CC BY
34
Медицинская иммунология ОрЫгиНаЛЬНЫС СШаШЬЫ Medical Immunology 2014, Т. 16, № 2, стр. 139-148 * ^ . . . . . 2014, Vol. 16, No 2, pp. 139-148
© 2014, СПб РО РААКИ Original OVÍlCleS © 2014, SPb RAACI
ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ МСК НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ Т-КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ ИНДУЦИРОВАННОЙ ЛИМФОПЕНИИ ПОСЛЕ ВЫСОКОДОЗНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ
Баторов Е.В.1, Шевела Е.Я.1, Тихонова М.А.1, Пронкина Н.В.1, Баторова Д.С.1, Крючкова И.В.1, Поспелова Т.И.2, Останин А.А.1, Черных Е.Р.1
1ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
2 ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Новосибирск, Россия
Резюме. Целью работы явилась оценка влияния мезенхимальных стромальных клеток (МСК) больных лимфомами на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов in vitro и in vivo. Полученные данные впервые продемонстрировали, что МСК больных лимфомами в широком диапазоне соотношений МСК:МНК (от 1:50 до 1:2) способны усиливать in vitro пролиферацию МНК доноров и больных лимфомами в ответ на IL-2 или IL-7. При этом важным фактором, детерминирующим стимулирующий эффект МСК, является реактивность отвечающих лимфоцитов на IL-2 или IL-7. Исследования ex vivo показали, что, в отличие от стандартной АТГСК, у пациентов с ко-трансплантацией МСК СD8+Т-клетки, особенно клетки памяти, на этапе выхода из лейкопении содержат большую долю пролиферирующих клеток, чем до АТГСК. Кроме того, в этой группе не наблюдалось возрастания апоптоза наивных CD4+Т-клеток, что было характерно при проведении стандартной АТГСК. Полученные данные означают, что стимулирующий эффект МСК на пролиферацию Т-клеток в условиях индуцированной лимфопении реализуется преимущественно в отношении CD8+Т-клеток памяти, тогда как более эффективное восстановление наивных CD4+Т-клеток обусловлено анти-апоптоти-ческим эффектом МСК.
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, IL-2, IL-7, T-лимфоциты, пролиферация
Адрес для переписки:
Черных Елена Рэмовна д.м.н., профессор, член-корр. РАМН, заведующая лабораторией клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН 630099, Россия, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. Тел.: 8 (383) 236-03-29. E-mail: ct lab@mail.ru
Поступила 05.12.2013 Принята к печати 23.12.2013
Авторы:
Баторов Е.В. — к.м.н., младший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Шевела Е.Я. — д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Тихонова М.А. — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Пронкина Н.В. — к.б.н., заведующая лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия Баторова Д.С. — врач-гематолог гематологического отделения с блоком трансплантации костного мозга ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Крючкова И.В. — к.м.н., заведующая гематологическим отделением с блоком трансплантации костного мозга ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Поспелова Т.И. — д.м.н., профессор, заведующая кафедрой терапии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Новосибирск, Россия
Останин А.А. — д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Черных Е.Р. — д.м.н., профессор, член-корр. РАМН, заведующая лабораторией клеточной иммунотерапии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Медицинская иммунология ОпигЫНаЛЬНЫС СШаШЬЫ Medical Immunology 2014, Т. 16, № 2, стр. 139-148 * ^ . . . . . 2014, Vol. 16, М 2, pp. 139-148
© 2014, СПбРО РААКИ Original articles © 2014, SPb RAACI
POSSIBLE MECHANISMS OF STIMULATORY EFFECTS OF MESENCHYMAL STROMAL CELLS UPON T CELL RECOVERY DURING
CHEMOTHERAPY-INDUCED LYMPHOPENIA
Batorov E.V.a, Shevela E.Ya.a, Tikhonova M.A.a, Pronkina N.V.a, Batorova D.S.a, Kryuchkova I.V.a, Pospelova T.I.b, Ostanin A.A.a, Chernykh E.R.a
а Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
b Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russian Federation
Abstract. The aim of present work was to evaluate the effect of mesenchymal stromal cells (MSCs) from lymphoma patients on the in vitro and in vivo homeostatic proliferation of lymphocytes. Our data have demonstrated for the first time, that MSCs from lymphoma patient are able to enhance the in vitro proliferation of donor and patient mononuclear cells (MNCs) in response to IL-2 or IL-7. This effect was observed within a wide range of MSC-to-MNC ratios (1:50-1:2). Lymphocyte reactivity to IL-2 or IL-7 was found to be an important factor determining the stimulatory effect of MSCs. Ex vivo studies in the patients undergoing autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) have shown that the patients co-transplanted with MSCs exhibited higher proportions of proliferating CD8+T cells (especially, memory cells) at the day of engraftment, than before AHSCT, as compared to the patients subjected to standard AHSCT protocols. Moreover, there was no an increase in apoptosis of naive CD4+T cells that was typical for standard AHSCT. These data indicate that the stimulatory effect of MSCs upon T lymphocyte proliferation following chemotherapy-induced lymphopenia concerns, mainly, the memory CD8+T cell population, whereas more efficient recovery of naive CD4+T cells is due to anti-apoptotic effects of MSCs. (Med. Immunol., 2014, vol. 16, N2, pp 139-148) Keywords: mesenchymal stromal cells, IL-2, IL-7, T-lymphocytes, proliferation
Address for correspondence: Authors:
Chernykh Elena R. Batorov E.V., PhD (Medicine), Junior Research Associate, Laboratory of Cellular
PhD MD Professor Immunotherapy, Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of
n ' m 'i r> • Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
Corresponding Member, Russian ' ' '
Academy ofMedical Sciances, ^l?EY^, PhD\ MD (Mfdicine), ?enior Resfa!ch ^sociate, Laboratory
tj r! t u t fr a i of Cellular Immunotherapy, Research institute of Clinical Immunology, Russian
Head, Latjomtoty oj Cellulai" Academy of Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
Ilnmuno^her'^l^py, Ressearch Tikhonova M.A., PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular
lnstitute oj Clmical Immw^ology, Immunotherapy, Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Russian Academy of Medical Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
Sciences, Siberian Branch Pronkina N.V., PhD (Biology), Head, Laboratory of Clinical Immunology, Research
630099, Russian Federation, Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences, Siberian
Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., Branch, Novosibirsk, Russian Federation
14. Batorova D.S., Clinical Hematologist, Department of Hematology and Bone Marrow
Phone: 7 (383) 236-03-29. Transplantation, Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of
E-mail' ct lab@mail ru Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
Kryuchkova I.V., PhD (Medicine), Head, Department of Hematology and Bone Marrow Transplantation, Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation Pospelova T.I., PhD, MD (Medicine),Professor, Head, Department of Therapy, Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russian Federation Ostanin A.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Laboratory of Cellular Immunotherapy, Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences, Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation Chernykh E.R., PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Medical Sciances, Head, Laboratory of Cellular Immunotherapy, Received 05A2.2°13 Research Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences,
Accepted 23.12.2013 Siberian Branch, Novosibirsk, Russian Federation
Введение
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые наряду с дифференцировочным потенциалом обладают выраженной иммуноре-гуляторной активностью [9]. Так, способность МСК к иммуносупрессии активно обсуждается для обоснования возможности использования МСК в лечении аутоиммунных заболеваний и трансплантационных реакций [5, 7]. Кроме того, МСК проявляют гемопоэзстимулирущую активность, участвуя в создании гемопоэтическо-го микроокружения и продуцируя факторы роста и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [4, 16, 17]. Эти свойства позволяют использовать МСК с целью улучшения приживления гемопоэтических предшественников и ускорения восстановления кроветворения при проведении трансплантации ГСК [4, 14, 17].
Действительно, проведенные нами ранее исследования показали, что ко-трансплантация МСК при проведении аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) у больных лимфомами сопровождается значимым сокращением периода критической нейтро- и тромбоцитопении [22]. При этом нами было обнаружено, что пациенты с ко-трансплантацией МСК характеризуются более ранним восстановлением лимфоцитов и отличаются более эффективной реконституцией Т-клеток [1, 2].
Известно, что восстановление Т-лимфоцитов в условиях лимфопении, индуцированной вы-сокодозной химиотерапией, осуществляется посредством двух механизмов — тимопоэза и экспансии зрелых Т-клеток за счет гомеостатической пролиферации [20], причем включение тимопоэ-за происходит достаточно поздно (не ранее 6-12 мес. после трансплантации), и доминирующим механизмом восстановления Т-клеток в раннем восстановительном периоде является гомеоста-тическая пролиферация [8]. Исходя из этого, мы предположили, что выявленный нами ранее стимулирующий эффект МСК на реконституцию Т-клеток может быть обусловлен способностью МСК усиливать гомеостатическую пролиферацию. Действительно, рядом авторов было показано, что при использовании низких доз МСК и при низком уровне базальной пролиферации отвечающих клеток мезенхимальные клетки усиливают пролиферацию лимфоцитов [18, 19, 21]. Стимулирующий эффект МСК на реконститу-цию Т-клеток у пациентов с ко-трансплантацией МСК мог быть также отчасти обусловлен сниженной супрессорной активностью МСК у больных лимфомами [3, 23].
В настоящем исследовании была предпринята попытка оценить влияние МСК больных лимфомами на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов in vitro и in vivo. Для решения первой задачи предполагалось исследовать эффект МСК на пролиферативный ответ лимфоцитов, стимулированных «гомеостатическими цитокинами» — IL-2 и IL-7 в культуре in vitro. Для решения второй задачи планировалось оценить ex vivo параметры клеточного цикла различных субпопуляций Т-лимфоцитов в группах пациентов со стандартной ауто-ТГСК и ко-трансплантацией МСК.
Материалы и методы
Получение МСК
Для генерации МСК использовали клетки лейковзвеси, полученные в результате гравитационного разделения, которые культивировали (106 клеток/см2) в среде a-MEM/10% FCS в пластиковых флаконах («Nunclon», Дания) при 37 °C в С02-инкубаторе. Через 72 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до получения клеточного монослоя. Обновление питательной среды проводили дважды в неделю. Отделение МСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США). В случае генерации МСК, предназначенных для ко-трансплантации пациентам с ауто-ТГСК, в качестве аналога FCS использовали 3-5% лиза-та тромбоцитов, который получали по стандартной методике [12].
Оценка влияния МСК на пролиферативную активность лимфоцитов
Для оценки регуляторной активности МСК использовали мезенхимальные клетки, полученные из костного мозга 22 пациентов со злокачественными лимфомами, включая 11 мужчин и 11 женщин в возрасте от 20 до 57 лет (медиана 35 лет). Все пациенты находились на стационарном лечении в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН. В 7 случаях у пациентов диагностировалась неходжкинская лимфома (НХЛ), в 13 — лимфома Ходжкина (ЛХ) и в 2-х — множественная миелома (ММ). Тестирование МСК проводили в культурах мононуклеарных клеток (МНК) больных и здоровых доноров. Группу условно здоровых доноров составили 14 волонтеров, совместимых по полу и возрасту. Забор крови и костного мозга проводили после получения письменного информированного согласия.
МНК выделяли из венозной крови стандартно путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,078).
МНК (105 клеток/лунку) культивировали в среде RPMI-1640 с 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IV) группы в 96-луночных кру-глодонных планшетах в присутствии/отсутствие различных доз МСК (МСК:МНК - 1:50, 1:10, 1:2, 1:1). Для стимуляции клеток использовали ре-комбинантный IL-2 («Ронколейкин», ООО «Био-тех», Россия; 100 ЕД/мл) и рекомбинантный IL-7 (R&D Systems, США; 10 нг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч радиометрически по включению 3Н-тимидина, вносимого за 18 ч до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Об эффекте МСК судили по индексу влияния МСК (ИВМСК), который рассчитывали как отношение уровня пролиферативного ответа МНК в присутствии МСК к таковому без МСК.
Оценка клеточного цикла в субпопуляциях Т-лимфоцитов
Клеточный цикл оценивали перед (до начала кондиционирования) и после аутологич-ной трансплантации стволовых кроветворных клеток в день выхода из лейкопении (лейкоциты > 1 х 109/л) в группе 8 пациентов со стандартной ауто-ТГСК (НХЛ — 4 человека, ЛХ — 1 и ММ — 3) и 13 пациентов с ко-трансплантацией МСК (НХЛ — 3, ЛХ — 2 и ММ — 8). Пациенты получали режимы кондиционирования BEAM (кармустин 300 мг/м2, мелфалан 140 мг/м2, этопо-зид и цитарабин по 800 мг/м2; n = 10) и мелфалан (140-200 мг/м2; n = 11). МСК вводили в средней дозе 0,48 х 106 клеток/кг веса больного (0,10 — 1,23 х 106 клеток/кг). Период до выхода из лейкопении после ауто-ТГСК составил в среднем 14 дней (от 13 до 17 дней).
Параметры клеточного цикла определяли в субпопуляциях CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RA+ и CD8+CD45RO+Т-лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, США), используя FITC-меченые анти-CD4 и анти-CD8 и РЕ-меченые анти-CD45RO и анти-СD45RA моноклональные антитела («Сорбент», Россия; Becton Dickinson, США). Для этого меченые клетки последовательно обрабатывали РНКазой (20 мкг/мл) и 7-ами-но-актиномицином D (7-AAD, Calbiochem, Германия, 2 мкг/мл). Анализ гистограмм ДНК позволял идентифицировать апоптотические клетки (с фрагментированной ДНК), формирующие характерный гиподиплоидный пик; клетки в G0/G: фазах клеточного цикла (с диплоидным набором ДНК) и клетки в S, G^/M фазах клеточного цикла (с гипердиплоидным набором ДНК).
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Для оценки значимости различий между исследуемыми параметрами использовали не-
параметрический критерий Вилкоксона—Ман-на—Уитни. Для исследования корреляционных взаимосвязей использовался коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты
Для моделирования гомеостатической пролиферации in vitro МНК доноров активировали IL-2 или IL-7. Предварительные исследования показали, что наиболее выраженное усиление пролиферации МНК наблюдалось при использовании IL-2 в дозе 100 ЕД/мл и IL-7 — в дозе 10 нг/мл. Стимулирующий эффект IL-2 (ИВШ_2) составлял в среднем 10,2±2,4, IL-7 — 2,26±0,6 расч.ед. При этом обращала на себя внимание вариабельность ответа МНК. Так, ИВШ_2 варьировал от 1,1 до 35,8, а ИВШ_7 — от 0,5 до 4,2 расч. ед.
Исследование влияния МСК на пролифера-тивный ответ лимфоцитов в условиях, моделирующих гомеостатическую пролиферацию, показал (рис. 1), что МСК больных лимфомами обладали способностью усиливать пролиферативный ответ МНК доноров, стимулированных IL-2 или IL-7. Усиливающий эффект МСК в культурах IL-2-активированных МНК (Рис.1А) проявлялся в достаточно широком диапазоне доз и был наиболее выраженным при соотношении МСК:МНК, равном 1:2, достигая 50%. Наибольший стимулирующий эффект в культурах IL-7-активированных МНК доноров (рис. 1Б) проявлялся в присутствии более низких доз МСК (МСК:МНК 1:50 и 1:10), составляя в среднем 70% и 170% соответственно. При максимальных дозах (при соотношении МСК:МНК =1:1) МСК не влияли на интенсивность IL-2- и IL-7-стимулированной пролиферации лимфоцитов.
МСК проявляли регуляторную активность также в культурах МНК больных лимфомами. Однако в этом случае стимулирующий эффект МСК на IL-2-активированные клетки был максимально выраженным при низких дозах МСК и снижался по мере увеличения их количества. В то же время стимулирующий эффект МСК в IL-7-активированных культурах МНК больных (в отличие от эффекта в культурах МНК доноров) практически отсутствовал при низких дозах МСК, но отчетливо проявлялся при использовании более высоких доз, сохраняясь даже при соотношении МСК:МНК 1:1.
Важно отметить, что эффект МСК варьировал в зависимости от индивидуальных свойств МСК. Так, из 10 образцов МСК семь оказывали стимулирующее влияние на пролиферацию IL-2-активированных МНК доноров, тогда как МСК трех пациентов не проявляли подобной активно-
А
2 n
1,5 -
1
0,5
— МНК доноров I- МНК больных
Б
1:50
1:10 1:2 МСК:МНК
1:1
к s
л
4 -|
3 -
2
1
1:50
МНК доноров МНК больных
1:10 1:2 МСК:МНК
1:1
0
Рисунок 1. Влияние МСК на ^-2- и ^-7-стимулированную пролиферацию МНК
Примечание. А. МСК, полученные от 10 больных лимфомами, тестировали в культурах^-2- стимулированных МНК здоровых доноров (п = 23) и больных (п = 12).
Б. МСК, полученные от 6 больных лимфомами, тестировали в культурах 1-7- стимулированных МНК здоровых доноров (п = 7) и больных (п = 8).
Данные представлены в виде средних значений ИВМСК.
А
Б
2
1,5 -
1
0,5
♦ Пациент 6
—■— Пациент 7
Г \ —А— Пациент 8
N ■ ^ \ \
\
1 1 1
2
1,5 -
1
0,5
Пациент 14 I- Пациент 15 I —Пациент 16
1:50 1:10 1:2 1:1
МСК:МНК
-1-1-
1:50 1:10 1:2
МНК:МСК
1:1
Рисунок 2. Вариабельность регуляторной активности МСК больных лимфомами
Примечание. Представлены значения ИВМСК больных лимфомами (п = 6) на пролиферацию МНК одного донора при стимуляции 1-2 (А) и 1-7 (Б).
0
0
сти. Аналогичным образом, из 6 образцов МСК, тестируемых в культурах ^-7-активированнм>1х МНК, стимулирующий эффект был выявлен в 5 случаях. На рисунке 2 в качестве примера приведены результаты тестирования МСК шести пациентов в культуре МНК одного донора (рис. 2А, Б).
Стимулирующий эффект МСК зависел также от реактивности отвечающих лимфоцитов. Так, при соотношении МСК:МНК 1:2 пролифе-ративный ответ лимфоцитов на ^-2 в культурах с ИВМСК > 1,0 был достоверно ниже, чем в культурах МНК, в которых стимулирующее действие МСК не выявлялось (1994±349 имп/мин против 5048±1098 имп/мин, ри = 0,05). Зависимость сти-
мулирующего эффекта МСК от реактивности лимфоцитов на ^-2 подтверждалась также наличием обратной корреляционной связи между ИВМСК и уровнем ^-2-стимулированной пролиферации МНК, наиболее выраженной при соотношении МСК:МНК 1:2 (г, = -0,6; р = 0,0024, п = 23). Видимо, по этой же причине образцы МСК трех больных, не проявлявшие стимулирующей активности в культурах МНК доноров, усиливали пролиферативный ответ лимфоцитов больных. В качестве примера на рисунке 3 приведены данные, демонстрирующие отсутствие стимулирующего эффекта МСК одного из этих трех пациентов в культурах МНК двух доноров и появление стимулирующей активности в культурах МНК двух больных. Различия в эффекте МСК ассоциировались с различиями исходной реактивности МНК доноров и больных на ^-2. Действительно, ответ МНК больных на ^-2 был достоверно ниже по сравнению с М НК доноров (1879±485 против 3322±597 имп/мин, ри = 0,048).
Стимулирующее влияние МСК в культурах ^-7-активированных МНК больных также обратно коррелировало с уровнем ответа МНК на ^-7. Эта взаимосвязь наиболее ярко проявлялась при соотношении МСК:МНК, равном 1:2 (г, = -0,74, р., = 0,006, п = 12).
Выявленная способность МСК усиливать ^-2- и ^-7-индуцированную пролиферацию лимфоцитов подтверждает предполо жение о том, что более эффективное восстановление лимф оци-тов после ауто-ТГСК на фоне ко-трансплантации МСК может быть обусловлено усилением гомео-
статической пролиферации, являющейся основным механизмом восстановления лимфоцитов после высокодозной химиотерапии в раннем периоде. Для того чтобы убедиться в реализации стимулирующего эффекта МСК in vivo (в условиях индуцированной лимфопении), мы исследовали параметры клеточного цикла Т-лимфоцитов в группах пациентов со стандартной ауто-ТГСК (МСК-) и ко-трансплантацией МСК (МСК+) на этапе выхода из лейкопении.
Как видно из данных таблицы 1, после стандартной ауто-ТГСК наблюдалось выраженное возрастание апоптоза в популяции наивных CD4+Т-клеток, в то время как в группе МСК(+) значимого возрастания апоптоза CD4+CD45RA+Т-лимфоцитов не регистрировалось. Второй особенностью в группе МСК(+) было значимое снижение доли покоящихся клеток и тенденция к возрастанию доли пролифери-рующих клеток среди наивных CD8+Т-лимфо-цитов. Наконец, третьей особенностью в группе МСК(+) явилось значимое увеличение доли про-лиферирующих и снижение доли покоящихся клеток в популяции CD8+Т-клеток памяти. Суммируя представленные данные, можно заключить, что ко-трансплантация МСК оказывала стимулирующий эффект на пролиферацию CD8+Т-клеток, тогда как более эффективное восстановление наивных CD4+Т-клеток в раннем посттрансплантационном периоде было связано с анти-апоптотическим эффектом МСК.
2,5 п
2
1,5 -
1
0,5 -
1:50
А.
♦ Донор 8 —■ - Донор 9 —Пациент 9 —Х- Пациент 10
1:10 1:2 МСК:МНК
1:1
Рисунок 3. Эффект МСК в культурах МНК доноров и больных, оппозитных по уровню исходной реактивности на !Ь-2
Примечание. Представлены значения ИВМСК на пролиферацию МНК здоровых доноров (п = 2) и больных лимфомами (п = 2) в присутствии различных доз МСК одного пациента (пациент 8). Данные получены в ходе одного эксперимента.
0
ТАБЛИЦА 1. ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В РАЗЛИЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЯХ Т-ЛИМФОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ СО СТАНДАРТНОЙ (МСК-) АУТО-ТГСК И КО-ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ МСК (МСК+)
Параметры МСК (-), n = 7 МСК (+), n = 12
До АТГСК После АТГСК До АТГСК После АТГСК
CD4+CD45RA+
Апоптоз(%) 9,4±2,2 22,6±3,2** 10,0±1,6 14,0±3,0
G0/G1 (%) 56,5±3,1 51,0±6,0 58,0±4,8 59,3±5,0
S, G2/M 32,7±3,1 26,3±7,7 30,6±5,2 26,1±5,0
CD4+CD45RO+
Апоптоз(%) 14,8±3,5 15,4±4,8 9,1±1,3 11,5±1,7
G0/G1 (%) 57,9±2,2 54,4±6,5 64,6±4,7 59,2±3,3
S, G2/M 27,1±3,3 30,9±5,3 27,0±4,4 29,1±2,7
CD8+CD45RA+
Апоптоз(%) 14,1±3,4 19,1±5,1 14,4±1,8 16,2±3,0
G0/G1 (%) 50,2±4,0 45,7±2,4 58,5±3,7 45,0±3,6*
S, G2/M 34,8±4,9 36,1±4,0 26,8±2,9 37,4±4,9
CD8+CD45RO+
Апоптоз(%) 9,3±1,6 16,3±4,7 14,5±2,3 14,8±2,1
G0/G1 (%) 57,2±6,4 49,1±6,7 62,3±4,1 45,6±3,4**
S, G2/M 35,0±5,8 34,9±4,8 23,5±4,9 39,3±3,9*
Примечание. * - ри < 0,05; ** - ри < 0,01; U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Обсуждение
Полученные данные впервые продемонстрировали, что МСК больных лимфомами способны усиливать in vitro пролиферацию лимфоцитов, активированных IL-2 или IL-7. Стимулирующий эффект МСК регистрируется в достаточно широком диапазоне соотношений МСК:МНК — от 1:50 до 1:2 и воспроизводится как в культурах МНК доноров, так и больных лимфомами. При этом важным фактором, детерминирующим стимулирующий эффект МСК, является исходная реактивность отвечающих лимфоцитов на IL-2 или IL-7.
Как известно, IL-7 является основным цито-кином, участвующим в поддержании гомеоста-тической пролиферации лимфоцитов [13]. Кроме того, в ряде работ описана возможность запуска и поддержания периферической экспансии CD8+ (но не CD4+) Т-клеток под влиянием IL-2, что может быть связано с экспрессией на CD8+ клетках р-цепи общего для IL-2 и IL-15 рецептора (CD122), практически отсутствующего на CD4+ лимфоцитах [10, 15, 24]. Учитывая эти факты, выявленная нами способность МСК стимулировать IL-2- и IL-7-индуцированную пролиферацию лимфоцитов in vitro подтверждает гипотезу о возможном участии МСК в регуляции гомеостатиче-ской пролиферации лимфоцитов.
Стимулирующий эффект низких доз МСК здоровых доноров на пролиферацию лимфоцитов, индуцированную митогенами или аллоан-тигенами, был описан рядом авторов [18, 21]. Более того, BoceШ-TyndaП с соавт. продемонстрировали, что низкие дозы МСК могут усиливать экспансию лимфоцитов, слабо отвечающих на «гомеостатические» цитокины. Однако при увеличении соотношения МСК:МНК проявляется супрессорный эффект МСК [6]. В своей работе мы использовали МСК больных лимфо-мами, отличительной особенностью которых является, как было показано ранее, сниженный иммуносупрессорный потенциал [23]. Видимо, поэтому МСК больных даже в относительно высоких дозах (при соотношении МСК:МНК, равном 1:2) не проявляли супрессорной активности.
Важно отметить, что позитивный эффект МСК на пролиферацию лимфоцитов в условиях стимуляции ^-2 и ^-7 наиболее ярко проявлялся в культурах МНК с низкой реактивностью к указанным цитокинам. При этом в культурах с высоким уровнем ^-2- и ^-7-индуцированной пролиферации МСК не обладали стимулирующим эффектом и в ряде случаев даже ингибировали пролиферативный ответ лимфоцитов. Подобная избирательность эффектов МСК, вероятно, направлена на поддержание иммунного гомеостаза и обусловлена способностью МСК продуцировать медиаторы как со стимулирующей, так и су-
прессорной активностью, а также индуцировать генерацию CD4+CD25hiCD127-FохP3+ регулятор-ных Т-клеток [11].
Важным результатом настоящего исследования можно считать также данные о влиянии МСК на уровень апоптоза и пролиферацию Т-лимфоцитов in vivo. Результаты этих исследований показали, что у пациентов с ко-трансплантацией МСК СD8+Т-клетки, особенно Т-клетки памяти, на этапе выхода из лейкопении содержат большую долю пролиферирующих клеток, чем до ауто-ТГСК, тогда как в группе со стандартной трансплантацией подобных различий не наблюдалось. В то же время более эффективное восстановление наивных CD4+^
клеток в группе с ко-трансплантацией МСК, показанное нами ранее [1], не связано с увеличением пролиферации CD4+CD45RA+ клеток, а обусловлено анти-апоптотическим эффектом МСК.
В целом результаты настоящей работы позволяют полагать, что МСК больных лимфомами способны оказывать стимулирующий эффект на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов, и данный эффект проявляется in vivo прежде всего в отношении CD8+Т-клеток. В то же время позитивный эффект МСК на раннее восстановление наивных CD4+Т-клеток обусловлен более высокой выживаемостью этих клеток вследствие снижения их апоптоза.
Благодарности
Работа поддержана грантом РФФИ № 12-04-00107.
Список литературы
1. Черных Е.Р., Баторов Е.В., Шевела Е.Я., Пронкина Н.В., Крючкова И.В., Сергеевичева В.В., Гилевич А.В., Баранова Д.С., Кожевников В.С., Останин А.А. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на раннее восстановление Т-лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутоло-гичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток // Иммунология. — 2013. — Т. 34, № 4. — С. 202-207.
2. Черных Е.Р., Баторов Е.В., Шевела Е.Я., Пронкина Н.В., Сергеевичева В.В., Гилевич А.В., Баранова Д.С., Останин А.А., Крючкова И.В. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на раннее восстановление лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток // Бюллетень СО РАМН. — 2011. — Т. 31, № 2. — С. 101-107.
3. Шевела Е.Я., Петровский Я.Л., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Сергеевичева В.В., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология. — 2008. — № 2. - С. 32-38.
Ссылки 4-24 см. в References (стр. 147-148). See References for numbers 4-24 at pp. 147-148.
References
1. Chernykh E.R., Batorov E.V., Shevela E.Ya., Pronkina N.V, Kryuchkova I.V., Sergeevicheva V.V., Gilevich A.V, Baranova D.S., Kozhevnikov V.S., Ostanin A.A. Vliyanie mezenkhimaFnykh stromaFnykh kletok na rannee vosstanovlenie T-limfotsitov u boFnykh zlokachestvennymi limfomami s autologichnoy transplantatsiey gemopoeticheskikh stvolovykh kletok [Effect of mesenchymal stromal cells on the early reconstitution of T-lymphocytes in malignant lymphoma patients with autologous hematopoietic stem cell transplantation]. Immunologiya — Immunology, 2013, vol. 34, no. 4,pp. 202-207.
2. Chernykh E.R., Batorov E.V., Shevela E.Ya., Pronkina N.V., Sergeevicheva V.V., Gilevich A.V., Baranova D.S., Ostanin A.A., Kryuchkova I.V. Vliyanie mezenkhimaFnykh stromaFnykh kletok na rannee vosstanovlenie limfotsitov u boFnykh zlokachestvennymi limfomami s autologichnoy transplantatsiey gemopoeticheskikh stvolovykh kletok [Effect of mesenchymal stromal cells on the early lymphocyte recovery in patients receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation for malignant lymphomas]. Byulleten' SO RAMN — Bulletin of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, 2011, vol. 31, no. 2, pp. 101-107.
3. Shevela E.Ya., Petrovskiy Ya.L., Kurganova E.V., Tikhonova M.A., Sakhno L.V., Sergeevicheva V.V., Kulagin A.D., Lisukov I.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Harakteristika mezenkhimaFnykh stromaFnykh kletok kostnogo mozga u boFnykh gemoblastozami [Characteristics of bone marrow mesenchymal stromal cells in patients with hematological malignancies]. Gematologiya i transfuziologiya — Haematology and Transfusiology, 2008, no. 2, pp. 32-38.
4. Ball L.M., Bernardo M.E., Roelofs H., Lankester A., Cometa A., Egeler R.M., Locatelli F., Fibbe WE. Co-transplantation of ex vivo-expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocytes recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Blood, 2007, vol. 110, pp. 2764-2767.
5. Ben-Ami E., Berrih-Akhin S., Miller A. Mesenchymal stem cells as an immunomodulatory therapeutic strategy for autoimmune diseases. Autoimmun. Rev., 2011, vol. 10, no. 7, pp. 410-405.
6. Bocelli-Tyndall C., Bracci L., Schaeren S., Feder-Mengus C., Barbero A., Tyndall A., Spagnoli G.C. Human bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes promote and/or suppress the in vitro proliferation of lymphocytes stimulated by interleukins 2, 7 and 15. Ann. Rheum. Dis., 2009, vol. 68, pp. 13521359.
7. Bocelli-Tyndall C., Bracci L., Spagnoli G., Braccini A., Bouchenaki M., Ceredig R., Pistoia V., Martin I., Tyndall A. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from healthy donors and autoimmune disease patients reduce the proliferation of autologous- and allogeneic-stimulated lymphocytes in vitro. Rheumatology (Oxford), 2007, vol. 46, no. 3, pp. 403-408.
8. Boyman O., Ltourneau S., Kreig C., Sprent J. Homeostatic proliferation and survival of na'ive and memory T cells. Eur. J. Immunol., 2009, vol. 39, no. 8, pp. 2088-2094.
9. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. CellBiochem., 2006, vol. 98, pp. 1076-1084.
10. Cho J.H., Boyman O., Kim H.O., Hahm B., Rubinstein M.P., Ramsey C., Kim D.M., Surh C.D., Sprent J. An intense form of homeostatic proliferation of naive CD8+ cells driven by IL-2. J. Exp. Med., 2007, vol. 204, no. 8, pp. 1787-1801.
11. Crop M.J., Baan C.C., Korevaar S.S., Ijzermans J.N., Weimar W., Hoogduijn M.J. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells induce explosive T-cell proliferation. Stem Cells Dev., 2010, vol. 19, no. 12, pp. 1843-1853.
12. Fekete N., Gadelorge M., Fürst D., Maurer C., Dausend J., Fleury-Cappellesso S., Mailänder V., Lotfi R., Ignatius A., Sensebe L., Bourin P., Schrezenmeier H., Rojewski M.T. Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. Cytotherapy, 2012, vol. 14, no. 5, pp. 540-554.
13. Fry T.J., Connick E., Fallon J., Lederman M.M., Liewehr D.J., Spritzler J., Steinberg S.M., Wood L.V., Yarchoan R., Zuckerman J., Landay A., Mackall C.L. A potential role for interleukin-7 in T-cell homeostasis. Blood, 2001, vol. 97, no. 10, pp. 2983-2990.
14. Isaikina Y., Minakovskaya N., Aleinikova O. The influence of autologous marrow mesenchymal stem cell infusion on hematopoiesis reconstitution after hematopoietic stem cells autotransplantation in children with oncological and hematological diseases. Cellular Therapy and Transplantation, 2008, vol. 1, no. 1, pp. 35-42.
15. Kamimura D., Bevan M.J. Naive CD8+ T cells differentiate into protective memory-like cells after IL-2 anti IL-2 complex treatment in vivo. J. Exp. Med., 2007, vol. 204, no. 8, pp. 1803-1812.
16. Kim J., Hematti P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Exp. Hematol., 2009, vol. 37, pp. 1445-1453.
17. Le Blanc K., Samuelsson H., Gustafsson B., Remberger M., Sundberg B., Arvidson J., Ljungman P., Linnies H., Nava S., Ringdn O. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells. Leukemia, 2007, vol. 21, no. 8, pp. 1733-1738.
18. Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B., Haynesworth S.E., Ringd n O. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand. J. Immunol., 2003, vol. 57, pp. 11-20.
19. Li W, Ren G., Huang Y., Su J., Han Y., Li J., Chen X., Cao K., Chen Q., Shou P., Zhang L., Yuan Z.R., Roberts A.I., Shi S., Le A.D., Shi Y. Mesenchymal stem cells: a double-edged sword in regulating immune responses. Cell Death & Differentiation, 2012, vol. 19, pp. 1505-1513.
20. Mackall C.L, Hakim F.T., Gress R.E. Restoration of T-cell homeostasis after T-cell depletion. Immunology, 1997, vol. 9, pp. 339-346.
21. Najar M., Rouas R., Raicevic G., Boufker H.I., Lewalle P., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Martiat P., Lagneaux L. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy, 2009, vol. 11, no. 5, pp. 570-583.
22. Sergeevicheva W, Shevela E.Ya., Sizikova S.A., Kulagin A.D., Kruchkova I.V., Gilevich A,V., Lisukov I.A., Kozlov VA., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastoses patients efficiently support hematopoietic recovery stem cell transplantation. Cellular Therapy and Transplantation, 2010, vol. 1, no. 4, pp. 98-105.
23. Shevela E.Ya., Tikhonova M.A., Batorov E.V, Sergeevicheva V.V, Kryuchkova I.V, Kozlov V.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Impaired Functions of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells in Patients with Hematological Malignancies are Partially Improved by Fibroblast Growth Factor. J. Stem. Cell Res. Ther., 2013, vol. 3:137. doi: 10.4172/2157-7633.1000137.
24. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nat. Immunol., 2011, vol. 12, no. 6, pp. 478-484.
