CC BY
53
© ПРОХОРЕНКОВ В.И., ГРЕБЕННИКОВА В.В., ГАЙДАШ А. А., ВАСИЛЬЕВА Е.Ю., КАРАЧЕВА Ю.В., ПУЗЫРЬ А.П., БОНДАРЬ В.С.
УДК 591.477-02:546.73-084:546.26
ВЛИЯНИЯ НАНОАЛМАЗОВ НА СТРУКТУРУ КОЖИ МОРСКИХ СВИНОК В УСЛОВИЯХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ НОРМЫ И ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ДЕЙСТВИИ ХЛОРИДА КОБАЛЬТА
В.И. Прохоренков, В.В. Гребенникова, А.А. Гайдаш, Е.Ю. Васильева, Ю.В. Карачева, А.П. Пузырь, В. С. Бондарь Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра дерматовенерологии с курсом косметологии и курсом ПО, зав. - д.м.н., проф. В.И. Прохоренков; кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии, фармацевтической технологии и курсом ПО, зав. - д.м.н., проф. В.В.
Гребенникова; Институт биофизики СО РАН, директор - член-корр. РАН
А.Г. Дегеменджи.
Резюме. Исследовано влияние наноалмазов детонационного синтеза на структуру кожи морских свинок в условиях физиологической нормы и при местном воздействии хлорида кобальта. Установлено, что наноалмазы не оказывают токсического и раздражающего действия на кожу животных и не проявляют сенсибилизирующую активность. Данные морфологического исследования позволяют предполагать, что в условиях физиологической нормы наночастицы усиливают секвестрирующую функцию эпидермиса с последующим его утолщением и отторжением, приводят к повышению уровня свободной интерстициальной жидкости. Показано, что предварительная обработка кожи животных наноалмазами снижает первично раздражающий эффект действия хлорида кобальта, индуцирующего развитие контактного дерматита у морских свинок, и оказывает выраженное противоотечное действие.
Ключевые слова: наноалмазы, хлорид кобальта, аллергический контактный дерматит.
Прохоренков Виктор Иванович - д.м.н., проф., зав. каф. дерматовенерологии с курсом косметологии и ПО КрасГМУ; kras_derma@mail.ru.
Гребенникова Валентина Владимировна - д.м.н., проф., зав. каф. фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и курсом ПО КрасГМУ; e-mail: ffmo.krasgma@mail.ru.
Гайдаш Александр Александрович - д.м.н., доц. каф. фармакологии с курсом клинической фармакологии, фармацевтической технологии и курсом ПО КрасГМУ; e-mail: A.A.-jack200@ngs.ru.
В последние годы отмечается рост заболеваемости аллергическими контактными дерматитами. Известно, что причиной их развития в 92% случаев является контакт кожи с аллергенами химической природы [2]. Поэтому разработка эффективных лечебно-профилактических средств, защищающих открытые участки кожи от воздействия химических аллергенов, является актуальной задачей и имеет важное социальное значение [2, 8].
Новым адсорбентом для связывания и нейтрализации токсических веществ (например, химических аллергенов) на поверхности кожи могут являться модифицированные наноалмазы (МНА) детонационного синтеза [3, 6]. Физикохимические свойства частиц МНА, прежде всего, наличие широкого спектра поверхностных химически активных функциональных групп, углеводородных фрагментов и микропримесей металлов [3, 9, 10, 13] определяют их высокие адсорбционные свойства к различным соединениям [4, 5, 7, 11, 12].
Целью данной работы являлось изучение влияния наноалмазов на структуру кожи экспериментальных животных в условиях нормы и при воздействии
хлорида кобальта, индуцирующего развитие контактного аллергического дерматита.
Материалы и методы
В работе использовали гидрозоли МНА (водные суспензии), полученные в Институте биофизики СО РАН (Красноярск) [3, 6], с концентрацией наночастиц 0,5 масс.%, 1,0 масс.% и 3,0 масс.%.
Развитие у животных контактного аллергического дерматита инициировали водным раствором 2% хлористого кобальта, наносимым на кожу по общепринятой схеме [8].
Эксперименты проведены на морских свинках (самки и самцы: возраст 3-4 месяца, вес 250-300 гр.). Животные были распределены на 7 экспериментальных групп (по 3 особи) в соответствии с задачами исследования (табл.1).
В межлопаточной области у каждого животного II - VII групп выстригали волосяной покров площадью 2,0 х 2,0 см. Подготовленную поверхность кожи условно делили на две области - левую и правую. Животным групп правую (опытную) область 1 раз в сутки обрабатывали соответствующими препаратами (раствор хлорида кобальта или гидрозоли МНА). Животным VI и VII групп правую область 1 раз в сутки обрабатывали сначала гидрозолем МНА, а через 12 часов - раствором хлорида кобальта. Такую обработку животных всех групп проводили в течение 10 суток, она заключалась в нанесении на кожную поверхность 0,5 мл препарата и его последующего легкого втирания в кожу.
На 12 сутки исследований оценивали степень сенсибилизации организма морских свинок к применяемым веществам путем однократного нанесения разрешающих доз препаратов (табл. 1) на левую (интактную) область кожной поверхности: животным групп - гидрозолей МНА с соответствующей
концентрацией наночастиц, животным II, VI, VII групп - раствора хлористого кобальта.
Для гистологических исследований на 12 сутки эксперимента у животных брали биопсию кожного материала, образцы кожи фиксировали в 10%-м
нейтральном формалине. Гистологические препараты готовили стандартным способом и окрашивали гематоксилин - эозином. Морфологические исследования выполнены на гистологических препаратах, оцифрованных в редакторе Adobe Photoshop CS3. Гистоморфометрию осуществляли двумя способами: определяли линейные размеры (толщина эпидермиса) с помощью линейки, откалиброванной в редакторе Adobe Photoshop CS3; оценивали относительный объем гистологических структур, используя морфометрическую сетку Салтыкова с 60 равноудаленными тестовыми точками. На каждом срезе изучали по 6 не перекрываемых участков, выбранных случайным образом. На каждый участок накладывали по 5 изображений сетки Салтыкова и считывали совпадения тестовых точек с регистрируемыми гистологическими структурами.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica V. 6,0 (StatSoft, 2003). При стереометрическом анализе мерных величин использовали методы альтернативной статистики (определяли дисперсию, среднее квадратичное отклонение, ошибку долевой части).
Для оценки статистической значимости различий данных использовали критерий Манна-Уитни (Manna-Whitney). Различия считались достоверными при р < 0,05[1].
Результаты и обсуждение
Показано, что при ежедневной обработке кожи опытных животных III - V групп гидрозолями МНА с концентрацией наночастиц 0,5, 1 и 3 масс.% в течение 10 суток видимых макроскопических изменений кожи не наблюдалось. Кроме того, и после однократной обработки левого (интактного) участка кожи морских свинок III - V групп на 12 сутки эксперимента разрешающей дозой гидрозолей МНА, через 24 часа ни у одного из животных видимых макроскопических изменений кожных покровов также не отмечалось. Эти данные могут свидетельствовать в пользу того, что МНА обладают сниженным (или отсутствующим) раздражающим действием на кожу и низкой сенсибилизирующей активностью.
При гистологическом исследовании образцов, взятых на 12 сутки эксперимента из опытных участков кожи животных III - V групп, которые обрабатывались МНА, обнаружена умеренно выраженная лимфоцитарная инфильтрация с небольшой примесью сегментоядерных лейкоцитов преимущественно поверхностных слоев дермы, а также утолщение эпидермиса.
Результаты морфометрического исследования свидетельствуют в пользу того, что под влиянием водных суспензий МНА происходит утолщение эпидермиса и этот эффект зависит от концентрации частиц в гидрозоле. Так, у морских свинок контрольной группы I толщина эпидермиса составляла 27,2 ± 1,44 мкм. В тоже время, у животных опытной III группы (МНА 0,5 масс.%) этот показатель составлял 41,6 ± 1,7 мкм; у животных IV группы (МНА 1 масс.%) он соответствовал 44,8 ± 1,92 мкм. У животных V группы (МНА 3 масс.%) толщина эпидермиса достигала 54,5 ± 3,04 мкм, что практически в 2 раза превышало аналогичный показатель контрольных животных. Механизм утолщения эпидермиса под влиянием МНА пока непонятен. Однако данные морфометрического исследования позволяют высказать гипотезу о том, что МНА усиливают секвестрирующую функцию эпидермиса с последующим его утолщением и отторжением.
Результаты гистостереометрического исследования состава кожи животных (табл. 2) позволяют сделать предположение, что МНА могут влиять на перераспределение и изменение уровня свободной интерстициальной жидкости в структурах дермы. Так, параметр «свободное интерстициальное пространство» у животных группы III достоверно (р < 0,05) снижен по сравнению с контролем (табл. 2) и имеет наименьшее значение. С повышением концентрации МНА данный параметр возрастает и у животных группы V он достоверно превышает уровень контроля на 20% (р < 0,05). В то же время, параметр «коллагеновые волокна» меняется диаметрально противоположно: у животных группы III он имеет наибольшее значение, достоверно превышающее контроль почти на 15% (р < 0,05), после чего наблюдается его снижение до контрольного уровня у животных группы V (различия не достоверны).
Мы полагаем, что изменение уровня свободной интерстициальной жидкости под действием МНА не является следствием развития воспалительной реакции кожи в ответ на наночастицы, поскольку параметр «нейтрофилы» не только не повышается у опытных животных III - V групп (табл. 2), а, наоборот, значительно (на 25 - 50%) снижается по сравнению с контролем (р < 0,05). Нельзя исключить, что изменение уровня интерстициальной жидкости под действием МНА может быть обусловлено снижением перспирации воды через кожу, за счет возникновения на ее поверхности гидрофильной пленки, гидродинамическим перераспределением воды в структурах дермы - оттоком из кровеносной системы в интерстиций. В пользу этого может свидетельствовать значительное (на 65 - 85%) снижение параметра «кровеносные сосуды» у всех опытных животных по сравнению с контролем, причем, у животных группы III эти изменения являются достоверными (р < 0,05).
Показано, что при обработке опытного участка кожи морских свинок II группы раствором хлористого кобальта в течение 10 суток, уже на 4-5 сутки у всех животных выявлялись клинические признаки развития контактного дерматита, которые нарастали во времени эксперимента, отмечались эритема, шелушение, папулы, микроэрозии, серозно-геморрагические корочки. При гистологическом исследовании образцов обнаружены: значительное утолщение эпидермиса, равномерный акантоз, вакуольная дистрофия в шиповатом и базальном слоях, явления спонгиоза, выраженный интерстициальный отек, сосуды сосочкового слоя дермы расширены, стенки сосудов отечны, в сосудах стаз. Помимо этого, после нанесения на левый (интактный) участок кожи морских свинок групп II, VI и VII разрешающей дозы водного раствора 2%-хлористого кобальта на 12 сутки эксперимента, через 24 часа у всех животных регистрировалась ограниченная эритема. При гистологическом исследовании образцов кожи, взятых из этих участков, выявлена выраженная лимфоцитарная инфильтрация (рис. 1). В целом, эти данные могут свидетельствовать в пользу выраженного первично раздражающего действия хлорида кобальта на кожные покровы морских свинок и сенсибилизации организма животных к нему.
Сравнительный анализ данных морфометрического исследования образцов кожи животных контрольной (II) и опытных (VI и VII) групп свидетельствует о том, что применение МНА позволяет нивелировать первично раздражающее и сенсибилизирующее действие хлорида кобальта на эпидермис морских свинок и величина этого эффекта зависит от концентрации наночастиц в гидрозоле. Так, у животных II группы толщина, эпидермиса составляла 126,0 ± 7,04 мкм. При этом, толщина эпидермиса у животных VI группы, кожные покровы которых предварительно обрабатывали гидрозолем МНА 0,5 масс.%, а затем хлоридом кобальта, была значительно (на 26,4%) ниже и составляла 92,8 ± 6,40 мкм. В то же время, у животных группы VII, которым кожные покровы предварительно обрабатывали гидрозолем МНА 3 масс.%, а затем хлоридом кобальта, толщина эпидермиса была практически такой же, как и у морских свинок контрольной II группы и составляла 128,9 ± 8,10 мкм.
Следует отметить (на основании данных гистологического исследования), что под воздействием хлорида кобальта развивается контактный дерматит, сопровождающийся пролиферацией эпидермиса с образованием мощных акантолитических выростов. При этом показано, что при действии хлорида кобальта на фоне МНА пролиферация эпидермиса происходит равномерно с формированием диффузно утолщенного пласта. Этот факт указывает на вероятность того, что под влиянием МНА в основном веществе дермы происходит снижение концентрации аллергена и, соответственно, уменьшается необходимость его секвестрации. Такая версия представляется вполне правомочной, поскольку известно, что МНА проявляют адсорбционные свойства к различным соединениям, включая токсические [4, 5, 7, 11, 12]. Вероятно, в нашем случае МНА могут являться адсорбентом, связывающим ионы кобальта, тем самым, нейтрализуя их действие на кожу (или внутри нее).
Не менее важным эффектом, выявленным в ходе эксперимента, является противоотечное действие МНА в условиях контактного аллергического дерматита. На это указывает достоверное снижение параметра «свободное интерстициальное пространство» в образцах кожи морских свинок, которые
подвергались последовательной обработке МНА и хлоридом кобальта (табл. 3). Так, у животных VI и VII групп (обработка кожи гидрозолями МНА 0,5 и 3 масс.%, а затем хлоридом кобальта) этот показатель имел значения 12,0 ± 0,28% и 17,0 ± 0,32% соответственно. При этом, у контрольных животных группы II (обработка кожи только хлоридом кобальта) данный показатель был значительно выше и составлял 20,0 ± 0,32 %.
Следует отметить также, что в ходе исследований выявлено достоверное (р <
0,05) снижение показателей «лимфоциты» и «нейтрофилы» в образцах дермы опытных животных VI и VII групп по сравнению с контрольными животными II группы (табл. 3), что может свидетельствовать о снижении интенсивности воспалительной реакции. Пока не представляется возможным дать объяснение наблюдаемым у опытных животных VI и VII групп изменениям показателей «кровеносные сосуды» и «фибробласты». Этот вопрос требует дальнейшего изучения.
В целом, полученные результаты позволяют говорить о протекторном действии МНА, нивелирующих первично раздражающее и сенсибилизирующее действие хлорида кобальта на кожу животных. Выяснение механизмов перераспределения уровня жидкости в структурах дермы и изменения показателей, их характеризующих, при действием МНА и хлорида кобальта требует дополнительных исследований.
Таким образом, в работе установлено, что в условиях физиологической нормы обработка кожных покровов морских свинок частицами МНА не сопровождается существенным проявлением видимых клинических признаков контактного дерматита. Это позволяет говорить о низкой токсичности МНА по отношению к кожным покровам животных, сниженном (или отсутствующем) раздражающем действии на кожу и низкой сенсибилизирующей активности наночастиц. По крайней мере, это продемонстрировано на примере использования гидрозолей МНА с концентрацией 0,5, 1 и 3 масс.%. Однако данные морфологического исследования кожи животных свидетельствуют в пользу того, что в условиях физиологической нормы МНА могут вызывать
утолщение эпидермиса и приводить к повышению уровня свободной интерстициальной жидкости. Установлено, что применение МНА снижает первично раздражающий эффект хлорида кобальта, индуцирующего развитие контактного дерматита у морских свинок. Нельзя исключить, что протекторное действие МНА опосредовано адсорбцией хлорида кобальта на их поверхности и, как следствие, взаимной нейтрализацией действия химического аллергена и наночастиц на кожу животных.
Авторы признательны заведующей кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии д.м.н., проф. Н.Н.Медведевой за возможность подготовки образцов кожи для гистологического исследования и сотруднику кафедры Е.Л. Жукову за помощь в выполнении гистологического исследования.
NANODIAMOND INFLUENCE ON SKIN STRUCTURE OF GUINEA PIGS IN PHYSIOLOGICAL CONDITION AND DURING LOCAL COBALT
CHLORIDE APPLICATION
V.I. Prokchorenkov, V.V. Grebennikova, A.A. Gajdash, E.Yu. Vasilyeva , Yu.V. Karacheva, A.P. Puzyr, V.S. Bondar
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky
Abstract. We studied how detonation nanodiamonds influence on the skin structure of guinea pigs in physiological conditions and after local cobalt chloride application. It was revealed that nanodiamonds do not have toxic and irritating skin effects and do not induce sensibilisation. Morphological examination suggested that under physiological conditions nano-particles increase sequestral function of the epidermis followed withthickening, rejection and appearance of free interstitial fluid. We found out that preventive treatment of the skin with nanodiamonds decrease irritation related the contact dermatitis caused by cobalt chloridе and have pronounced antiedema effect in guinea pigs.
Key words: nanodiamonds, cobalt chloride, allergic contact dermatitis.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Руководство. - М.: Медицина, 1990. - С. 82-89.
2. Антоньев А.А., Прохоренков В.И., Банников Е.А. Контактные аллергические дерматозы. - Красноярск, 1992. - С.3-11.
3. Бондарь В.С., Пузырь А.П. Наноалмазы для биологических исследований // Физика твердого тела. - 2004. - Т.46, вып.4. - С. 698-701.
4. Бондарь В.С., Позднякова И.О., Пузырь А.П. Применение наноалмазов для разделения и очистки белков // Физика твердого тела. - 2004. - Т.46, вып.4. - С.737-739.
5. Бондарь В.С., Пузырь А.П., Пуртов К.В. и др. Детонационный наноалмаз: создание новых материалов и технологий для выделения белков // Рос. нанотехнологии. - 2008. - Т.3, №5-6. - С.38-41.
6. Пат. 2252192. Рос. Федерация. Способ получения наноалмазов взрывного синтеза с повышенной коллоидной устойчивостью / А. П. Пузырь, В. С. Бондарь. - № заявки 2003119416/14; опубл. 20.05.2005. -Бюл. №14. - 5 с.
7. Пузырь А.П., Пуртов К.В., Шендерова О.А. и др. Адсорбция афлатоксина В1 наноалмазами детонационного синтеза // Доклады РАН. -2007. - Т.417, №1. - С. 117-120.
8. Рабен А.С., Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Экспериментальный аллергический контактный дерматит. - М., 1970. - С.95-108.
9. Gibson N., Shenderova O., Luo T.J.M. et al. Colloidal stability of modified nanodiamond particles // Diamond and Related Materials. - 2009. - Vol.18. -P.620-626.
10. Krueger A. The structure and reactivity of nanoscale diamond // J. Mater. Chem. - 2008. - Vol. 18. - P.1485-1492.
11. Puzyr A.P., Baron A.V., Purtov K.V. et al. Nanodiamonds with novel properties: A biological study // Diamond and Related Materials. - 2007. -Vol.16. - P. 2124-2128.
12. Purtov K.V., Burakova L.P., Puzyr A.P. et al. The interaction of linear and ring forms of DNA molecules with nanodiamonds synthesized by detonation // Nanotechnology. - 2008. - Vol.19. - P.1-3.
13. Schrand A.M., Ciftan Hens S.A., Shenderova O.A. Nanodiamond Particles: Properties and Perspectives for Bioapplications // Critical Reviews in Solid State and Materials Science. - 2009. - Vol.34. - P.18-74.
