CC BY
64
УДК 616.24-006.6:577.115
А.Н. Шнейдерман1, А.И. Тарасова1, М.С. Вагида1, Е.Ю. Брагин2, И.Б. Зборовская1 ВЛИЯНИЕ НОКДАУНА ФЛОТИЛЛИНА-2 НА СВОЙСТВА КЛЕТОК ЛИНИИ Н460 РАКА ЛЕГКОГО
1НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
2Инновационно-технологический центр «Биологически активные соединения и их применение» РАН Контактная информация:
Шнейдерман Анастасия Николаевна, аспирант 3 года обучения лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр.15; тел.: +7(499)324-17-64 e-mail: shneYderman.an@gmail.com
Статья поступила: 12.03.2012, принята к печати 31.08.2012.
Резюме
Данная работа посвящена изучению влияния экспрессии рафт-образующего белка флотиллин-2 на свойства клеток рака легкого, ассоциированные с опухолевой прогрессией. В современной литературе существуют экспериментальные данные о влиянии флотиллина-2 на метастатические свойства клеток меланомы. Однако механизмы действия флотиллина-2 на эпителиальные опухолевые клетки, а также его роль в регуляции процессов метастазирования и стимуляции опухолевой прогрессии при раке легкого остаются неизученными. На экспериментальной модели клеток немелкоклеточного рака легкого (линия Н460) впервые показано влияние изменения экспрессии флотиллина-2 на пролиферацию и миграцию клеток. Также полученные данные свидетельствуют о существовании механизмов взаимного регулирования уровня различных рафт-образующих белков.
Ключевые слова: липидные рафты, флотиллины, рак легкого.
A.N. Shneyderman1, A.I. Tarasova1, M.S. Vagida1, E.Y. Bragin2, I.B. Zborovskaya1
THE INFLUENCE OF FLOTILLIN-2 KNOCKDOWN
ON THE CHARACTERISTICS OF H460 LUNG CANCER CELL LINE
]FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
2Center of Innovations and Technologies «Biologically Active Compounds and their Applications» of RAS, Moscow
Abstract
This article is focused on the influence of Flotillin-2 expression on tumor progression associated characteristics of lung cancer cells. Today the involvement of Flotillin-2 in metastasis of melanoma is well known. However the exact mechanisms of Flotillin-2 influence on another tumor cells as well as its role in others malignancies remains unstudied. In present study we for the first time showed the influence of Flotillin-2 expression on proliferation and migration of cells on the experimental model system of H460 lung cancer cell line. Our findings also suggest the existence of reciprocal regulation of different lipid rafts proteins expression.
Key words: lipid rafts, flotillin, lung cancer.
Введение
Рак легкого (РЛ) является одним из самых распространенных, неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний [1]. На сегодняшний день важнейшими факторами прогноза для больных РЛ являются клинические показатели: степень дифференцировки опухолевых клеток и наличие метастазов в регионарные лимфоузлы и отдаленные органы. Поиск дополнительных прогностических факторов, и в первую очередь, молекулярных маркеров, представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии.
В последние годы все больший интерес вызывает изучение липидных рафтов - микродоменов в составе клеточных мембран, богатых холестеро-лом и сфинголипидами, а также включающих различные сигнальные молекулы. Липидные рафты -высоко динамичные и короткоживущие структуры, которые могут стабилизироваться за счет особых рафт-образующих белков [10]. Стабилизированные липидные рафты способны выполнять роль сигнальных «платформ» и регулировать пути передачи
сигналов, концентрируя молекулы различных каскадов и обеспечивая их взаимное влияние друг на друга. Множество сигнальных путей, в частности, от рецепторов ростовых факторов, белков межклеточных и фокальных контактов, в-белков, регулируется липидными рафтами [13].
В настоящее время известно большое количество рафт-образующих белков.
К ним относятся белки семейств кавеолинов, тетраспанинов, ретикулонов и группа 8РБИ белков (от £Ютайш, РгоЫЪШш, ИоШИш, НАК/С), в которую входят стоматин, стоматин-подобные белки, прохибитины, флотиллины, подоцин и эрлины [4].
Наиболее изученными среди них являются белки семейства кавеолинов, которые образуют особый тип липидных рафтов, способных формировать кавеолы. Последние участвуют в ряде важнейших процессов в клетке, таких как везикулярный транспорт, поддержание гомеостаза холесте-рола, регуляция транспорта ионов Са2+ из внеклеточного пространства в цитоплазму, а также влияют на передачу различных сигналов внутрь клетки за счет регуляции активности участников сигнальных путей [14].
К семейству флотиллинов относятся два белка - флотиллин-1 и -2, обладающие высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей. Флотиллины, как и кавеолины, экспрессируются практически во всех типах тканей взрослого организма. Однако они также обнаруживаются в нейронах и лимфоцитах, где кавеолины отсутствуют [2]. Флотиллины участвуют в везикулярном транспорте, реорганизации актинового цитоскелета, а также могут регулировать передачу сигналов от рецепторов ростовых факторов, G-белков и Т-клеточных рецепторов [8].
Несмотря на возрастающий интерес к рафт-образующим белкам, их роль в нормальной и патологической физиологии человека остается мало изученной. Наибольшее количество исследований посвящено изучению белка кавеолин-1, который играет двоякую роль в процессе опухолевой трансформации клеток, и, в зависимости от гистогенеза опухоли и стадии опухолевой прогрессии, может выступать как в качестве опухолевого супрессора, так и онкогена [18]. Что касается флотиллинов, то существуют лишь скудные и разрозненные данные об их участии в процессах канцерогенеза. Известно, что экспрессия флотиллина-2 является независимым фактором неблагоприятного прогноза при меланоме [9]. Однако механизмы действия флотилли-на-2 на опухолевые клетки, а также его роль при возникновении злокачественных новообразований различного происхождения на сегодняшний день остаются неизученными.
Целью данной работы было исследование влияния экспрессии флоттилина-2 на характеристики клеток рака легкого, ассоциированные с опухолевой прогрессией. Мы показали, что в линии крупноклеточного РЛ Н460 подавление экспрессии флотиллина-2 с помощью малых шпилечных РНК (мшРНК) приводит к снижению скорости пролиферации клеток, ухудшению миграции и снижению активности протеазы ММР-2, что может свидетельствовать о важной роли данного белка в регуляции этих ключевых для метастазирования процессов.
Материалы и методы
Клеточные линии. В качестве экспериментальной модели для исследования использовалась клеточная линия крупноклеточного РЛ человека Н460, а для получения лентивирусных частиц - линия эпителиальных клеток 293FT.
Обе линии культивировались при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % CO2. Для культивирования использовалась среда RPMI (ПанЭко, Россия) c L-глутамином (0,294 мг/мл) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (PAA Laboratories, Австрия), 0,1 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина.
Получение экспрессирующих векторов. В данной работе использовались следующие последовательности мшРНК:
sh1-Flot-2
5’CCGGCGTGTATGACAAAGTGGACTACTCGAGrAGTCCACTrTGTCATACACGmT'rG3’.
sh2-Flot-2
5’CCGGGAGACAACAGTAAGGTCACATCTCGAGATGTGACCTTACTGTTGTCTC1TTTT3’
(смысловая и антисмысловая последовательность подчеркнуты).
Предшественники мшРНК к кодирующей последовательности мРНК FLOT-2 клонировались в лентивирусный вектор pLKO.1-puro по сайтам AgeI и EcoRI. Для клонирования каждого конструкта синтезировались пары олигонуклеотидов F и
R, модифицированные липкими концами с соответствующими рестриктными сайтами. Олигонуклеотиды отжигали друг на друге в эквимолярном соотношении при +950С в течение 10 мин. 20 пмоль полученной смеси использовали для киназной реакции с помощью киназы Т4 (Fermentas, США), согласно протоколу производителя. Лигирование фрагментов в лентивирусный вектор проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 (Fermentas, США) в условиях, рекомендованных производителем (1-2 ед фермента на 20 мкл лигаз-ной смеси, при +16 °С в течение часа).
Затем ДНК-лигазу инактивировали инкубацией в течение 10 мин при +65 °С, и полученную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E. coli. Секвенирование полученного конструкта ДНК проводилось с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v 3.1 (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвена-торе ДНК ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, США). Для секвенирования использовали праймер pLKO.1-puro seq. - 5’GACTATCATATGCTTACCGT3’.
Трансфекция и инфекция. Для получения псев-долентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT. Для трансфекции брали суммарно 2 мкг плазмидной ДНК лентивирусного вектора pLKO.1-puro (Addgene, США), несущего последовательность мшРНК, pVSV-G (Clontech, США) и пакующей плазмиды pDeltaR8.2 (Addgene, США), кодирующей вирусные белки. Все три плазмиды смешивались в эквимолярном соотношении. Трансфекцию проводили с использованием реагента LipofectAMINE 2000™ Reagent (Invitrogen, США), согласно протоколу производителя. Содержащиеся в супернатанте вирусные частицы собирали через 24; 48 и 72 ч, центрифугировали 10 мин при 1500 g для удаления клеточного дебриса и использовали для инфекции.
За день до инфекции псевдовирусными частицами клетки линии Н460 рассеивались на 6-луночные планшеты в 2 мл среды так, чтобы к моменту инфекции культура достигала 20-30% кон-флюентности. В день инфекции среду заменяли на свежую, содержащую 50% вирусного супернатанта и 8 мкг/мл полибрена (Sigma-Aldrich, США). Использовались 24-; 48- и 72-часовые инокуляты вируса. После окончания инфекции клетки рассаживали в 60-мм культуральные чашки для селекции на антибиотике. Для контроля селекции рассевали неинфицированные клетки. Селекция проводилась на среде с пуромицином (3 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, США) в течение 3-4 дней. После окончания селекции клетки культивировали до достижения состояния субконфлюентности, замораживали и хранили при -70 °С в эмбриональной сыворотке, содержащей 10% ДМСО. Для дальнейших экспериментов использовали свежеразмороженные аликвоты полученных клеточных линий.
Выделение РНК и получение кДНК методом обратной транскрипции. Выделение РНК из клеточных культур производили с использованием реактива Trizol (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Для получения одноцепочечных кДНК к 2 мкг тотальной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I (Fermentas, США), согласно протоколу производителя (1ед фермента на 1 мкг РНК), добавляли 80 пмоль random9 праймеров и инкубировали 5 мин при +70 °С. Затем на льду в смесь вносили 25 мкл реагента «RT-MIX» (RT-Buf 10-кратный (Fermentas, США), 40 мМ дНТФ, 10 ед RNAsin (Promega, США)) и инкубиро-
вали еще 5 мин при +37 °С. После этого вносили 200 ед обратной транскриптазы M-MuLV0 (Fermen-tas, США) и проводили реакцию при +42 0С в течение 1 часа. Реакцию останавливали прогреванием смеси при +70 °С в течение 10 мин. Объем пробы доводили до 200 мкл деионизованной водой и хранили при -20 0С.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили с использованием амплификатора iCycler iQ5 (BioRad Laboratories GmbH, Германия). Матрицей для ПЦР служила кДНК. Реакционная смесь включала: 10 пмоль 5’ и 3’праймеров, 1,6 мМ MgCl2, 0,25 мкМ дНТФ, ам-плификационный буфер 10x с интеркалирующим флуоресцентным красителем Eva Green (Синтол, Россия), 1 ед Taq-ДНК полимеразы (Синтол, Россия). Реакционная смесь проходила предва0ритель-ное прогревание в течение 10 мин при +95 С и последующие 40 циклов денатурации (+95 0С), отжига праймеров (+60 0С) и полимеризации (+72 0С) с детекцией количества накопленного продукта по спектру флуоресценции в конце стадии элонгации. Каждую реакцию проводили в шести повторах. В работе использовались следующие праймеры: FLOT-2 REAL F -
5 ’ GCAGCGAGAATTTCGACGAG3’,
FLOT-2 REAL R -5’ GGTAAGTGGGGCAGCGAT3 ’,
FLOT-1 REAL F -5 ’ TGAGATTGCCCACATTGCC3 ’,
FLOT-1 REAL R -5 ’ GCTAACCACACTGATGCCCA3’,
STOM REAL F - 5’ GCAGCCGAAGGAGAAATG3’, STOM REAL R - 5’CTCAGCAGCAATGGTGGTC3 ’, CAV-1 F - 5’CCGCGACCCTAAACACCTC3 ’,
CAV-1 R - 5 ’ GCCTTCC AAATGCCGTC AA3 ’,
GAPDH F - 5 ’ TTGCCATGGGTGGAATCATA3 ’, GAPDH R - 5 ’TCGGAGTCAACGGATTTGGT3 ’. Ген GAPDH, являющийся геном домашнего хозяйства, использовали в качестве референсного гена для выравнивания внесенного в реакцию количества транскриптов. Обработка результатов эксперимента и расчет относительной экспрессии проводились с помощью программ Bio-Rad iQ5 2.0 Standard Edition Optical System Software и REST 2005. Расчет коэффициента эффективности реакции проводился с использованием программы LinRegPCR.
Приготовление клеточных лизатов и Вес-терн-блот гибридизация. Клеточные лизаты получали из субконфлюентного монослоя клеток. Клетки промывали 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), затем лизировали в 100-200 мкл буфера для приготовления лизатов (RIPA) (100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 10 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 0,1% SDS, 0,5% деоксихолат натрия, 0,05 мМ NaVO4, 10 мМ NaF, protease inhibitor cocktail (Roche, Швейцария), 1 мМ DTT). Лизис проводили в течение 30 мин при температуре +4 °С при постоянном перемешивании, затем лизаты центрифугировали 10 мин при 15000 g. Супернатант хранили в аликвотах при -70 °С.
Определение уровня белков проводили методом Вестерн-блот гибридизации по стандартному протоколу. Для идентификации белков использовались следующие антитела: anti-Flotillin-2 BD 610384 (BD Transduction Laboratories, США), anti-Flotillin-1 Bd 610821(BD Transduction Laboratories, США), anti-Caveolin-1 C3237 (Sigma-Aldrich, США), anti-Stomatin sc-134554 (Santa Cruz, США), anti-p21 sc-817 (Santa Cruz, США), anti-p53 sc-126 (Santa Cruz,
США), в-actin ab8227 (Abcam, Англия), anti-mouse козьи антитела 2367 (Cell Signalling, США), antirabbit козьи антитела 29902 (Upstate cell signaling solutions, США). Хемилюминесцентную реакцию регистрировали на приборе Kodak GelLogic 2200 Imaging System (Carestream Health Inc., США) с последующей обработкой с помощью программы Kodak Molecular Imaging Software SE.
Анализ ферментативной активности про-теиназ ММР и uPA. Для анализа активности про-теиназ в кондиционированной среде клетки рассаживали в 6-луночные планшеты (500 000 клеток на лунку). На следующий день среду меняли на бес-сывороточную, еще через сутки кондиционированную среду от клеток собирали и центрифугировали 10 мин при 1500 g. Супернатант хранили в аликвотах при -70 °С. Анализ активности матриксных металлопротеаз и uPA проводили согласно протоколу, описанному в литературе [7].
Выделение ядер клеток и проведение исследования клеточного цикла на проточном цитоф-луориметре. Клетки рассаживали в 6-луночные планшеты (20000 клеток на лунку), через сутки клетки снимали раствором Версена, откручивали 10 мин при 1500 g и лизировали в лизис-буфере (0,1 % цитрата натрия, 0,3 % Nonidet P40 (AppliChem GmbH, Германия), РНКаза А 100 мкг/мл, пропидия йодид 50 мкг/мл). Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре BD Facs canto II (BD Biosciences, США), результаты анализировали с помощью программ FACSDiva V6.0 и WinMdi.
Клеточные эксперименты. Для анализа скорости пролиферации клетки сажали в 6-луночные планшеты (20 000 клеток на лунку) и культивировали в среде с 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Анализ проводили в пяти временных точках с интервалом в 24 ч, начиная с 24 ч после рассаживания клеток в планшеты. Каждая временная точка дублировалась. Количество клеток в лунках определяли подсчетом в камере Горяева.
При проведении теста на миграцию 20 000 клеток, ресуспендированных в среде без сыворотки, помещали внутрь камеры Бойдена с размером пор 8 мкм (Millipore, США), внешнюю камеру заполняли средой с 10 %-ной эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки культивировали в течение 24 часов, после чего оставшиеся клетки удаляли с внутренней поверхности камеры. Клетки, мигрировавшие через отверстия в мембране на внешнюю поверхность, фиксировали в PBS с 3,7% формальдегида, окрашивали флуоресцентным красителем Hoe^st 25 мкг/мл и фотографировали с помощью инвертированного светового микроскопа Olympus IX-51 (10Ч увеличение) (Olympus Corporation, Япония). Способность клеток к миграции по градиенту ростовых факторов оценивали по среднему числу клеток в пяти полях видимости.
Результаты и их обсуждение
На сегодняшний день роль флотиллинов в канцерогенезе изучена мало. Показано, что повышение экспрессии флотиллина-1 в образцах рака молочной железы по сравнению с таковой в нормальной ткани коррелирует с клиникоморфологическими показателями и является независимым фактором неблагоприятного прогноза заболевания [9]. Кроме того, подавление экспрессии флотиллина-1 в клеточных линиях рака молочной железы приводит к уменьшению туморогенно-сти последних in vivo и снижению скорости проли-
ферации in vitro [9]. Флотиллин-1 оказывает мито-генное влияние на клетки аденокарциномы простаты человека, что может быть связано с его способностью взаимодействовать с киназой Aurora B и изменять ее активность [5; 15].
Экспрессия флотиллина-2 изменяется при опухолевой трансформации клеток. Уровень данного белка повышается при меланоме и коррелирует со стадией заболевания [6]. В экспериментах in vivo доказано существование связи между уровнем экспрессии флотиллина-2 и метастатической способностью клеток меланомы. Так, суперэкспрессия флотиллина-2 в низкотуморогенных и низкомета-стазных линиях резко увеличивает их тумороген-ность и способность к метастатазированию на модельной системе иммунокомпетентных мышей. Кроме того, исследования в культуре клеток in vitro показали, что флотиллин-2 увеличивает скорость пролиферации клеток меланомы в отсутствии ростовых факторов и усиливает способность клеток к инвазии через Матригель [6]. В данной работе мы исследовали влияние подавления экспрессии фло-тиллина-2 на свойства клеток РЛ, ассоциированные с опухолевой прогрессией.
Получение производных клеточной линии Н460 с подавленной экспрессией гена FLOT-2. В качестве модели мы использовали высокометастаз-ную клеточную линию Н460, которая была получена в 1982 г. из плевральной жидкости больного крупноклеточным РЛ [3]. Из литературных данных известно, что данная линия обладает высоким метастатическим потенциалом, и при ортотопическом введении ксенографтам она дает множественные метастазы в регионарные лимфоузлы и в отдаленные органы [19]. Для изучения влияния экспрессии флотиллина-2 на свойства клеток линии Н460 его эндогенная экспрессия была подавлена с помощью двух различных последовательностей, кодирующих мЩрНк к мРНК FLOT-2 (флотиллина-2) человека. В качестве контроля использовалась мшРНК к мРНК зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein) GFP, и получена соответствующая линия ^60-sh-GFP. Как показано на рис. 1 А, в обеих линиях с подавленной экспрессией флотил-лина-2 уровень продукции соответствующего белка снижен по сравнению с контрольной линией, причем снижение более выражено для линии Н460^Ы-Flot-2. Анализ ПЦР в реальном времени показал, что относительный уровень мРНК флотиллина-2 значимо снижается в обеих линиях с мшРНК, что полностью коррелирует с результатами Вестерн-блот гибридизации (рис. 1Б).
Исследование характеристик полученных клеточных линий. Анализ динамики роста клеток выявил, что при подавлении экспрессии флотилли-на-2 происходит уменьшение скорости пролиферации клеток, которое в линии Н460-sh1-Flot-2 выражено ярче, чем в Н460-sh2-Flot-2 (рис. 2). Замедление пролиферации может быть связано с остановкой клеток в одной из фаз клеточного цикла. Чтобы проверить это предположение, мы провели исследование клеточного цикла в полученных линиях с помощью проточного цитофлуориметра. Хотя мы не обнаружили статистически значимых различий в этом эксперименте, в линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2 мы наблюдали слабую тенденцию к увеличению доли клеток в Go/Gi фазе клеточного цикла (табл.).
Регуляция клеточного цикла может осуществляться различными путями, однако одним из важнейших модуляторов данного процесса является
белок р53. Этот транскрипционный фактор изменяет экспрессию большого числа генов, но основным медиатором эффектов р53 на клеточный цикл является белок p21 ip1/Waf1 - ингибитор циклинзависи-мых киназ из семейства Cip/Kip. Он непосредственно связывается с комплексами циклинов с цик-лин-зависимой киназой Cdk2, подавляя их активность и вызывая остановку клеточного цикла в G0/G1 фазе. Подавление экспрессии и активности р53 является частым нарушением при злокачественных новообразованиях человека [12]. Однако, из литературы известно, что клетки линии Н460 имеют нормальный уровень экспрессии р53 [17].
Мы сравнили уровень р53 и его эффектора р21 в контрольной линии клеток и в линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2 с помощью Вестерн-блот гибридизации. В линии Н460^Ы-Flot-2 содержание р53 оказалось повышено, однако в линии Н460-sh2-Flot-2 оно не отличается от такового контроля (рис. 3). Количество белка р21 увеличено в обеих производных линиях, причем в линии Н460-sh1-Flot-2 это увеличение выражено сильнее (рис. 3). Таким образом, на основании полученных данных мы можем предположить, что снижение скорости пролиферации при подавлении экспрессии флотиллина-2 обусловлено повышением уровня белков р53 и р21 и активацией соответствующего сигнального пути. Увеличение уровня р21 при подавлении гена FLOT-2 вероятно связано не только с возрастанием количества р53, но и с альтернативными путями регуляции, поскольку в линии Н460-sh2-Flot-2, где уровень р53 не изменяется, экспрессия р21 усиливается. Активация р53/р21-зависимого пути в данной модельной системе может обусловливать увеличение доли клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла, хотя оно и незначительно.
Приобретение локомоторного фенотипа опухолевыми клетками играет ключевую роль на поздних стадиях опухолевой прогрессии. Именно он позволяет клеткам покидать первичный очаг опухолевого роста, диссеминировать в отдаленные органы организма и образовывать там метастазы. Мы оценили миграционную способность клеток линии Н460 в тесте на миграцию в камерах Бойде-на. В данном тесте клетки, помещенные в бессыво-роточную среду, мигрируют по градиенту концентрации ростовых факторов. Мы обнаружили статистически значимое снижение миграционной способности в обеих линиях клеток с подавленной экспрессией гена FLOT-2 по сравнению с контрольной линией (р<0,05) (рис. 4).
В процессе инвазии опухолевых клеток в близлежащие ткани важнейшую роль играет изменение их способности расщеплять окружающий внеклеточный матрикс. Данная модификация микроокружения осуществляется за счет продукции и секреции различных внеклеточных протеаз. Мы сравнили активность двух основных систем протеаз в исследуемых клеточных линиях - группы мат-риксных металлопротеаз (ММР) и урокиназопо-добного активатора плазминогена uPA (urokinase plasminogen activator). В контрольной линии клеток ^60-sh-GFP мы обнаружили активность только одной матриксной протеазы ММР-2, а также активность uPA и tPA (tissue plasminogen activator) -тканевого активатора плазминогена, который выполняет сходные с uPA функции (рис. 5). Однако в линиях клеток с подавленной экспрессией флотил-лина-2 мы наблюдали уменьшение активности ММР-2 и увеличение uPA.
Рис. 1. Подавление экспрессии FLOT-2 в клетках линии Н460:
А: Сравнительный анализ количества белка флотиллин-2 в лизатах клеточных линий R460-sh-GFP, R460-sh1-Flot-2 и 4460-sh2-Flot-2 с помощью Вестерн-блот гибридизации. Гибридизация блотов с антителами на бета-актин проводилась в качестве контроля.
Б: Сравнительный анализ уровня мРНК FLOT-2 с помощью ПЦР в реальном времени. Ген GAPDH использовался в качестве референсного. Уровень мРНК нормализовался по контрольной линии 4460-sh-GFP (прерывистая линия на обоих графиках) *p<0,05
Рис. 2. Анализ динамики роста клеточных линий Н460-8Ь-вРР, Н460-8Ы-Ио1;-2 и Н460-зЬ2-Ио1;-2 прямым счетом в камере Горяева. По 20 000 клеток сажалось в лунки 6-луночного планшета, количество клеток в лунках определялось подсчетом в камере Горяева в пяти временных точках с интервалом в 24 ч.
-о чЯ"* чА*
Рис. 3. Сравнительный анализ количества белков р53 и р21 в лизатах клеточных линий Н460-8Ь-вРР, Н460-8Ь1-Ио1-2 и Н460-8Ь2-Ио1-2 с помощью Вестерн-блот гибридизации. Гибридизация блотов с антителами на бета-актин проводилась в качестве контроля.
Рис. 4. Тест на миграцию в камерах Бойдена. Для проведения теста 40000 клеток в среде без сыворотки помещалось внутрь камеры, внешнюю камеру заполняли средой с 10% сыворотки. Через 24 ч промигрировавшие через отверстия в мембране клетки фиксировались, окрашивались флуоресцентным красителем ИоесЬ8І и фотографировались. Способность клеток к миграции оценивалась по среднему числу клеток на поле видимости в пяти полях. *р<0,05
Рис. 5. Анализ ферментативной активности ММР и иРА в клеточных линиях Н460-8Ь-вРР, Н460-8Ь1-Ио1;-2 и Н460-дЬ2-Р1о1-2. Исследование проводили методом зимографии на кондиционированных средах.
"V 'V / / / *>'
Ж & я? <> Ч?*
флотиллин-1
стоматин
кавеолин-1
S 0.5-
□ H460-shl-Flot-2
□ H460-sh2-Flot-2
ІГІІІ
E FLOT-1 CAV-1 STOM О
Рис. 6. Подавление экспрессии флотиллина-2 влияет на белковый уровень флотиллина-1, кавеолина-1 и стоматина:
А: Сравнительный анализ количества белков флотиллин-1, кавеолин-1 и стоматин в лизатах клеточных линий Н460-sh-GFP, 4460-sh1-Flot-2 и 4460-sh2-Flot-2 с помощью Вес-терн-блот гибридизации. Гибридизация блотов с антителами на бета-актин проводилась в качестве контроля.
Б: Сравнительный анализ уровня мРНК генов FLOT-1, CAV-1 и STOM с помощью ПЦР в реальном времени. Ген GAPDH использовался в качестве референсного. Уровень мРНК нормализовался по контрольной линии R460-sh-GFP (прерывистая линия на обоих графиках). *p<0,05
Таким образом, экспрессия флотиллина-2 влияет на уровень активности систем деградации внеклеточного матрикса и может изменять способность клеток к инвазии.
Исследование экспрессии других рафт-образующих белков в клеточных линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2. Одним из важнейших свойств рафт-образующих белков является их способность к олигомеризации, благодаря которой белки одного типа формируют крупные белковые комплексы, влияющие на структуру мембранных микродоменов. Флотиллины способны как к гомо-так и к гетероолигомеризации, причем в отсутствии флотиллина-2 его партнер флотиллин-1 нестабилен и подвергается деградации по протеасомному пути [16]. В свою очередь подавление экспрессии фло-тиллина-1 также может снижать уровень флотил-лина-2 [11], что несомненно говорит о взаимном влиянии данных белков друг на друга.
Чтобы проверить, существует ли такая зависимость в нашей экспериментальной системе, мы оценили уровень белка флотиллина-1 в полученных производных клеточных линиях. В контрольной линии Н460-sh-GFP мы обнаружили достаточно высокий эндогенный уровень экспрессии флотиллина-1, который значительно снижался в линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2 (рис. 6, А), причем это изменение было более выражено в случае мшРНК sh1-Flot-2, которая сильнее подавляла экспрессию флотиллина-2. Таким образом, на линии Н460 РЛ мы подтвердили данные, полученные исследователями на других экспериментальных моделях, и показали, что уровни продукции флотиллина-1 и флотиллина-2 взаимосвязаны друг с другом.
По своему строению, локализации и выполняемым в клетке функциям флотиллины весьма сходны с белками семейств кавеолинов и стомати-нов. Предполагается, что флотиллины являются функциональными аналогами кавеолинов и могут замещать их в тех типах клеток (лимфоциты, нейроны), где кавеолины отсутствуют [2]. Однако вопрос о взаимном влиянии белков этих двух семейств в тех типах клеток, где они экспрессируются одновременно, остается практически неизученным. Что касается стоматинов, то совместных исследований их экспрессии с другими рафт-образующими белками ранее не проводилось. Мы проверили, влияет ли изменение экспрессии фло-тиллина-2 на уровень кавеолина-1 и стоматина в клетках АК легкого человека.
Для этого мы оценили уровень экспрессии кавеолина-1 и стоматина в полученных клеточных линиях. В обеих линиях с подавленной экспрессией флотиллина-2 наблюдалось увеличение количества кавеолина-1 и стоматина, что показано нами впервые (рис. 6, А).
Чтобы проверить, являются ли обнаруженные нами изменения экспрессии рафт-образующих белков транскрипционными, мы оценили относительную экспрессию мРНК генов ЕЬОТ-1, 8ТОЫ и САУ-1 в исследуемых клеточных линиях. Как показано на рис. 6Б, относительная экспрессия всех трех генов значимо не изменяется. Следовательно, изменение продукции данных белков не является результатом изменения уровня мРНК, а происходит за счет регуляции трансляции и/или стабильности белковых молекул.
Уменьшение количества флотиллина-1 при подавлении экспрессии флотиллина-2 согласуется с литературными данными о том, что в отсутствии партнера флотиллин-1 подвергается протеасомной деградации. Что касается увеличения количества белков кавеолин-1 и стоматин при нокдауне фло-тиллина-2, то эти данные указывают на существование компенсаторного пост-трансляционного механизма, регулирующего стабильность молекул аналогов флотиллина-2 в ответ на изменение его уровня экспрессии.
Выводы
Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о влиянии флотиллина-2 на такие важнейшие характеристики опухолевых клеток, как скорость пролиферации и миграция. Определение молекулярных механизмов флотиллин-2-зависимой стимуляции данных процессов открывает новые перспективы для поиска дополнительных маркеров одного из самых прогностически неблагоприятных онкологических заболеваний - рака легкого.
Мы также хотим заострить внимание на том, что изменение экспрессии флотиллина-2 сопровождается изменением эндогенного уровня и других рафт-образующих белков, флотиллина-1, кавеолина-1 и стоматина, что, очевидно, изменяет структуру и функционирование мембранных липидных рафтов, и, несомненно, приводит к модификации важнейших путей передачи сигналов, ассоциированных с опухолевой трансформацией и прогрессией. Изучение механизмов взаимного влияния рафт-образующих белков является одной из неисследованных, но крайне актуальных проблем.
Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-12097 офи-м-2011 и грантами Министерства Образования и Науки Российской Федерации 11.034.31. 0006 и 2012-
1.1-12-000-1002-064.
Таблица
Исследование распределения клеточных линий по фазам клеточного цикла
с помощью проточного цитофлуориметра.________________________________________________________________
Стадия клеточного цикла H460-sh-GFP H460-sh1-Flot-2 H460-sh2-Flot-2
G0/G1 51,71 53,6 57,6
S 27,5 23,0 23,3
G2/M 14,9 14,0 15,5
Апоптоз 2,9 6,2 1,8
Цифры в таблице обозначают процент клеток данной категории от общего числа исследованных клеток.
Литература
1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность от злокачественных заболеваний // Вестник РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН. - 2008. - Т. 19, № 2, Приложение 1. - С. 91-119.
2. Babuke T., Tikkanen R. Dissecting the molecular function of reggie/flotillin proteins // Eur J Cell Biol. -
2007. - 86(9). - P. 525-32.
3. Banks-Schlegel S.P., Gazdar A.F., Harris C.C. Intermediate filament and cross-linked envelope expression in human lung tumor cell lines // Cancer Res. - 1985. - 45(3). - P. 1187-97.
4. Browman D.T., Hoegg M.B., Robbins S.M. The SPFH domain-containing proteins: more than lipid raft markers // Trends Cell Biol. - 2007. - 17(8). - P. 394-402.
5. Gomez V., Sese M., Santamaria A. et al. Regulation of aurora B kinase by the lipid raft protein flotillin-1 // J Biol Chem. - 2010. - 285(27). - P. 20683-90.
6. Hazarika P., McCarty M.F., Prieto V.G. et al. Up-regulation of Flotillin-2 is associated with melanoma progression and modulates expression of the thrombin receptor protease activated receptor 1 // Cancer Res. -2004. - 64(20). - P. 7361-9.
7. KnizhnikA.V., Kovaleva O.V., Komelkov A.V. et al. Arf6 promotes cell proliferation via the PLD-mTORC1 and p38MAPK pathways // J Cell Biochem. - 2012. - 113(1). - P. 360-71.
8. Langhorst M.F., Reuter A., Stuermer C.A. Scaffolding microdomains and beyond: the function of reggie/flotillin proteins // Cell Mol Life Sci. - 2005. - 62(19-20). - P. 2228-40.
9. Lin C., Wu Z., Lin X. et al. Knockdown of FLOT1 impairs cell proliferation and tumorigenicity in breast cancer through upregulation of FOXO3a // Clin Cancer Res. - 2011. - 17(10). - P. 3089-99.
10. Lingwood D., Simons K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle // Science. - 2010. - 327(5961). - P. 46-50.
11. Ludwig A., Otto G.P., Riento K. et al. Flotillin microdomains interact with the cortical cytoskeleton to control uropod formation and neutrophil recruitment // J Cell Biol. - 2010. - 191(4). - P. 771-781.
12. Malumbres M., BarbacidM. To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer // Nat Rev Cancer. - 2001.
- 1(3). - P. 222-31.
13. Patra S.K. Dissecting lipid raft facilitated cell signaling pathways in cancer // Biochim Biophys Acta. -
2008. - 1785(2). - P. 182-206.
14. Razani B., Woodman S.E., Lisanti M.P. Caveolae: from cell biology to animal physiology // Pharmacol Rev.
- 2002. - 54(3). - P. 431-67.
15. Santamaria A., Castellanos E., Gomez V. et al. PTOV1 enables the nuclear translocation and mitogenic activity of flotillin-1, a major protein of lipid rafts // Mol Cell Biol. - 2005. - 25(5). - P. 1900-11.
16. Solis G.P., Hoegg M., Munderloh C., Schrock Y. Reggie/flotillin proteins are organized into stable tetramers in membrane microdomains // Biochem J. - 2007. - 403(2). - P. 313-22.
17. Takahashi T., Nau M.M., Chiba I. et al. p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer // Science. - 1989. - 246(4929). - P. 491-4.
18. Williams T.M., Lisanti M.P. Caveolin-1 in oncogenic transformation, cancer, and metastasis // Am J Physiol Cell Physiol. - 2005. - 288(3). - P. 494-506.
19. Yang M., Hasegawa S., Jiang P. et al. Widespread skeletal metastatic potential of human lung cancer revealed by green fluorescent protein expression // Cancer Res. - 1998. - 58(19). - P. 4217-21.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
