CC BY
31
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ß-ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА... 1 27
УДК 577.112.6+577.152.321:612.112.3
1 2 13 4
А.Н. Хочанский , А.Е. Земляков , О.В. Калюжин' , В.В. Решетникова ВЛИЯНИЕ Р-ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА НА NK-АКТИВНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ И ФАГОЦИТАРНУЮ ФУНКЦИЮ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА
1ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, Москва
2Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, Украина 3ГБОУВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва 4ФГБУ «РОНЦ им H.H. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Хочанский Андрей Николаевич, младший научный сотрудник лаборатории иммунопатологии и биотехнологии адрес: 117418 Москва, ул. Цюрупы, д. 3; тел.: +7(910)436-43-14 e-mail: darkstalker@mail.ru
Статья поступила 16.09.2013, принята к печати 27.01.2014.
Резюме
Изучено влияние ß-гликозидов МДП с алифатической, циклической и трициклической (адамантильной) структурой агликона на NK-активность МЛ и фагоцитарную функцию нейтрофилов человека. Инкубация мо-нонуклеаров с МДП или ß-гептилгликозидом МДП стимулировала цитотоксическую активность этих клеток. Добавление этих же двух гликопептидов к цельной крови усиливала фагоцитарную функцию нейтрофилов. Другие гликозиды с большим числом атомов углерода в алифатической цепи агликона, также как с циклической структурой последнего в целом были менее активными.
Ключевые слова: МДП, гликозиды, агликон, мононуклеарные лейкоциты, NK-активность, фагоцитоз.
A.N. Khochanskyi1, A.E. Zemlyakov2, O.V. Kalyuzhin1'3, V.V. Reshetnikova4 EFFECT OF MURAMYL DIPEPTIDE ß-GLYCOSIDES ON NK-ACTIVITY OF HUMAN MONONUCLEAR LEUKOCYTES AND PHAGOCYTIC FUNCTION OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES
1Human Morphology Research Institute of RAMS, Moscow
2Taurida National V.I. Vernadsky University, Simferopol, Ukraine
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
4FSBI« N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
We have studied the influence of ^-glycosides of MDP with aliphatic, cyclic and tricyclic (adamantyl) aglycon structure on NK activity of human mononuclear leukocytes and phagocytic function of neutrophilic granulocytes. Incubation of mononuclear cells with MDP or MDP P-heptylglycoside was shown to cause stimulation of cytotoxic activity of these cells. Addition of the above two glycopeptides to the whole blood enhanced the phagocytic function of neutrophils. The other glycosides with greater number of carbon atoms in aliphatic chain as well as with cyclic structure of aglycon were generally less active.
Key words: MDP, glycosides, aglycon, mononuclear leucocytes, NK acivity, phagocytosis.
Введение
МДП - компонент пептидогликана клеточной стенки бактерий - является объектом пристального внимания как молекула, модификации химической структуры которой привели к созданию нескольких иммунотропных препаратов и большой группы перспективных фармакологических веществ [4; 11; 16]. МДП и его производные обладают широким спектром биологический свойств, что определяет возможность применения этих гликопептидов в рамках разных иммунотерапевтических/профилактических подходов [9]. Раскрытие молекулярных механизмов действия МДП и его производных, в том числе аго-низма цитозольных рецепторов N002 [13; 14], послужило новым стимулом для поиска эффективных и безопасных синтетических аналогов МДП. Ранее мы показали наличие выраженной иммуномодули-рующей активности ряда гликозидов МДП [3; 8; 10]. Более того, определены некоторые физико-химические характеристики молекулы в целом [7; 15] и пространственно-конфигурационные особен-
№ 1/том 13/2014
ности агликонов [1; 2; 5; 6], которые позволяют гли-козидам МДП наиболее эффективно воздействовать на функцию клеток иммунной системы. Однако вопрос о влиянии структуры агликона на иммуномо-дулирующее действие этих соединений во многих аспектах остается открытым.
Вышесказанное свидетельствуют о целесообразности продолжения поиска эффективных имму-номодуляторов среди гликозидных аналогов МДП и уточнения зависимости биологической активности этих гликопептидов от строения агликона.
Материалы и методы
МДП и его Р-гликозиды (гептил-, децил-, до-децил-, циклогексил-, циклооктил-, циклодецил-, циклододецил- и адамантил-МДП) синтезированы как описано ранее [2].
Матричные растворы исследуемых гликопептидов готовили путем их разведения в физиологическом растворе (ПанЭко, Россия) с добавлением 10 % ДМСО (ПанЭко, Россия).
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕß-ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА...
МЛ, служившие КЭ, выделяли из интрефаз- Обращает на себя внимание снижение имму-ного кольца, образуемого после 25-минутного цен- номодулирующей активности гликозидов МДП с трифугирования гепаринизированной (25 Ед/мл, алифатической (линейной) структурой агликона ПанЭко, Россия) крови здорового донора при 1500 при увеличении числа атомов углерода в последнем об/мин с раствором фиколла-урографина (ПанЭко, от 7 до 10 и далее от 10 до 12. Ранее подобные за-Россия). МЛ трижды отмывали в среде RPMI 1640 кономерности были описаны в тест-системе, в ко-(ПанЭко, Россия) и ресуспендировали до концентра- торой в качестве КЭ использовали мышиные спле-ции 1,2х106 клеток/мл в ППС - RPMI 1640, содер- ноциты, а в качестве мишеней - NK-чувствитель-жашей 2 ммоль L-глугамина, 1250000 Ед пеницил- ные клетки лимфомы YAC-1 : гептил-МДП превос-лина и стрептомицина (ПанЭко, Россия) и 10% эм- ходил по биологической активности немодифиро-бриональной телячьей сыворотки (Hvclone, США). ванный МДП, а его гомолог гексадецил-МДП заВ качестве КМ пои определении NK-актив- метно уступал по активности этому референс-ности МЛ использовали клетки эритролейкемии контролю [8; 15]. человека линии К562 (коллекция культур и штам- Возможно падение биологической активно-мов ФГБУ «РОНП им. H.H. Блохина» РАМН). КМ сти с увеличением длины липофильного «хвоста», ресуспендировали в ППС до концентрации 1,2х106 присоединенного к гликозидному центру МДП, клеток/мл. связано с нарушением комплементарности данных В лунки 96-луночного планшета (NUNC, Да- веществ к NOD2-pe4enropaM и другим сенсорам ния) вносили по 100 мкл суспензии КЭ и по 20 мкл биологических эффектов мурамилпептидов. Такой среды, содержащей испытываемые соединения в зависимости биологической активности молекулы конечных концентрациях 1; 10 и 100 мкмоль. После от количества атомов углерода не выявлено у гли-24-часового культивирования в атмосфере увлаж- козидов с циклической структурой агликона. ненного воздуха с 5 % СО? при температуре 37 °С к Замещение водорода в гидроксильной груп-КЭ добавляли по 100 мкл взвеси КМ так, чтобы пе в положении С1 остатка мурамовой кислоты на соотношение КЭ : KM составляло 1 : 1, затем куль- высокогидрофобную и жесткую трициклическую туры клеток инкубировали еще в течение 24 ч. В структуру (адамантил-МДП), обладающую наиконтрольных лунках культивировали только КМ большей гидрофобностью, несколько снижало био-или только КЭ в среде с аналогичными концентра- логическую активность молекулы МДП в условиях циями мурамилпептидов. За 2 ч до конца инкубации использованной тест-системы in vitro. в каждую лунку вносили по 15 мкл 5 %-ного р-ра Фагоцитарная активность нейтрофильных 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиума бромида гранулОЦИТОВ крови Здоровых доноров достоверно (МТТ; ПанЭко, Россия). не изменялась в ответ на воздействие тестируемых По завершении культивирования из лунок веществ в концентрации 10 мкмоль. Однако МДП и удаляли надосадочную жидкость и добавляли по гептил-МДП проявляли выраженную тенденцию к 150 мкл диметилсульфоксида. Затем планшет по- увеличению числа активно фагоцитирующих ней-мешали на 10 минут в орбитальный шейкер с уста- трофилов. новленной скоростью вращения платформы 120 Остальные испытанные производные МДП не об/мин, после чего определяли оптическую плот- вызывали статистически значимых изменений ФЧ и ность раствора при X 540 нм с помощью Фотометра ФИ по сравнению с таковыми в контроле. (Multiscan, Финляндия) и оценивали цитотоксиче- Полученные данные подтверждают высокую скую активность МЛ [12]. биологическую активность гептил-МДП, который в Влияние гликозидов МДП на фагоцитарную целой серии ранее проведенных опытов in vitro и in активность нейтрофилов определяли по изменению vivo превосходил в этом плане немодифицирован-их способности поглощать частицы латекса в цель- ный МДП и многие его аналоги [3; 10]. То, что в ной крови здорового донора. рамках настоящего исследования гептил-МДП не К 1 мл гепаринизированной (25 Ед/мл) крови превышал по активности МДП, отчасти можно добавляли 0,5 мл р-ра Хэнкса (ПанЭко, Россия), объяснить ограниченными условиями и особенно-содержащего исследуемые гликопептиды в конеч- стями использованных модельных тест-систем. ной концентрации 10 мкмоль и 50 мкл суспензии Так, при изучении влияния МДП и его гли-частиц латекса (ПанЭко, Россия) с концентрацией козидов на NK-активность МЛ использовали толь-1х107 частиц/мл, и инкубировали в течение 24 ч, ко одно соотношение КЭ : КМ (1 : 1), которое, ве-после чего определяли ФЧ, среднее количество по- роятно, не является оптимальным и достаточно глошенных частиц латекса на 1 нейтрофил, и ФИ, чувствительным для сравнения близких по химиче-долю фагоцитирующих нейтрофилов (%). ской структуре веществ. Кроме того, после 24-часовой обработки МЛ Результаты и обсуждение изучаемыми гликопептидами, к этим клеткам добавляли КМ без предварительной отмывки первых, Внесение в культуру МЛ немодифицирован- т.е. мурамилпептиды присутствовали в культуре ного МДП и его гликозидных аналогов по разному клеток в течение всего эксперимента и теоретиче-влияло на цитотоксическую активность этих клеток ски могли изменять выживаемость клеток, подвер-по отношению к NK-чувствительной линии К652. женных цитотоксическому действию NK-клеток. При соотношении КЭ : КМ, равном 1 : 1, Для сравнения, преимущества гептил-МДП над наибольшую стимулирующую способность про- МДП ранее были продемонстрированы в тест-явили МДП и гептил-МДП. При этом действие этих системе, в которой соотношение КЭ : КМ составля-гликопептидов характеризовалась четкой дозозави- ло 25 : 1 и выше, а КЭ после инкубации в среде, симостью, а в концентрации 100 мкмоль они усили- содержащей МДП и его аналоги, тщательно отмывали цитотоксическую активность МЛ на 31-36 %. вали перед внесением КМ [8; 15]. Помимо этих соединений, достоверную стимуля- Действие гликозидов МДП на фагоцитарную цию NK-активности вызывали децил-МДП в мак- активность нейтрофилов сравнивались лишь в од-симальной из использованных концентраций, а ной эквимолярной концентрации в разбавленной также циклооктил-МДП в дозах 1 и 100 мкмоль. цельной крови, что говорит о необходимости про-
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ß-ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА... | 29
Таблица 1
Влияние гликозидов МДП на цитотоксическую активность мононуклеаров по отношению к клеткам NK - чувствительной линии K562 (КЭ:КМ = 1:1)_
Исследуемое вещество Цитотоксическая активность мононуклеаров (%), обработанных исследуемыми гликопептидами в различных концентрациях
100 мкмоль 10 мкмоль 1 мкмоль
МДП 75±4* 70±2* 53±1
гептил-МДП 72±5* 69±1* 55±3
децил-МДП 60±1* 52±4 56±4
додецил-МДП 53±3 51±1* 54±1
адамантил-МДП 57±2 49±1* 50±2*
циклосекстил-МДП 55±3 54±5 52±3
циклоктил-МДП 62±2* 60±3 59±1*
Циклодецил-МДП 58±1 56±2 56±2
Контроль 55±2
*p<0,05 по сравнению с контролем
Таблица 2
Влияние гликозидов МДП (10 мкмоль) на фагоцитараную активность нейтрофилов цельной крови человека
Исследуемое вещество ФИ (%) ФЧ (усл. ед)
МДП 70±3 4-6
гептил-МДП 68±2 3-4
децил-МДП 62±1 2-3
додецил-МДП 58±5 3-4
адамантил-МДП 58±4 2-3
циклогексил-МДП 61±2 3-4
циклооктил-МДП 63±1 3-4
циклодецил-МДП 59±3 2-3
должения этих исследований с использованием более широкого диапазона доз исследуемых веществ и, возможно, с использованием сепарированных гранулоцитов.
Кроме того, предстоит ответить на вопрос, как гликозиды МДП различаются межу собой и с немодифированным МДП по способности вызывать N0D2-зaвиcимyю активацию транскрипционных факторов и функции иммунокомпетентных клеток?
Выводы
Полученные данные указывают, что увеличение длины агликона уменьшает биологическую активности производных МДП, что возможно связано с нарушением комплиментарное™ данных веществ по отношению к N0D2-peцeптopy. Из этого следует, что самым эффективным методом поиска более активных и безопасных модификаций МДП является синтез таковых с короткой цепью гликозидного радикала агликона.
Литература
1. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В. и др. Гликозиды №ацетилмурамоил-Ь-аланил-Б-изоглутамина. Влияние конфигурации гликозидного центра и природы агликона на биологическую активность // Биоорганическая химия. - 2003. - Т. 29, № 3. - С. 316-22.
2. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В. и др. Синтез и исследование влияния конфигурации гли-козидной связи и природы агликона на иммуностимулирующую активность гликозидов мурамоил-дипептида // Физиологически активные вещества. - 2002. - № 1. - С. 35-8.
3. Калюжин О.В. Иммуномодулирующая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглутамина // Вестник новых медицинских технологий. - 2003. - Т. 10, № 1-2. - С. 2832.
4. Калюжин О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - № 1. - С. 104-8.
5. Калюжин О.В., Земляков А.Е., Калюжина Е.В. и др. Действие гликозидов мурамилдипептида на пролиферацию лимфоцитов и выработку ими интерлейкина-2 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 8. - С. 186-90.
6. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Калюжина Е.В. и др. Влияние конфигурации гликозидной связи и структуры агликона гликозидов мурамилдипептида на их способность стимулировать продукцию интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли макрофагами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 9. - С. 326-8.
7. Калюжин О.В., Фукс Б.Б. Влияние гидро-липофильного баланса производных мурамилдипептида на их взаимодействие с биомембранами и включение в клетки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1996. - Т. 122, № 12. - С. 658-61.
8. Калюжин О.В., Фукс Б.Б., Бовин Н.В. и др. Иммуномодулирующая активность новых производных мурамилдипептида in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - Т. 117, № 5. - С. 510-3.
9. Караулов A.B., Калюжин О.В. Иммунотерапия инфекционных болезней: проблемы и перспективы // Терапевтический архив. - 2013. - Т. 85, № 11. - С. 100-9.
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ВЛИЯНИЕ ß-ГЛИКОЗИДОВ МУРАМИЛДИПЕПТИДА...
10. Караулов A.B., Калюжин О.В., Земляков А.Е. Биологическая активность гликозидных производных К-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглутамина // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, № 1. - С. 14-24.
11. Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Карсонова М.И. Препараты мурамилдипептидового ряда - иммуно-тропные лекарственные средства нового поколения // Int. J. Immunorehabilitation. - 1997. - № 6. - C.
12. Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И. МТТ-колориметрический метод определения цитотокси-ческой активности естественных киллерных клеток // Клиническая и лабораторная диагностика. -2000. - № 2. - С. 20-3.
13. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J. et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection // J. Biol. Chem. - 2003. - 278(11). - P. 8869-72.
14. Grimes C.L., Ariyananda Lde Z., Melnyk J.E., O'Shea E.K. The innate immune protein Nod2 binds directly to MDP, a bacterial cell wall fragment // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - 134(33). - P. 13535-7. doi: 10.1021/ja303883c.
15. Kalyuzhin O.V., Zemlyakov A.E., Fuchs B.B. Distinctive immunomodulating properties and interactivity with model membranes and cells of two homologous muramyl dipeptide derivatives // Int. J. Immunophar-macol. - 1996. - 18(11). - P. 651-9.
16. Ogawa C., Liu Y.J., Kobayashi K.S. Muramyl dipeptide and its derivatives: peptide adjuvant in immunological disorders and cancer therapy // Curr. Bioact. Compd. - 2011. - 7(3). - P. 180-97.
27-34.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
МДП (MDP)
- мурамилдипептид (тигату1 dipeptide;
К-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглутамин)
- мононуклеарные лейкоциты
- клетки-мишени
- клетки-эффекторы
- полная питательная среда
- фагоцитарное число
- фагоцитарный индекс
Ф
МЛ КМ
кэ ппс
ФЧ ФИ
ф
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. H.H. БЛОХИНА РАМН
1
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
