментов, проведенных в нашей лаборатории, экстракты из лейкоцитарного
материала собаки [28] и лисицы (не опубликовано), полученного тем же методом, не содержат подобного компонента. В то же время наличие лизоцима характерно для экстрактов из лейкоцитов всех трех видов.
В дальнейшем мы планируем определить первичную структуру выделенных нами белков, что в частности, позволит проверить гипотезу о принадлежности неизвестного белка к группе NK-лизинов.
* * *
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №09-04-01655). Литература
1. Кокряков В. Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб: Наука, 2006. 261 с.
2. Современная концепция об антимикробных пептидах как молекулярных факторах иммунитета / Кокряков В. Н., Алешина Г. М., Шамова О. В., Орлов Д. С., Андреева Ю. В. // Мед. акад. журн. 2010. Т. 10. С. 149-160.
3. Boman H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. 1995. Vol. 13. P. 61-92.
4. Giuliani A., Pirri G., Nicoletto S. F. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics // CEJB. 2007. Vol. 2. P. 1-33.
5. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S. O., Teran L. M. Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease // Clin. Immunol. 2010. Vol. 135. P. 1-11.
6. Kenshi Y., Gallo R. L. Antimicrobial peptides in human skin disease // Eur. J. Dermatol. 2008. Vol. 18. P. 11-21.
7. ZasloffM. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol. 415. P. 389-395.
8. Аникиева Л. В., Тютюнник Н. Н., Аниканова В. С. Роль гуморальных факторов естественной защиты при токсаскаридозе песцов // Труды Карельского научного центра РАН. № 3. 2009. С. 4-7.
9. Klir J. J., Heath J. E. An infrared thermographic study of surface temperature in relation to external thermal stress in three species of foxes: the red fox (Vulpes vulpes), arctic fox (Alopex lagopus), and kit fox (Vulpes macrotis) // Physiol. Zool. 1992. Vol. 65. P. 1011-1021.
10. The influence of air pollution on lysozyme activity in the polar fox (Alopex lagopus) / Nowako-wicz-D^bek B., Saba L., Ondrasovic M., Bis-Wencel H., Rózanski P., Wnuk W., Vargová M. // Folia Veterinaria. 2004. Vol. 48. P. 43-45.
11. Oleinik V. M. Distribution of digestive enzyme activities along intestine in blue fox, mink, ferret and rat // Comp. Biochem. Physiol. 1995. Vol. 112A. P. 55-58.
12. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides / Lehrer R. I., Rosenman M., Harwing S. S., Jackson R., Eisenhauer P. // J. Immunol. Meth. 1991. Vol. 137. P. 167-173.
13. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 130. P. 337-346.
14. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379.
15. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир, 1971. 247 с.
16. Торчинский Ю. М. Сера в белках. М.: Наука, 1977. 123 с.
17. Kinter M., Sherman N. E. Protein sequencing and identification using tandem mass spectrometry. New York: Wiley-Interscience, 2000. 301 p.
18. Parry R. M., Jr, Chandan R. C., Shahani K. M. A rapid and sensitive assay of muramidase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965. Vol. 119. P. 384-386.
19. Effect of N-terminal mutation of human lysozyme on enzymatic activity / Tsuchiya Y., Morio-ka K., Yoshida K., Shirai J., Kokuto T., Inumaru S. // Nucleic Acids Symposium Series. 2007. N 51. P. 465-466.
20. Brunh H., Riekens B., Berninghausen O., Leippe M. Amoebapores and NK-lysin, members of a class of structurally distinct antimicrobial and cytolytic peptides from protozoa and mammals: a comparative functional analysis // Biochem. J. 2003. Vol. 375. P. 737-744.
21. Clayberger C., Krensky A. M. Granulysin // Curr. Opin. Immunol. 2003. Vol. 15. P. 560-565.
22. Conserved structure and function in the granulysin and NK-lysin peptide family / Linde C. M. A., Grundstrom S., Nordling E., Refai E., Brennan P. J., Andersson M. // Infect. Immun. 2005. Vol. 73. P. 6332-6339.
23. NK-lysin, a novel effector peptide of cytotoxic T and NK cells. Structure and cDNA cloning of the porcine form, induction by interleukin 2, antibacterial and antitumour activity / Andersson M., Gunne H., Agerberth B., Boman A., Bergman T., Sillard R., Jornvall H., Mutt V., Olsson B., Wigzell H., Dagerlind A., Boman H. G., Gudmundsson G. H. // EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 1615-1625.
24. Molecular cloning and characterization of equine NK-lysin / Davis E. G., Sang Y., Rush B., Zhang G., Blecha F. // Veterinary Immunol. and Immunopathol. 2005. Vol. 105. P. 163-169.
25. Characterization of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) NK-lysin, an antimicrobial peptide / Hirono I., Kondo H., Koyama T., Arma N. R., Hwang J. Y., Nozaki R., Midorikawa N., Aoki T. // Fish and Shellfish Immunol. 2007. Vol. 22. P. 567-575.
26. Wang Q., Wang Y., Xu P., Liu Z. NK-lysin of channel catfish: Gene triplication, sequence variation, and expression analysis // Mol. Immunol. 2006 Vol. 43. P. 1676-1686.
27. Molecular cloning and characterization of chicken NK-lysin / Hong Y. H., Lillehoj H. S., Dal-loul R. A., Min W., Miska K. B., Tuo W., Lee S. H., Han J. Y., Lillehoj E. P. // Veterinary Immunol. and Immunopathol. 2006. Vol. 110. P. 339-347.
28. Кораблева Е. С., Берлов М. Н., Андреева Ю. В., Кокряков В. Н. Антимикробный пептид из лейкоцитов собаки: структурно-функциональные свойства // Вестн. С. -Петерб. ун-та. 2007. Сер. 3: Биология. Вып. 3. С. 80-88.
Статья поступила в редакцию 10 октября 2011 г.
