CC BY
27
УДК 637.692:547.964.4 Табл. 1. Ил. 3. Библ. 14
ВЛИЯНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫХ БИОМОЛЕКУЛ НА ДИСФУНКЦИЮ ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ
Чернуха И.М., Федулова Л.В., Котенкова Е.А.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова», Москва
THE INFLUENCE OF TISSUE-SPECIFIC BIOMOLECULES ON ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN ATHEROSCLEROSIS
Chernukha, I.M., Fedulova, L.V., Kotenkova, E.A.
The Gorbatov's All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
аорта, белок, пептид, тканевая специфичность, эндотелий, противовоспалительная активность
Реферат.
Представлены результаты исследования противовоспалительных свойств аорт свиней и ультрафильтратов экстракта аорт свиней in vivo. Проведен последующий анализ исследуемого сырья на наличие пептидов, характерных для сосудов и обеспечивающих биокорри-гирующее действие. Установлено противоспалительное действие низкомолекулярного ультрафильтрата экстракта аорт свиней, свидетельствующее о восстановлении нормального функционирования эндотелия сосудов, повышении его защитной реакции. Предположительно, важную роль в биологическом действии ткани аорты свиней играют тканеспецифические пептиды. Было показано снижение концентрации внеклеточного фактора адгезии форменных элементов крови к эндотелию (VCAM-1) на 25,8% (р<0,05) по отношению к контролю уже на 14 сутки лечения. Отмечалась обратная тенденция в отношении внутриклеточного фактора адгезии форменных элементов крови к эндотелию (ICAM-1): его концентрация резко возросла на 14 сутки лечения до 354,7±17,3 пг/мл, что на 70,0% (р<0,05) выше показателя контрольных животных, затем сравнялась с контрольными значениями. При исследовании биологического действия наибольшая динамика была отмечена у низкомолекулярного экстракта аорты свиней: концентрация С-реактивного белка (СРБ) и васкуляр-ного эндотелиального фактора роста (VEGF) снизилась на 34,0% (р<0,01) и 58,3% (р<0,001), соответственно, по отношению к контролю. Анализ тканевой специфичности пептидного профиля аорты свиней в сравнении в соответствующей мышечной тканью выявил наличие 22 тканеспецифичных пептида с молекулярной массой до 2000 Да. Выявленная динамика концентрационных изменений маркеров воспаления эндотелия свидетельствует о нивелировании патологических процессов.
Keywords:
aorta, peptides, tissue specificity, endothelium, antiinflammatory activity
Summary.
The study presents the research results of pig aorta as a source of tissue-specific bioactive substances. Anti-inflammatory properties of native aorta tissues, extract, high and low molecular weight ultrafiltrates was investigated on in vivo animal models. Analysis of peptide profile was also carried out. Anti-inflammatory action of low molecular weight ultrafiltrate may correspond to recovery endothelial functioning and enhance its defense response. Hypothetically, tissue-specific peptides are involved in biological action of pig aorta tissues. On 14th day of treatment concentration of vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) was shown to be decreased in experimental rat serum by 25.8% (p<0.05) in comparison with control group. In contrast, concentration of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) sharply increased on the 14th day of treatment up to 354.7±17.3 pg/ml, which was by 70.0% (p<0.05) higher than in control animals. On 14th day of treatment ICAM-1 concentration equalized with control group. Low molecular weight ultrafiltrate of pig aorta tissues extract was revealed to possess more intensive bio-corrective effect compared with native extract and high molecular weight ultrafiltrate. Concentration of C-reactive protein (CRP) and vascular endothelial growth factor (VEGF) decreased by 34.0% (p<0.01) and 58.3% (p<0.001), respectively, in serum of experimental animals in comparison with control group. Analysis of the pig aorta tissue specificity in comparison with porcine muscle tissue was resulted in peptide profile data. Twenty two tissue-specific peptide with a molecular weight lower 2000 Da were revealed in aorta tissues. The observed dynamic of concentration changes in endothelial inflammatory markers may indicate regression of atherosclerosis to an earlier stage.
Динамичное развитие разработок в области создания продуктов питания функционального и специализированного назначения обусловлено фундаментальным подходом к поиску альтернативных ингредиентов, в том числе к оценке и подтверждению их биокорригирующих свойств.
Среди наиболее актуальных разработок - пептиды мяса, присутствующие в нативном виде или входящие в состав аминокислотных цепочек структурных мышечных белков и высвобождающиеся в результате действия ферментов желудочно-кишечного тракта, протеиназ и пептидаз бактериального, животного и растительного происхождения, а также в ходе технологического процесса [10, 13, 14]. Согласно анализу баз данных в мясных белках содержатся аминокислотные последовательности, обладающие гипотензивным, антиоксидант-ным, опиодным, иммуномодулирующим, пребиотиче-ским, минерал-связывающим, гипохолестеринемиче-ским и антимикробным действием [5, 6, 10, 11, 13, 14]. Хотелось бы отметить, что до сих пор слабо развито направление идентификации и определения биологического действия тканеспецифических биологических веществ белковой и пептидной природы, содержащихся в соответствующих субпродуктах убоя.
При оценке гиполипидемического и антиатероскле-ротического действия функциональных продуктов питания и биологически активных добавок наравне с традиционным анализом липидного спектра сыворотки крови оцениваются концентрационные изменения факторов дисфункции эндотелия: концентрация С-ре-активного белка (СРБ), внутри (1САМ-1) и внеклеточных (УСАМ-1) факторов адгезии форменных элементов крови к активированному эндотелию и сосудистого эндотелиального фактора роста (УБОБ). СРБ синтезируется в печени, является представителем семейства белков острой фазы воспаления [4], поэтому снижение концентрации СРБ в сыворотки крови напрямую коррелирует со снижением воспалительного процесса. Важную роль в процессах атерогенеза играют маркеры воспаления, концентрационные изменения которых непосредственно коррелируют с воспалительными стадиями атеросклероза. УСАМ-1 - молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа, экспрессируется на эндотелии, макрофагах, стромальных клетках костного мозга и некоторых других типах клеток и обеспечивает адгезию лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов (но не нейтрофилов) к активированному эндотелию с последующей их пенетрацией в очаг воспаления. 1САМ-1 - молекула межклеточной адгезии 1 типа, экспрес-сируется на сосудистом эндотелии, моноцитах, В- и Т-лимфоцитах и обеспечивает адгезию нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к активированному сосудистому эндотелию с последующей их миграцией в очаг воспаления [7-9]. УБОБ является основным регулятором образования микрососудов. Он способствует развитию атеросклероза сосудов и ряду других патологических состояний, сопровождающихся дисфункцией эндотелия [1, 12]. Кроме того, указанные маркеры воспаления могут коррелировать с различными стадиями
атерогенеза. Так, Fotis и др., 2014 в своих недавних исследованиях сообщили, что увеличение концентрации ICAM-1 соответствует ранним стадиям атеросклеро-тических поражений, в то время как VCAM-1, вероятно, экспрессируется на более позднем этапе [8]. Gross и др., 2012 также сообщают, что увеличение концентрации растворимого 1САМ-1 соответствует ранним изменениям в стенке артерии [9]. Концентрация же СРБ и VEGF увеличивается уже с начальной стадии воспаления и находится в прямой корреляции с тяжестью атеросклероза [1, 4, 12].
Таким образом, на основе знаний о тканевой специфичности целью настоящей работы было изучить противовоспалительное действие аорт свиней in vivo и провести последующий анализ исследуемого сырья на наличие пептидов, характерных для сосудов и обеспечивающих биокорригирующее действие.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись ткани аорты свиней, экстракт аорты свиней, высокомолекулярный и низкомолекулярный ультрафильтраты экстракта аорты свиней в 0,9% растворе натрия хлорида с концентрацией белка 2,45 г/л.
Моделирование экспериментального атеросклероза у крыс стока Wistar проводилось в соответствии с [3]. По окончании моделирования животные опытной группы получали с рационом измельченную аорту из расчета 5 г/голову, животные контрольной группы переводились на стандартный рацион вивария. На 14 сутки и 28 сутки отбирали биологический материал.
Моделирование гиперлипидемии и атеросклероза у морских свинок проводили в соответствии с [2]. По окончании моделирования животным контрольной группы вводили физиологический раствор, 1 группе животных - экстракт, 2 группе - высокомолекулярный ультрафильтрат (>30 кДа), 3 группы - низкомолекулярный ультрафильтрат (<30 кДа), 4 группу составили интактные морские свинки. Все исследуемые образцы вводились per os из расчета 8 мг белка/голову на протяжении 14 суток.
По окончании эксперимента животных усыпляли в камере для эвтаназии VETtech в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, проводили аутопсию и забор крови на иммуноферментные исследования. Иммуноферментные исследования проводились на анализаторе ImmunoChem 2100 (HTI, США) в соответствии с методами ELISA на реактивах (Cusabio, Китай).
Анализ пептидных фракций проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на трехквадропольном масс-спектрометре Agilent 64-10 (Agilent Technologies, США).
Обработка полученных результатов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента по стандартной методике статистической обработки полученных результатов в программе «Statistica 17.0».
Результаты исследования
Показано, что на 14 сутки лечения в крови крыс опытной группы концентрация VCAM-1 уменьшалась
на 25,8% (р<0,05) по отношению к контролю; на 28 сутки тенденция к уменьшению концентрации УСЛМ-1 сохранилась и составила в среднем 23,2% (р<0,001). В отношении 1СЛМ-1 наблюдалась обратная тенденция. На 14 сутки лечения только у животных опытной группы концентрация 1СЛМ-1 составила 354,7±17,3 пг/мл (р<0,05), что на 70,0% выше показателя контрольных животных. К 28 суткам отмечалось снижение концентрации 1СЛМ-1 до уровня животных контрольной группы, превышая показатели интактных крыс (таблица 1).
Таблица 1.
Концентрация маркеров воспаления в сыворотке крови лабораторных животных в процессе эксперимента
1266,9 Да, 5 - в диапазоне 818,4-707 Да, 5 - в диапазоне 165,1-140,1 Да и 2 - в диапазоне 105,1-81,1 Да.
Показатель Интакт Контроль Опытная группа
14 сутки лечения 28 сутки лечения 14 сутки лечения 28 сутки лечения
VCAM-1, нг/мл 11,66±1,39 18,46±2,06 14,07±0,38 13,69±6,74' 8,70±2,193
ICAM-1, пг/мл 54,27±6,67 209,0±8,3 255,9±15,0 354,7±17,3' 276,9±11,5
Интакт Больные Контроль 1 группа 2 группа 3 группа
Рисунок 2. - Концентрация УБОБ в сыворотке крови лабораторных животных в процессе эксперимента 1 - р<0,05 и 3 - р<0,001 по отношению к контрольным животным.
1 - р<0,05 по отношению к контрольным животным,
2 - р<0,01 по отношению к контрольным животным,
3 - р<0,001 по отношению к контрольным животным.
При исследовании биологического действия белковых и белково-пептидных фракций, наибольшее снижение СРБ отмечалось в сыворотке крови морских свинок 3-й опытной группы, получавших низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорты свиней и составил 0,99±0,06 мкг/мл, что на 34,0% ниже аналогичного показателя контрольной группы (р<0,01) (рисунок 1).
х104 1.75 1.5 1.25 1
0.75 0.5 0.25 0
+ESI Scan (0.107-0.246 min, 14 scans) Frag=90.0V2l.d 104.1
413.2
I0 400 600 ^ 800-^ 1000 120ff-[400 1600 1800
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
Рисунок 1. - Концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови лабораторных животных в процессе эксперимента
2 - р<0,01 по отношению к контрольным животным.
Наибольшее снижение УБОБ отмечалось в сыворотке крови животных 3-й опытной группы, получавших низкомолекулярный ультрафильтрат экстракта аорты свиней, и составил 3,92±0,97 пг/мл, что на 58,3% ниже аналогичного показателя контрольной группы (р<0,001) (рисунок 2).
Анализ тканевой специфичности пептидного профиля исследуемого сырья в сравнении в соответствующей мышечной тканью проводился на системе ВЭЖХ с трехквадропольным масс-спектрометром (рисунок 3).
В аорте свиней было обнаружено 22 тканеспе-цифичных пептида 9 из них - в диапазоне 1402,6-
Рисунок 3. - Пептидный профиль ткани аорты свиней
Обсуждение результатов
Снижение концентрации УСЛМ-1 и увеличение концентрации 1СЛМ-1 к 14 суткам лечения и стабилизация к 28 суткам лечения в крови крыс опытной группы может свидетельствовать о нивелировании патологических процессов, характерных для атеросклероза в сторону более ранней стадии. Установлено противовоспалительное действие низкомолекулярного ультрафильтрата экстракта аорт свиней, характеризующееся снижением концентрации УБОБ и С-реактивного белка по отношению к контролю, что свидетельствует о восстановлении нормального функционирования эндотелия сосудов, повышении его защитной реакции. Предположительно, важную роль в биологическом действии ткани аорты свиней играют тканеспецифические пептиды с молекулярной массой до 2000 Да.
КОНТАКТЫ:
Чернуха Ирина Михайловна а imcher@inbox.ru Федулова Лилия Вячеславовна afedulova@vniimp.ru Котенкова Елена Александровна а lazovlena92@yandex.ru ^+7 (495) 676-9211
14
12
10
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Мангшьова Т.О. Система сосудистого эндотелиального фактора роста и артериальная гипертензия/ Т.О. Мангшьова// Серце i судини.-2012.-№4.-с.107-115.
2. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств/ А.Н. Миронов, Н.Д. Бунатян и др. - М.: Гриф и К, 2012. — 944 с.
3. Патент на изобретение № 2524127, 30.05.2014 г. Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Котенкова Е.А., Федулова Л.В. Способ моделирования экспериментального атеросклероза.
4. Сеидова Г.Б. С-реактивный белок и его связь с метаболическим синдромом, ассоциированным с ишемической болезнью сердца у женщин в пре- и постменопаузе/ Г.Б. Сеидова// Вестник аритмологии.- 2005.-№ 41.- с. 47-50.
5. Чернуха И.М. Биотрансформация побочного мясного сырья как инновационный подход к созданию протеомно-пептидных средств направленного действия/ И.М. Чернуха, Л.А. Люблинская, Л.В. Федулова, Е.Р. Василевская,
E.А. Котенкова, А.Н. Макаренко //Все о мясе. - №2. - 2015. -14-17 С.
6. Ahhmed A.M. A review of meat protein hydrolysates and hypertension/ A.M. Ahhmed, M. Muguruma// Meat science.-2010.-№86.-р. 110-118.
7. Alrefaie1 Z. Leucocyte Infiltration in Experimental Warm Hepatic Ischemia Reperfusion; Effect of Ischemic Pre and Post Conditioning; Implications of Adhesion Molecules /Z. Alrefaie1, L. Rashed// Life Science Journal.- 2012.- V.9.- №3.-р.2290-2295.
8. Fotis L. Intercellular Adhesion Molecule (ICAM)-1 and Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM)-1 at the Early Stages of Atherosclerosis in a Rat Model /L. Fotis, G. Agrogiannis, I.S. Vlachos, A. Pantopoulou, A. Margoni, M. Kostaki, C. Verikokos, D. Tzivras, D.P. Mikhailidis, D. Perrea// In vivo.-2012.-№ 26.-p. 243-250.
9. Gross M.D. Circulating soluble ICAM-1 and subclinical atherosclerosis: The Coronary Artery Risk Development in Young Adults (CARDIA) Study/ M.D. Gross, S.J. Bielinski, J.R. Suarez-Lopez, A.P. Reiner, K. Bailey, B. Thyagarajan, J.J. Carr, D.A. Duprez, D.R. Jacobs// Clinical Chemistry. -2012. -V. 58(2). - P. 1-14. - doi:10.1373/clinchem.2011.168559.
10. Handbook of Meat and Meat Processing, Second Edition/ edited Y. H. Hui //USA: Taylor & Francis Group.-2012.-1000 p.
11. Lafarga T. Bioactive peptides from meat muscle and byproducts: generation, functionality and application as functional ingredients/ T. Lafarga, M. Hayes// Meat science.-2014.-№98.-р. 227-239.
12. Modanlou H.D. Ontogeny of VEGF, IGF-I, and GH in Neonatal Rat Serum, Vitreous Fluid, and Retina from Birth to Weaning/ H.D. Modanlou, Z. Gharraee, J. Hasan, J. Waltzman, S. Nageotte, K.D.A. Beharry// IOVS.- 2006ю- V. 47.- №2.- р. 738744.
13. Nutraceutical Science and Technology (Book 4). Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease/edited by Y. Mine,
F. Shahidi//USA: Taylor & Francis Group.-2006.-688 p.
14.Udenigwe C.C. Meat proteome as source of functional biopeptides / C.C. Udenigwe, A. Howard // Food Research International.-2013.-№54.-р. 1021-1032.
REFERENCES:
1. Mangilova T.O. Sistema sosudistogo endotelialnogo factora rosta i arterialnaya gipertenziya [The system of vascular endothelial growth factor and arterial hypertension] / T.O. Mangilova // Serdtse and sosudy.-2012.-№4.-P.107-115.
2. Mironov A.N. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv [Guide to preclinical testing of medicines] / A.N. Mironov, N.D. Bunatyan et al. - M.: Grif&K, 2012. - 944 p.
3. Patent na izobreteniye [Patent for invention] № 2524127, 30.05.2014, Lisitsyn A.B., Chernukha I.M., Kotenkova E.A., Fedulova L.V. Sposob modelirovaniya experimentalnogo aterosclerosa [Method of atherosclerosis experimental modeling].
4. Seidova G.B. C-reactivnyi belok i yego svyaz s metabolicheskim sindromom, assoziirovannym s ishemicheskoy boleznyu serdtsa u zhenshin v pre- i postmenopause [C-reactive protein and its relation with metabolic syndrome associated with coronary heart disease in pre- and postmenopausal women] / G.B. Seidova // Vestnik aritmologii.- 2005.-№ 41.- P. 47-50.
5. Chernukha I.M. Biotransphormaziya pobochnogo syrya kak innovazionnyy podkhod k sozdaniyu proteomno-peptidnykh sredstv napravlennogo deystviya [Biotransformation of meat by-product as an innovative approach for substanses with known protein and peptide composition] / I.M. Chernukha, L.A. Lublinskaya, L.V. Fedulova, E.R. Vasilevskaya,
E.A. Kotenkova, A.N. Makarenko // Vse o myace. - №2. - 2015. - P. 14-17.
6. Ahhmed A.M. A review of meat protein hydrolysates and hypertension/ A.M. Ahhmed, M. Muguruma// Meat science.-2010.-№86.- P. 110-118.
7. Alrefaie1 Z. Leucocyte Infiltration in Experimental Warm Hepatic Ischemia Reperfusion; Effect of Ischemic Pre and Post Conditioning; Implications of Adhesion Molecules /Z. Alrefaie1, L. Rashed// Life Science Journal.- 2012.- V.9.- №3.- P.2290-2295.
8. Fotis L. Intercellular Adhesion Molecule (ICAM)-1 and Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM)-1 at the Early Stages of Atherosclerosis in a Rat Model /L. Fotis, G. Agrogiannis, I.S. Vlachos, A. Pantopoulou, A. Margoni, M. Kostaki, C. Verikokos, D. Tzivras, D.P. Mikhailidis, D. Perrea// In vivo.-2012.-№ 26.-P. 243-250.
9. Gross M.D. Circulating soluble ICAM-1 and subclinical atherosclerosis: The Coronary Artery Risk Development in Young Adults (CARDIA) Study/ M.D. Gross, S.J. Bielinski, J.R. Suarez-Lopez, A.P. Reiner, K. Bailey, B. Thyagarajan, J.J. Carr, D.A. Duprez, D.R. Jacobs// Clinical Chemistry. -2012. -V. 58(2). - P. 1-14. - doi:10.1373/clinchem.2011.168559.
10. Handbook of Meat and Meat Processing, Second Edition/ edited Y.H. Hui //USA: Taylor & Francis Group.-2012.-1000 p.
11.Lafarga T. Bioactive peptides from meat muscle and byproducts: generation, functionality and application as functional ingredients/ T. Lafarga, M. Hayes// Meat science.-2014.-№98.-p. 227-239.
12. Modanlou H.D. Ontogeny of VEGF, IGF-I, and GH in Neonatal Rat Serum, Vitreous Fluid, and Retina from Birth to Weaning/ H.D. Modanlou, Z. Gharraee, J. Hasan, J. Waltzman, S. Nageotte, K.D.A. Beharry// IOVS.- 2006.- V. 47.- №2.- P. 738-744.
13. Nutraceutical Science and Technology (Book 4). Nutraceutical Proteins and Peptides in Health and Disease/edited by Y. Mine,
F. Shahidi//USA: Taylor & Francis Group.-2006.-688 p.
14. Udenigwe C.C. Meat proteome as source of functional biopeptides/C.C. Udenigwe, A. Howard//Food Research International.-2013.-№54.- P. 1021-1032.
