CC BY
19
3. Гинзбург А.С., Детлаф Т.А. // Объекты биологии развития. АН СССР. М., 1975. С. 217-260.
4. Детлаф Т.А., Гинзбург А.С., Шмальгаузен О.И. Развитие осетровых рыб. М., 1981.
5. Москалькова К.М. // Морфо-экологический анализ развития рыб. М., 1967. С. 48-74.
6. Прозоровский В.Б. // Фармакология и токсикология. 1962. № 1.
7. Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М., 1998.
8. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. М., 2002.
9. Лакин Г.В. Биометрия. М., 1973.
Азовский НИИ рыбного хозяйства 31 мая 2006 г.
УДК 504.4.054:577.152.313 (047.31)
ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕННЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЦИНКА И ЖЕЛЕЗА НА АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЭСТЕРАЗ И ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ПРИРОДНЫХ И МОДЕЛЬНЫХ ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ
© 2006 г Л.М. Предеина, О.И. Бейсуг, М.Н. Предеин
In model experiments of natural water the effects of increased concentrations of Zn2+ and Fe3+ on the indicators of activity of particular-bound an dissolved extracellular esterases and alkaline phosphatase are shown. Phase character of changes in activity indicators of both enzymes in time is established, however, in most cases the activity of alkaline phosphatase increased with the increasing of concentrations of metal ions added, esterases - decreased.
Цинк и железо относятся к наиболее распространенным тяжелым металлам в поверхностных водах суши, концентрации которых, по данным Росгидромета, периодически превышают предельно допустимые. Повышенные концентрации этих металлов в воде наряду с токсическими эффектами способны, в зависимости от концентраций, ускорять или замедлять скорости ферментативных реакций, что может привести к нарушению сбалансированности биогеохимического круговорота веществ и снижению устойчивости экосистем.
Важным звеном круговорота биогенных элементов фосфора и углерода в водных объектах являются процессы ферментативного гидролиза фос-фомоноэфирных и сложноэфирных связей органических веществ с участием соответственно щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) и эстераз (КФ 3.1.1.1 и КФ 3.1.1.2) [1]. Эти ферменты являются неспецифичными по отношению к субстратам и могут гидролизовать широкий круг органических веществ, содержащих фосфо- и сложноэфирные связи как внутри организмов, так и непосредственно в воде благодаря способности фито- и
бактериопланктона прижизненно секретировать за пределы клеточных мембран их внеклеточные формы. Различают растворенные и сестон-связанные внеклеточные ферменты [2]. Растворенные ферменты выделяются в окружающую среду, а сестон-связанные остаются прикрепленными к клеточным мембранам или стенкам организмов и в этой связи более адекватно отражают функциональное состояние планктонных сообществ.
Влияние ионов тяжелых металлов на активность щелочной фосфатазы, выделенной из клеток культур микроорганизмов и сестона водных объектов, достаточно детально изучено в исследованиях [3, 4]. В экспериментах этих авторов ионы тяжелых металлов добавлялись непосредственно в инкубационную среду при определении активности фермента и таким образом изучалось влияние металлов на каталитические свойства фермента. В такой постановке эффективными оказались очень высокие концентрации металлов (10-4 - 10-2 моль/л), которые не встречаются в природных водах, за исключением аварийных ситуаций. Эстеразы традиционно рассматривались как ферменты, ингибируемые фосфорорганическими соединениями [1], и не изучались на предмет чувствительности к тяжелым металлам в водах. Однако в исследованиях, проведенных на мезокосмах [5] и микрокосмах [6], в которых ионы тяжелых металлов меди и ртути вносились в природную воду, и активность щелочной фосфатазы и эстераз сестона определялась после экспонирования металлов в воде в течение определенных промежутков времени, установлены эффекты более низких концентраций металлов (10-9 - 0,5 • 10-7 моль/л Н^2+и 0,4 • 10-6 моль/л Си2+). Выявлен фазный характер влияния ртути и меди на активность обоих ферментов, когда в зависимости от времени экспонирования металлов в воде наблюдались эффекты ингибирования или активации щелочной фосфата-зы и эстераз. В этой связи были проведены исследования на природных водных объектах и модельных экосистемах с целью изучения влияния приоритетных тяжелых металлов цинка и железа на активность щелочной фосфатазы и эстераз.
Материал и методы исследований
Натурные исследования проводились в комплексных экспедициях в нижнем течении р. Дон и некоторых малых реках Ростовской области в 2000-2002 гг. В нижнем течении р. Дон пробы воды отбирались на стационарных станциях гидрохимической сети Росгидромета совместно с Донской устьевой станцией.
Модельные эксперименты по влиянию ионов цинка и железа на активность ферментов проводились в лабораторных условиях при естественном освещении. Воду для экспериментов отбирали на наименее загрязненном участке р. Дон и помещали в стеклянные аквариумы вместимостью 10 л. Ионы цинка и трехвалентного железа добавляли в воду в виде их сульфатов. Проведено два эксперимента: первый - в июне, второй - в октябре 2005 г. В первом эксперименте в аквариумы вносили ионы металлов в
концентрациях 0,01 и 0,10 мг/л 2п2+ и 1,0 и 5,0 мг/л Ре3+. В ходе второго эксперимента изучалось влияние 4 концентраций Бе3+ - 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 мг/л. Воду для анализов отбирали из аквариумов через 3 или 4 ч после внесения солей металлов, а затем ежедневно в одно и то же время в течение 4 или 5 сут.
Активность щелочной фосфатазы (АЩФ) и эстераз (АЭ) в натурных исследованиях и модельных экспериментах определяли во взвеси сестона, которую получали путем фильтрования 1 л воды через мембранный фильтр с диаметром пор 0,3 мкм. Осевший на фильтре сестон смывали в стаканчик 10 мл профильтрованной воды. Для определения АЩФ и АЭ в инкубационную смесь добавляли взвесь сестона и использовали в качестве субстратов соответственно а-нафтилфосфат и а-нафтилацетат [7]. Ферментативный гидролиз проводили при 30 °С в течение 1 ч в гидрокарбонатном буфере, рН = 10,0, для определения АЩФ и в течение 0,5 ч в трис-НС1 буфере, рН = 7,4, для определения АЭ. В первом эксперименте при длительности экспонирования с металлами в течение 3 и 5 сут наряду с активностью сестон-связанных ферментов определяли активность и их растворенных форм в образцах профильтрованной через тот же мембранный фильтр воды.
В ходе экспериментов контролировали концентрации некоторых форм азота, фосфора, железа, а также значения БПК5 [8].
Результаты исследований
В исследованиях, проведенных на малых реках Ростовской области, выявлены статистически значимые положительные коэффициенты корреляции между концентрацией железа в воде и активностью щелочной фосфатазы (АЩФ) (г = 0,49) и эстераз (АЭ) (г = 0,69). Концентрации валового железа изменялись при этом в пределах от 0,21 до 2,23 мг/л. По данным 5 комплексных экспедиций, в нижнем течении р. Дон установлена отрицательная корреляция между концентрацией цинка и удельной активностью эстераз (г = -0,30, Р < 0,05), рассчитанной на единицу численности фитопланктона, являющегося основным продуцентом внеклеточных ферментов в исследуемые периоды наблюдений. Концентрации растворенных форм соединений цинка в воде изменялись в диапазоне от 0,005 до 0,018 мг/л.
Низкие, но статистически значимые коэффициенты корреляции могут быть обусловлены присутствием в воде большого числа веществ в разных концентрациях, вызывающих комбинированные эффекты, в результате которых затушевывается воздействие отдельных загрязняющих веществ. В этой связи были проведены модельные эксперименты по выявлению эффектов повышенных концентраций цинка и железа на показатели АЩФ и АЭ.
Модельные эксперименты проводились в разные сезоны. В этой связи речная вода, использованная для исследований, отличалась по содержанию биогенных веществ и другим гидрохимическим характеристикам (табл. 1), а также по гидробиологическим показателям. Фитопланктонное
сообщество р. Дон в нижнем течении, по данным многолетних наблюдений Ростовского ЦГМС Росгидромета, в июне представлено в основном диатомовыми и зелеными водорослями, в начале октября - синезелеными и диатомовыми.
Влияние цинка исследовалось только в одном эксперименте, проведенном в июне. Ионы цинка оказывали разное воздействие на АЩФ и АЭ сестона. Обе концентрации 2и2+ через 4 ч после внесения в аквариумы не оказывали заметного влияния на АЩФ сестона (табл. 2). Однако уже через 1 сут отмечалось значительное повышение активности фермента по сравнению с контролем на 41 и 47 % соответственно при низкой и высокой концентрациях металла. Более длительное воздействие цинка (23 сут) усиливало стимулирующий эффект до 101-237 %. В конце эксперимента (через 5 сут) АЩФ в обоих аквариумах с добавками сульфата цинка, как и в начале эксперимента, практически не отличалась от контроля.
Таблица 1
Некоторые гидрохимические показатели в исходных образцах воды при моделировании влияния цинка и железа на АЩФ и АЭ
№ эксперимента Дата отбора проб рН t, °C РО43-, мг/л Р, 1 орг, мг/л Р, 1 взв., мг/л NO3-, мг/л Feраст., мг/л Р^взв^ мг/л БПК5, мг/л О2
I 14.06.05 8,21 23,5 0,101 0,054 0,049 0,109 0,079 0,716 1,35
II 9.10.05 8,06 13,8 0,173 0,023 0,079 0,283 0,092 0,268 2,40
Таблица 2
Влияние ионов цинка на показатели АЩФ и АЭ в модельном эксперименте (в знаменателе приведены значения активности растворенных ферментов)
Время экспонирования АЩФ АЭ
контроль 0,01 мг/л Zn2+ 0,10 мг/л Zn2+ контроль 0,01 мг/л Zn2+ 0,10 мг/л Zn2+
4 ч 0,192 0,197 0,209 0,918 0,735 0,666
1 сут 0,234 0,331 0,344 1,720 1,170 1,074
2 сут 0,758 2,570 0,765 2,230 1,970 1,620
3 сут 0,290 0,583 0,773 2,820 2,410 1,760
0,052 0,146 0,369 1,940 1,670 1,310
5 сут 0,712 0,689 0,617 6,030 5,370 5,530
0,070 0,171 0,327 4,040 4,120 3,450
Эффекты ионов цинка на АЭ сестона отличались от таковых для АЩФ. Обе концентрации 2и2+ снижали АЭ уже через 4 ч после внесения метал-
ла. Ингибирующий эффект 2и2+ варьировал от 20 до 38 %. Более низкая концентрация цинка вызывала угнетающий эффект эстераз лишь в течение 1 сут, более высокая - в течение 3 сут.
Таким образом, добавки ионов цинка вызывали преимущественно ингибирующий эффект на эстеразы сестона, продолжительность которого увеличивалась с повышением внесенной добавки металла, и активирующий - на щелочную фосфатазу.
Разные концентрации железа сильнее отличались по характеру воздействия на АЩФ сестона. В первом эксперименте эффекты более низкой концентрации железа (1,0 мг/л) характеризовались фазностью, когда активация фермента на 70 и 41 %, наблюдавшаяся в течение 1 сут после внесения металла, сменялась угнетением в последующие периоды (табл. 3). При внесении 5,0 мг/л железа значительный активирующий эффект (85 %), наблюдавшийся в начале эксперимента, постепенно усиливался до 1234 % и 942 % в конце. Во втором эксперименте угнетающих эффектов металла на АЩФ не обнаружено. Более низкие добавки ионов железа, от 0,5 до 2,0 мг/л, приводили в основном к увеличению АЩФ по сравнению с контролем. Лишь при экспонировании в течение 2 сут фосфатазная активность практически не отличалась в опытных и контрольных аквариумах. При наиболее высокой добавке Ре3+, 5,0 мг/л, как и в первом эксперименте, повышенные значения АЩФ, выявленные после 3-часового экспонирования, постепенно увеличивались и к концу эксперимента превысили контроль на 435 %.
Таблица 3
Влияние ионов железа на показатели АЩФ в модельных экспериментах (в знаменателе приведены значения активности растворенных ферментов)
Время экспонирования Эксперимент I Эксперимент II
контроль 1,0 мг/л Fe3+ 5,0 мг/л Fe3+ контроль 0,5 мг/л Fe3+ 1,0 мг/л Fe3+ 2,0 мг/л Fe3+ 5,0 мг/л Fe3+
3 ч - - - 0,242 0,264 0,291 0,318 0,388
4 ч 0,192 0,326 0,355 - - - - -
1 сут 0,234 0,331 0,558 0,334 0,431 0,490 0,498 0,578
2 сут 0,758 0,476 1,480 0,869 0,951 0,909 0,894 1,560
3 сут 0,290 0,052 0,308 0,045 3,870 0,052 0,625 0,762 0,732 0,852 3,090
4 сут - - - 0,600 0,829 1,026 1,650 3,201
5 сут 0,712 0,070 0,463 0,122 7,520 0,210 - - - - -
Сравнение эффектов одинаковых добавок Бе3+ в двух экспериментах показало, что в целом динамика изменений АЩФ совпадала, однако в первом эксперименте отклонения фосфатазной активности от контроля были более значительными. По-видимому, здесь важную роль сыграли гидрохимические и гидробиологические различия речной воды, используемой для эксперимента.
В отличие от щелочной фосфатазы активирующий эффект ионов железа на эстеразы сестона в первом эксперименте отмечен лишь при добавке 5,0 мг/л в начале воздействия (табл. 4). В дальнейшем постепенно развивался эффект угнетения активности фермента, который после 5 сут экспонирования составил 51 %. При добавке Бе3+ 1,0 мг/л в течение первых суток заметных отличий от контроля не наблюдалось, однако уже через 2 сут отмечен существенный угнетающий эффект (более 40 %), который сохранялся до конца эксперимента. Во втором эксперименте также отмечен фазный характер изменений АЭ сестона. Во всех опытных аквариумах угнетение АЭ, наблюдавшееся в начальный период наблюдений, сменялось активацией фермента. При этом время экспонирования, в течение которого происходило изменение направленности отклонения АЭ от кон -троля, увеличивалось с повышением концентрации добавленного в воду иона железа.
Таблица 4
Влияние ионов железа на показатели АЭ в модельных экспериментах (в знаменателе приведены значения активности растворенных ферментов)
Время экспонирования Эксперимент I Эксперимент II
контроль 1,0 мг/л Fe3+ 5,0 мг/л Fe3+ контроль 0,5 мг/л Fe3+ 1,0 мг/л Fe3+ 2,0 мг/л Fe3+ 5,0 мг/л Fe3+
3 ч - - - 3,05 2,36 1,98 2,13 2,11
4 ч 0,92 1,05 1,30 - - - - -
1 сут 1,72 1,50 1,69 4,95 3,65 2,65 2,49 2,53
2 сут 2,23 1,31 1,83 10,38 8,65 5,53 3,70 3,94
3 сут 2,82 1,94 1,44 1,07 1,82 1,20 15,05 21,38 17,02 6,77 5,71
4 сут - - - 11,73 20,14 21,20 14,58 11,49
5 сут 6.03 4.04 2,98 2,34 2,94 2,16 - - - - -
Таким образом, несмотря на некоторые различия повышенные концен -трации железа в обоих экспериментах приводили в большинстве случаев к угнетению АЭ сестона, в особенности в начальный период воздействия металла.
В первом эксперименте через 3 и 5 сут после внесения солей металлов наряду с активностью сестон-связанных ферментов определяли активность растворенных фосфатаз и эстераз. Интересно отметить, что растворенная эстеразная активность по значениям практически не отличалась от сестон-связанной, в то время как фосфатазная была, как правило, существенно ниже сестон-связанной формы (табл. 2-4). По сравнению с контролем активность растворенных эстераз изменялась под влиянием ионов цинка и железа так же, как и сестон-связанных ферментов. Эффекты солей цинка и железа на активность растворенной и сестон-связанной щелочной фосфатазы, напротив, отличались. Добавки сульфата цинка приводили к значительному повышению активности растворенной щелочной фосфата-зы - на 144-610 %. С увеличением концентрации цинка активирующий эффект на АЩФ усиливался. Эффекты обеих концентраций железа были менее значительными. На 3-и сут эксперимента активность растворенной щелочной фосфатазы не отличалась от контроля, на 5-е сут наблюдалась активация фермента на 74 и 200 % соответственно для низкой и высокой концентраций металла.
В исследованиях [3] также установлен активирующий эффект иона цинка на активность растворенной щелочной фосфатазы Перепета Ьогу-апит, однако исследованные концентрации металла были более высокими - 0,02 • 10-3 и 0,20 • 10-3 моль/л (массовые концентрации 2и2+ составили соответственно 1,30 и 13,0 мг/л). В то же время, в отличие от результатов, изложенных выше, эти концентрации цинка приводили к снижению активности связанного с клетками фермента. Такие же, как и для молярные концентрации Бе2+ (массовые концентрации иона - 1,12 и 11,2 мг/л) вызывали активацию как растворенной, так и связанной с клетками Р1ес(опета Ьогуапит щелочной фосфатазы, что соотносится с результатами описанных выше модельных экспериментов. Сходный характер реагирования щелочной фосфатазы на присутствие близких по значению концентраций двух- и трехвалентного железа позволяет предполагать наличие единых механизмов влияния ионов Бе3+ и Бе2+ на активность внеклеточной щелочной фосфатазы планктонных организмов.
Таким образом, добавки солей цинка и железа влияют на активность не только сестон-связанных, но и растворенных форм щелочной фосфатазы и эстераз. При этом ион цинка оказывает более сильное влияние на активность растворенной щелочной фосфатазы, ион железа - на активность сестон-связанной формы фермента. Активность обеих форм эстераз изменяется в присутствии ионов цинка и трехвалентного железа практически одинаково.
Выявленные изменения АЩФ и АЭ, по-видимому, обусловлены не только активацией и ингибированием этих ферментов, но и влиянием на процессы их синтеза и секреции, которые связаны с функциональной активностью планктонных сообществ. Судить об активности микроорганизмов можно по показателю БПК5, который широко используется в практике
гидрохимического мониторинга вод для оценки уровня их загрязнения легкоокисляющимися органическими веществами. Определение этого показателя в первом эксперименте производили через 4 ч, 3 и 5 сут после внесения солей цинка и железа в аквариумы. Снижение показателя БПК5, измеренного через 4 ч после внесения ионов металлов, отмечено при высоких концентрациях цинка и железа соответственно на 81 и 28 % (рис. 1). При экспонировании с металлами в течение 3 сут во всех аквариумах показатель БПК5 не отличался от контроля. Однако в конце эксперимента, при длительности экспонирования в течение 5 сут, уменьшение БПК5 на 36-72 % наблюдалось во всех аквариумах с добавками солей металлов. Таким образом, для показателя БПК5 также характерна фазность изменений во времени при воздействии ионов цинка и железа. Полученные данные свидетельствуют об угнетающем влиянии изученных металлов, в особенности цинка, на функциональное состояние бактериопланктона. Отличия в реагировании активности ферментов и показателя БПК5 на присутствие в воде ионов цинка и железа могут быть обусловлены множеством факторов и, прежде всего тем, что АЩФ и АЭ отражает функционирование не только микроорганизмов, но и фитопланктона.
Рис. 1. Изменение значений БПК5 в эксперименте с добавками ZnSO4 и Ге2^04)3: 1 — контроль; 2, 3 — 0,01 и 0,10 мг/л Zn2+; 4, 5 — 1 и 5 мг/л Ее3+
Во втором эксперименте, в котором исследовалось влияние только ионов железа, показатель БПК5 при экспонировании в течение 3 ч и 2 сут не отличался в опытных и контрольном аквариумах. Лишь в конце эксперимента при добавках от 1,0 до 5,0 мг/л Ре3+ наблюдалось небольшое, на 2433 %, снижение этого показателя. По-видимому, в этом эксперименте изменения активности обоих ферментов связаны преимущественно с функционированием фитопланктона. С этим, возможно, также связаны и некоторые отличия эффектов одинаковых концентраций ионов железа в двух экспериментах.
При моделировании в аквариумах достаточно быстро происходит снижение растворенных биогенных веществ вследствие их утилизации
планктонным сообществом. В контрольном аквариуме это полностью выполнялось - к концу эксперимента наблюдалось существенное снижение нитратов, нитритов и ортофосфатов. Внесение ионов цинка и железа изменяло динамику соединений азота и фосфора. Концентрации нитритного азота в присутствии обоих металлов, как правило, повышались к концу эксперимента, нитратного, как и в контрольном аквариуме - снижались. Однако потребление нитратов планктоном существенно тормозилось в присутствии ионов тяжелых металлов, в особенности 2и2+ (рис. 2). Снижение скорости потребления нитратов отмечено также в присутствии ионов меди в исследованиях на культуре цианобактерии Лпасу^'Ш' тйи1ат [9]. Приведенные данные свидетельствуют о сходных механизмах воздействия тяжелых металлов на планктонные сообщества, затрагивающих азотный обмен.
Рис. 2. Изменение концентраций нитратного азота в эксперименте с добавками 2пБ04 и ¥е2(5,04)}. Обозначения как на рис. 1
В ходе экспериментов обнаружены существенные различия также в динамике измеряемых форм фосфора в присутствии повышенных концентраций цинка и железа по сравнению с контрольным аквариумом. Следует отметить, что исходные концентрации ортофосфатов, взвешенных форм фосфора и нитратов во втором эксперименте были выше в 1,5-3 раза, а органического фосфора - существенно ниже (табл. 1). Однако это не сказалось на характере изменений концентраций минерального фосфора при внесении в аквариумы ионов железа. Если в контроле концентрации орто-фосфатов в начале эксперимента изменялись незначительно, то в присутствии ионов железа их существенное снижение наблюдалось уже в первые часы после внесения Бе3+ (рис. 3). При этом концентрация фосфата снижалась быстрее в аквариумах с более высокими добавками ионов железа. Резкое снижение концентраций растворенных ортофосфатов при внесении Бе3+ очевидно обусловлено образованием нерастворимых фосфатов железа. Это предположением подтверждается пропорциональным увеличением
концентраций взвешенных форм фосфора, которое было отмечено при внесении ионов железа.
Обе концентрации цинка, напротив, вызывали существенное снижение потребления ортофосфатов, в особенности в течение первых 3 сут эксперимента (рис. 3). В этот период концентрации всех форм фосфора в присутствии ионов цинка практически не изменялись, и лишь в конце эксперимента наблюдалось некоторое снижение содержания ортофосфатов, которое, однако, было менее выраженным, чем в контроле.
Рис. 3. Изменение концентраций ортофосфата в эксперименте с добавками 2п504 и Гв2(304)3. Обозначения как на рис. 1
При сопоставлении АЩФ с фосфором в контрольных аквариумах выявлена обратная связь между ферментативной активностью и концентрацией ортофосфатов (г:* = -0,60 и гп = -0,72) и прямая - с содержанием взвешенного фосфора (г: = 0,63 и гп = 0,76). Добавки ионов цинка полностью нарушили эти закономерности. При внесении ионов железа в обоих экспериментах, судя по крайне низким коэффициентам корреляции, можно говорить лишь о тенденции отрицательной корреляции АЩФ с орто-фосфатами и положительной - с содержанием взвешенного фосфора.
Не обнаружено четкой зависимости между фосфатазной активностью и концентрациями различных форм железа. Связь АЩФ с растворенным железом отсутствовала. Коэффициенты корреляции между фосфатазной активностью и взвешенной формой железа в обоих экспериментах были положительными, но невысокими (г: = 0,46 и гп = 0,41). В связи с тем, что большая часть железа находилась во взвешенной форме (67-99 %), очень близкие коэффициенты корреляции получены между АЩФ и валовым железом (г: = 0,40 и гп = 0,45).
Однако, если рассматривать не весь полученный массив данных, а каждый временной промежуток экспонирования в отдельности, то выявленные тенденции между АЩФ и разными формами фосфора и железа ста-
* ri и rn - коэффициенты корреляции соответственно в экспериментах I и II.
новятся более четкими. Во втором эксперименте установлены высокие коэффициенты корреляции (от 0,88 до 0,99) между АЩФ и концентрацией взвешенной и валовой форм железа в каждом периоде экспонирования. Высокие коэффициенты корреляции с ортофосфатами (от -0,80 до -0,98) и взвешенным фосфором (от 0,78 до 0,95) отмечены в обоих вариантах опыта в начале эксперимента при длительности экспонирования не более 1 сут. При более продолжительном воздействии металлов коэффициенты корреляции существенно уменьшались, и самые низкие из них зарегистрированы при экспонировании в течение 2 сут.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что выявить основной фактор, регулирующий АЩФ, а также установить причинно-следственные связи между фосфатазной активностью и концентрацией разных форм фосфора достаточно сложно. При изучении механизмов детоксикации тяжелых металлов установлено, что в их присутствии в клетках микроводорослей существенно изменяется обмен веществ - увеличивается интенсивность синтеза тиолового пептида глутатиона и белков фитохелатинов, участвующих в связывании и выведении металлов из клеток [10, 11], а также повышается активность некоторых ферментов, в частности, глута-тионтрансферазы, супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы [12, 13]. Это, несомненно, приводит к увеличению энергетических затрат в клетках водорослей и соответственно к интенсификации фосфорного обмена. Одним из механизмов, обеспечивающих повышение скорости оборота фосфора, является увеличение АЩФ [14], которое, как показано выше, наблюдалось в присутствии повышенных концентраций цинка даже при высоком содержании растворенных фосфатов. Отсутствие четкой связи между концентрацией фосфора в воде и скоростью его круговорота показано в многочисленных исследованиях, проведенных на природных экосистемах [15]. Одной из причин такого несоответствия может служить, как показано выше, увеличение концентраций цинка, а, возможно, и других загрязняющих веществ, способных повышать интенсивность обменных процессов в клетках планктонных организмов.
Сравнение динамики разных форм фосфора с АЭ показало, что в контрольных аквариумах, как и в случае с фосфатазами, выявлена очень четкая обратная связь эстеразной активности с ортофосфатами (г: = -0,98 и гп = -0,90) и прямая - со взвешенной формой фосфора (г: = 0,76 и гп = 0,91), хотя сведений о регулирующем влиянии фосфора на АЭ в литературе не обнаружено. В то же время в присутствии повышенных концентраций цинка и железа отмеченные зависимости установить не удалось. Не выявлено устойчивых корреляций между АЭ и концентрацией разных форм железа. Здесь следует отметить, что эффекты добавок 1, 2, и 5, мг/л Ре3+ на эстеразную активность в обоих экспериментах часто практически не отличались, в особенности при кратковременном экспонировании (табл. 4).
При рассмотрении каждого временного интервала экспонирования коэффициенты корреляции между АЭ сестона и концентрацией валового и
взвешенного железа были во всех случаях отрицательными и изменялись в пределах от -0,44 до -0,87. Наиболее высокие коэффициенты корреляции выявлены при длительности экспонирования 2 и 3 сут.
Результаты экспериментов показали, что в целом ионы цинка и железа (III) оказывали противоположное влияние на показатели активности ферментов сестона - АЩФ повышалась, а АЭ снижалась. Все опробованные концентрации железа приводили к усилению активирующего эффекта на АЩФ с увеличением времени экспонирования. Для эстераз при увеличении длительности экспонирования наблюдалось изменение ингибирующе-го влияния Fe3+ на активирующее. При этом с повышением концентрации железа увеличивался период времени, в течение которого наблюдался устойчивый ингибирующий эффект металла. В этой связи положительная корреляция, обнаруженная между концентрацией валового железа и активностью обоих ферментов в водных объектах Ростовской области, может свидетельствовать о длительном присутствии в этих экосистемах повышенных концентраций железа.
Цинк оказывал преимущественно ингибирующий эффект на эстераз-ную активность, который, как правило, усиливался с повышением концентрации металла. Эти результаты согласуются с данными, полученными в нижнем течении р. Дон, где выявлена отрицательная корреляция между удельной АЭ и концентрацией растворенных соединений цинка. Фазность реагирования АЩФ на повышенные концентрации Zn2+, а также наблюдавшиеся в отдельные периоды экспонирования более сильные стимулирующие эффекты меньшей концентрации металла могли наряду с другими факторами послужить причиной отсутствия корреляции между фосфатаз-ной активностью и концентрацией цинка в экосистеме Нижнего Дона.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект № 06-0564504 и НШ-4717.2006.5
Литература
1. Берстон М. Гистохимия ферментов. М., 1964.
2. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М., 1987.
3. Doonan B.B., Jensen T.E. // Microbios. 1979. Vol. 25. P. 177-186.
4. Flint K.P., Hopton J. W. // Europian. J. Appl. Microbiol. 1977. № 4. P. 195-204.
5. Предеина Л.М., Федоров Ю.А., Бейсуг О.И., Предеин М.Н. // Науч. конф. по результатам исследований в области гидрометеорологии и мониторинга загрязнения природной среды в государствах-участниках СНГ: Тез. докл. СПб., 2002.
6. Предеина Л.М., Федоров Ю.А., Бейсуг О.И., Предеин М.Н. // Экологические проблемы. Взгляд в будущее: Материалы науч.-практ. конф. СОЛ «Лиманчик», 2004.
7. Предеина Л.М., Федоров Ю.А., Морозова Е.В., Уразаев К.К., Предеин М.Н. // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2003. № 4. С. 88-92.
8. Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши / Под ред. А. С. Семенова. Л., 1977.
9. KashyapA.K., Gupta S.L. // Z. Pflazenphysiol. 1982. Vol. 107. P. 289-295.
10. Савина Я.В., Лебедев А.Ф., Барский Е.Л. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2003. № 3. С. 29-36.
11. Cobett C., Golasbough P. // Ann. Rev. Plant Biol. 2002. Vol. 53. P. 159-182.
12. Okamoto O.K. et al. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2001. Vol. 40. № 1. P. 18-24.
13. Tsuji N. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 293. № 1. P. 653-659.
14. Агатова А.И., Лапина Н.М., Сапожников В.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 1991. № 3. С. 421-429.
15. Пашкевич А.И. // Элементы круговорота фосфора в водоемах. Л., 1987. С. 17-32.
Гидрохимический институт, г. Ростов н/Д 14 июня 2006 г.
