CC BY
119
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.006.04-092:612.014.1]:577.21.08
А.В. Лахин1, А.С. Ефремова1, И.В. Макарова1, Е.Е. Гришина2, С.И. Шрам1, В.З. Тарантул1,
Л.В. Генинг1
влияние mn (ii) на ошибочную активность днк-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека
1Институт молекулярной генетики РАН, Москва; 2Офтальмологическая клиническая больница Департамента
здравоохранения Москвы
ДНК-полимераза йота (Pol i), обладающая рядом необычных свойств и крайне неточным синтезом ДНК, относится к группе ферментов, каталитическая активность которых преимущественно активируется Mn2+, а не Mg2+. В этой работе с помощью метода misGvA (misincorporation of "G" versus "A", method of Gening) изучено влияние концентрации Mn2+ на характер синтеза ДНК в экстрактах клеток: 1) нормальных тканей человека и мыши; 2) опухолей человека (увеальная меланома глаза); 3) опухолевых культур человека (SKOV-3 и HL-60). В каждой группе обнаружены характерные особенности и закономерности Mn-зависимого синтеза ДНК. Описаны изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при трансформации клетки из нормальной в опухолевую. Также показано, что ошибочный синтез ДНК, катализируемый Pol i, в экстрактах всех типов клеток эффективно подавляется с помощью ранее нами полученного РНК-аптамера к Pol i, названного IKL5. Полученные результаты могут стать основой использования данного аптаме-ра как потенциальное средство для подавления повышенной активности Pol i в опухолевых клетках.
Ключевые слова: ДНК-полимераза йота, меланома, ап-тамер, мутагенез
Pol i относится к Y-семейству ДНК-полимераз, все члены которого принимают участие в синтезе ДНК на поврежденных и модифицированных участках, так называемом синтезе через повреждение (TLS) [20, 31]. Однако из-за структурных особенностей каталитического центра данных репаративных ДНК-полимераз они по сравнению с репликативными ДНК-полимеразами при синтезе ДНК на неповрежденных матрицах допускают ошибки намного чаще [12, 25]. Данный конфликт пользы (преодоление блока репликации и поддержание стабильности генома) и вреда (высокая частота ошибок синтеза, приводящая к мутациям, error-prone synthesis) в нормальных клетках разрешается жесткой регуляцией функционирования данной группы ферментов как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне. Так, показано, что Pol i взаимодействует с ДНК-полимеразой П и с Revl, и такое взаимодействие обеспечивает попадание данного белкового комплекса к поврежденному участку ДНК [15, 28]. Также важными факторами участия Pol i в процессах репарации ДНК служат взаимодействия как с ядерным антигеном проли-ферирующих клеток (PCNA), так и с фактором экс-цизионной репарации оснований XRCC1 [13, 30]. В связи с этим данное исследование имело целью выяснить, в какой мере сложный комплекс имеющихся в клетке регуляторных факторов влияет на активность Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток. Особый интерес также представляло изучение происходящих при злокачественной трансформации клеток
изменений в синтезе ДНК: интенсивность включения и точность встраивания нуклеотидов.
Известно, что все ДНК-полимеразы для своего функционирования требуют присутствия двухвалентных катионов [19, 21, 32]. Преобладание в клетке концентрацией Mg2+ над концентрацией других двухвалентных катионов служило основанием предполагать, что именно Mg2+ является основным кофактором для синтеза ДНК in vivo. Однако для гомогенного препарата Pol i предпочтительным активирующим кофактором является Mn2+, присутствие которого в реакционной среде намного сильнее повышает каталитическую активность этого фермента, чем присутствие любого другого двухвалентного катиона [11]. Тем не менее остается неясным, как активация Pol i Mn2+ реализуется в живой клетке в присутствии содержащихся там разнообразных регуляторных факторов. Изучение влияния Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток может позволить в определенной мере решить этот вопрос.
Одной из характерных особенностей Pol i является способность встраивать некорректный G напротив T-матрицы даже в присутствии избытка корректного нуклеотида, dATP [17, 35]. Данное уникальное свойство лежит в основе misGvA-метода [1, 2], который позволяет выявлять активность Pol i в экстрактах клеток органов и тканей млекопитающих. Ошибочную ДНК-полимеразную активность Pol i можно отличить от активности других ДНК-полимераз экстрактов клеток благодаря уникальной способности фермента предпочтительнее включать G напротив T-матрицы и различию в электрофоретической подвижности между продуктами элонгации праймера, произведенными Pol i и другими ДНК-полимеразами [1, 2]. Подтверждением корректности misGvA-метода служил тот факт, что экспрессия Pol i человека в клетках дрожжей дает характерный продукт на электрофореграм-ме, в то время как в контрольных клетках дрожжей он отсутствовал [23]. Однако не стоит забывать о том, что набор ДНК-полимераз и регуляторных факторов у дрожжей и у человека сильно отличается. Кроме того, из данных литературы известно, что регуляция активности многих ферментов человека осуществляется по-разному в нормальных и в злокачественных клетках [14, 24, 27]. В связи с этим еще одной нашей задачей было выяснение того, выявляется ли с помощью misGvA-метода продукт активности именно Pol i; как в нормальных, так и в опухолевых тканях; способны ли другие ДНК-полимеразы экстрактов нормальных
ЭKCПЕРИMЕHТAЛЬHЫЕ СТАТЬИ
или опухолевых клеток в значимом количестве образовывать продукт с некорректно включенным G напротив T-матрицы. Решением данного вопроса, на наш взгляд, является специфическое функциональное выключение Pol i с помощью аптамера именно в экстрактах клеток человека. В данном случае весь набор ДНК-полимераз, за исключением ингибированной Pol i, продолжал бы функционировать, и результаты анализа электрофореграмм с продуктами синтеза дали бы ответ на поставленные вопросы.
Материалы и методы
Образцы клеток и тканей. Линия клеток SCOV-3 была любезно предоставлена Г.А. Посипановой (Московский НИИ медицинской экологии), а линия клеток HL-60 была получена из Российской коллекции клеточных культур (Санкт-Петербург). Обе клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, эмбриональную сыворотку телят (PAA Laboratories) в концентрации 10% для клеток SCOV-3 и 20% для клеток HL-60 и 50 мкг/мл гентами-цина, при 37oC в С02-инкубаторе, содержащем 95% воздуха и 5% CO2.
Для изучения ДНК-полимеразной активности в экстрактах клеток органов и тканей нормальных животных использовали мышей линии C57BL, у которых были проанализированы экстракты клеток головного мозга, печени и селезенки.
В качестве нормальной ткани человека использовали хориоидею глаза, а в качестве опухолевой ткани человека -увеальную меланому глаза. Хориоидеи взяты как из глаз, пораженных опухолью, так и из удаленных в результате травм глаз. Всего проанализировали 10 меланом от 10 пациентов и 15 хориоидей от 15 пациентов.
Приготовление экстрактов клеток. Для получения экстрактов брали образцы исследуемых тканей и измельчали их на льду тефлоновым гомогенизатором в 1X PBS, pH 7.4 (Helicon, Россия). Объем буфера брался исходя из расчета 1 мкл буфера на 1 мг гомогенизируемой ткани. Полученный го-могенат центрифугировали при 4°C в течение 10 мин при 14 000 д. Супернатант использовался в качестве ферментного препарата. Концентрацию белка измеряли с использованием реагента Protein Assay (BioRad США) и доводили до 5 мг белка на 1 мл.
Субстрат для определения активности Pol ъ В качестве субстрата для определения активности ДНК-полимераз использовали два комплементарных дезоксирибоолигонуклеотида: 17-членный праймер 5'-GGAAGAAGAAGTATGTT-3' и 30-членную матрицу 5' -CCTTCTTCATTCTAACATACTTCTTCTTCC-3', которые при гибридизации образуют дуплекс с выступающим 5'-концом [37]. Мечение праймера с 5'-конца проводили с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 (10 единиц) и 2 МБк [у-32Р] ATP в 70 мМ Tris-HCl-буфере, рН 7,6, содержавшем 10 мМ MgCl2 и 5 мМ дитиотреитола (ДТТ), при 37°C в течение 30 мин. После этого проводили инактивацию фермента при 70°C в течение 10 мин. Субстрат для ферментативной реакции получали после отжига в 200 мкл 10 пмоль меченого праймера с 15 пмоль матрицы в буфере для ПНК с добавлением NaCl до 100 мМ при 73°C в течение 3 мин и с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Определение ДНК-полимеразной активности. Активность Pol i измеряли с использованием misGvA-метода, описанного нами ранее [1, 2] и позволяющего тестировать активность этого фермента в присутствии других ДНК-полимераз (например, в экстрактах клеток). Метод основан на разнице в электрофоретической подвижности между праймером, достроенным Pol i, и праймером, достроенным другими ДНК-полимеразами.
Реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 50 нМ субстрата с меченым праймером, 50 мМ Tris-HCl, рН 8, 0,2 мМ MnCl2, по 0,5 мМ dATP и dGTP и 3 мкл экс-
тракта соответствующего образца. Смесь инкубировали при 37°C 5 мин для экстрактов клеток органов мышей и 20 мин для экстрактов клеток органов человека. Реакцию останавливали охлаждением во льду с последующим добавлением равного объема смеси для нанесения образцов на полиакрила-мидный гель (95% формамид с 0,05% ксиленцианолом и 0,05% бромфеноловым синим). Электрофорез продуктов реакции осуществляли в l8% ПААГ с 7 M мочевиной в Tris-боратном буфере при силе тока l5 мА (до начала выхода из геля бром-фенолового синего). После электрофореза гель выдерживали в течение l0 мин в фиксирующем растворе, содержавшем l0% уксусную кислоту, 30% этиловый спирт и l% глицерин, затем высушивали и радиоавтографировали в течение суток. Автограф сканировали на фосфоимиджере Storm 840 (Amersham Biosciences, США). Данные анализировали с помощью программы Image Quant 5.2.
Относительное включение G напротив T-матрицы (MoG - Misincorporation of G) рассчитывали по формуле MoG = ((d + c + b + a) • l00%)/ (4D +d) + 3(C + c) + 2(B + b) + (A + a)), где A, B, C и D- интенсивность полос на электрофореграмме, соответствующих продуктам, генерируемым корректными ДЖ-полимеразами +l(l8A), +2(l9G), +3(20A) и + 4(2lA), тогда как a, b, c, и d - интенсивность полос +l*(l8G), +2*, +3* и +4*, соответствующих олигонуклеотидам с отличающейся электрофоретической подвижностью, образующимся в результате продолжения синтеза ДЖ! после +l* продукта Pol i.
Приготовление препарата аптамера IKL5 для добавления в ДНК-полимеразную реакцию. РЖ! аптамер IKL5 был синтезирован в РЖ!-полимеразной реакции in vitro, как описано ранее [l8]. Синтезированный аптамер был очищен денатурирующим электрофорезом в ПААГ [9]. После элюции из полиа-криламидного геля и осаждения этанолом аптамер растворяли в l00 мM NaCl. Для рефолдинга аптамера смесь инкубировали 3 мин при 73°C с последующим постепенным охлаждением до комнатной температуры. Kонцентрацию аптамера измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop l000 (Thermo Fisher Scientific, США).
Изучение ингибирующего действия аптамера IKL5 на активность Pol i в экстрактах клеток. Для изучения влияния аптамера IKL5 на активность ДЖ!-полимераз в экстрактах клеток аптамер прединкубировалипри 25°С l0 мин с 3 мкл экстракта клеток в l5 мкл смеси, содержавшей 50 мM Tris-HCl, pH 8, l единицу ингибитора РЖ!аз (Fermentas), 0,2 мM MnCl2, а также по 0,5 мM dATP и dGTP. После этого к смеси добавляли радиоактивно меченный олигонуклеотидный субстрат до концентрации 50 hM и полученную cмесь инкубировали 20 мин при 37°С с последующим перенесением в баню со льдом и добавлением смеси для нанесения образцов на полиакриламидный гель (95% формамид с 0,05% ксиленцианолом и 0,05% бромфеноловым синим).
Результаты и обсуждение
Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных клеток человека и мыши. С целью изучения влияния концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных клеток были поставлены реакции элонгации радиоактивно меченного праймера. Реакции проводили в ряде реакционных смесей, содержащих Mn2+ от l0 до 200 мкM в виде соли хлора. В данном интервале концентраций находятся как оптимум для гомогенного препарата фермента, так и физиологическая концентрация Mn2+ в клетке [3, ll, 33].
Продукт активности Pol i в большинстве исследованных нормальных тканей мыши и человека проявляется уже с l0 мкM Mn2+ (рис. l). Однако в некоторых органах, например в селезенке мыши, продукт активности Pol i отмечается лишь при концентрации
Mn2+ 50 мкМ и выше. Незначительное увеличение количества продуктов активности Pol i во всех органах можно наблюдать лишь в промежутке от 10 до 50 мкМ Mn2+. Также из рис. 1 видно, что активность Pol i, достигнув максимума при 50-100 мкМ Mn2+, при дальнейшем повышении концентрации этого иона не изменяется, оставаясь на плато.
Одной из особенностей Pol i является наличие такого явления, как Т-стоп [35, 37]. Его суть заключается в остановке синтеза продукта, в который Pol i включила некомплементарный G напротив Т-матрицы. Как видно на рис. 1, подобное явление обнаруживают в экстрактах клеток всех нормальных тканей млекопитающих вне зависимости от концентрации Mn2+. В результате электрофореза продуктов синтеза двойную полосу выявляют только в районе 18-членного олигонуклеотида, где продукт Pol i, содержащий G на З'-конце, движется медленнее 18-членных продуктов других ДНК-полимераз, на З'-конце которых включен А.
Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток увеальной меланомы человека. Реакция элонгации радиоактивно меченного праймера в экстрактах клеток меланом в зависимости от концентрации Mn2+ в реакционной смеси показала картину, во многом отличающуюся от наблюдаемой в экстрактах клеток нормальных тканей (рис. 2, а). Тем не менее так же как и в нормальных тканях, продукт активности Pol i начинает отмечаться при концентрации Mn2+ 10 мкМ, и активность фермента также выходит на плато при 50-100 мкМ. Однако в экстрактах клеток меланом относительная доля продуктов Pol i крайне высока и достигает порядка 60% (см. рис. 2, а, б). Еще одной отличительной особенностью является то, что при концентрации Mn2+ 50 мкМ и выше в экс-
Рис. 1. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток нормальных тканей человека и мыши. Электрофореграмма продуктов синтеза в экстрактах: а - органов мышей; б - хориоидеи человека; в -относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграмм а, б).
трактах клеток меланом начинает отмечаться феномен преодоления Т-стопа (см. рис. 2, а). Этот феномен описан нами ранее и представляет собой одну из характеристик опухолевой ткани, отличающую данный синтез ДНК от синтеза в нормальной ткани [2]. В данном случае на электрофореграмме мы можем наблюдать сразу несколько двойных полос. Наличие верхних полос в области 19- и 20-членных продуктов свидетельствует о функционировании механизма достройки продуктов синтеза с некорректно включенным нуклеотидом.
Изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при злокачественной трансформации клетки. На рис. 2в представлена типичная картина Mn-зависимого синтеза ДНК, осуществляемая в экстрактах клеток хориоидеи (дорожка 1) и меланомы (дорожка 2), взятых от одного и того же пациента. Количество белка в обоих экстрактах и условия проведения реакции идентичны. Результаты анализа электрофореграмм показали, что в экстрактах клеток меланомы происходит усиление общего синтеза ДНК в 6 раз по сравнению с таковым синтеза в экстрактах клеток хориоидеи. Эти различия обусловлены в основном значительно возросшей активностью Pol i. Количество ее продуктов увеличивается в 10-12 раз, в то время как количество продуктов корректных ДНК-полимераз увеличивается лишь в 4 раза.
Влияние концентрации Mn2+ на активность Pol i в экстрактах клеток человеческих опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. Реакция элонгации радиоактивно меченного праймера в зависимости от концентрации Mn2+ в экстрактах опухолевых клеток SKOV-3 и HL-60 выявила паттерн синтеза ДНК, отличный как от полученного с экстрактами клеток нормальных тканей, так и от полученного с экстрактами клеток меланом (рис. 3). Подобно экстрактам клеток мела-ном, экстракты клеток данных линий также характеризуются преодолением Т-стопа. В то же время достаточно низкая относительная доля продукта Pol i (14-16%) и отсутствие активности исследуемого фермента при концентрации Mn2+ 10 мкМ делают данный паттерн похожим на наблюдаемый в экстрактах клеток нормальных тканей. Также стоит отметить, что экстракты клеток обеих опухолевых линий демонстрируют в целом сходную картину синтеза ДНК. Характерной чертой экстрактов данных клеток является достижение максимума активности Pol i при концентрации Mn2+ 200-250 мкМ.
Таким образом, мы провели исследование зависимости активности Pol i от концентрации Mn2+ в экстрактах клеток нормальных тканей, меланом и опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. В результате можно отметить, что в каждом из проанализированных случаев мы имеем дело с определенным вариантом синтеза ДНК. Они
Рис. 2. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток увеальной меланомы человека. а - электрофореграмма продуктов синтеза; б - относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а); в - сравнение ДНК-полимеразной активности экстрактов клеток хориоидеи (дорожка 1) и увеальной меланомы (дорожка 2) человека.
различаются по интенсивности misGvA-синтеза, общей ДНК-полимеразной активности и способности преодолевать Т-стоп (см. таблицу).
Влияние аптамера IKL5 на интенсивность образования продуктов с некорректно встроенным G напротив T-матрицы в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека. Как было описано выше, в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека в зависимости от концентрации Mn2+ образование продуктов с некорректно встроенным G напротив T-матрицы происходит по-разному. Данный факт может указывать как на функционирование в разных типах тканей различных регуляторных факторов, по-разному влияющих на активность Pol 1, так и на возможное участие в образовании продукта с некорректно встроенным G разных ДНК-полимераз. Для выяснения данного вопроса мы поставили эксперименты по изучению влияния полученного нами ранее РНК-аптамера к Pol i на синтез ДНК в экстрактах клеток человека [18]. Для этого мы проводили реакцию элонгации радиоактивно меченного праймера в присутствии 1 мкМ аптамера IKL5. Добавление аптамера в реакционную смесь, содержащую экстракт клеток меланомы, приводит к значительному, почти полному, исчезновению продуктов с некорректно включенным G напротив T-матрицы (рис. 4). Количество продуктов с некорректно встроенным G в присутствии ап-тамера даже на 20 мин реакции значительно меньше, чем количество данных продуктов без аптамера после 1 мин.
Затем мы изучили влияние аптамера IKL5 на синтез ДНК в экстрактах клеток как SKOV-3 и HL-60, так и в экстрактах клеток хориоидеи. На рис. 5 видно, что во всех случаях добавление аптамера приводит к исчезновению верхних полос (продуктов с некорректно встроенным нуклеотидом) в районе 18-, 19- и 20-членных продуктов элонгации праймера. В то же время стоит отметить, что интенсивность полос, соответствующих продуктам активности других ДНК-полимераз, остается неизменной.
В данной работе мы впервые исследовали влияние близких к физиологическим концентраций Mn2+ на активность Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши. Mn2+ является наиболее эффективным кофактором Pol i, и наличие этого иона в реакционной среде позволяет выявить активность Pol
i в экстрактах клеток большинства тканей как человека, так и млекопитающих [2, 11]. Стоит отметить, что в присутствии Mn2+ способны эффективно работать и некоторые другие ДНК-полимеразы, в частности ДНК-полимераза ß, ДНК-полимераза ц и ДНК-полимераза X. Однако оптимум их активности in vitro проявляется при концентрации Mn2+ 0,1-1 мМ, что значительно выше физиологических значений в клетке [6, 10, 36].
В результате данного исследования мы выявили несколько вариантов Mn-зависимого синтеза ДНК. Характерные для каждого варианта признаки обобщены в таблице. Первый вариант Mn-зависимого синтеза ДНК обнаруживается в экстрактах клеток нормальных тканей и характеризуется достаточно корректным синтезом ДНК с низкой долей активности Pol i и отсутствием преодоления Т-стопа. Второй вариант Mn-зависимого синтеза ДНК наблюдается в экстрактах клеток увеальных меланом и характеризуется крайне интенсивным ошибочным синтезом. Доля продукта Pol i достигает 60% суммарного продукта синтеза ДНК. Еще один вариант Mn-зависимого синтеза ДНК обнаружен в экстрактах клеток человеческих опухолевых линий SKOV-3 и HL-60. Максимум активности Pol i в экстрактах этих клеток достигается при значительно большей концентрации Mn2+, чем в двух первых вариантах Mn-зависимого синтеза. По-видимому, это обусловлено различиями в регуляторных факторах, контролирующих синтез ДНК.
Стоит отметить, что во всех исследованных экстрактах клеток активность Pol i, после достижения максимума при определенной концентрации Mn2+, выходила на плато и при дальнейшем повышении концентрации данного иона не изменялась. Данное поведение Pol i кардинально отличается от поведения гомогенного препарата этого фермента. Так, согласно данным литературы, активность гомогенного препарата Pol i после достижения максимума в ответ на дальнейшее повышение концентрации Mn2+ резко снижается [11]. Все это, а также те многочисленные различия в активности Pol i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток наглядно показывают ту значи-
Основные характеристики Mn-зависимого синтеза ДНК в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека
Нормаль- Опухоль: Опухолевые
Характеристика ная ткань: хориои- увеаль-ная ме- клеточные линии: SKOV-3
дея ланома и HL-60
Концентрация Mn2+, при
которой активность Pol г 50-100 50-100 200-300
достигает максимума, мкМ
Доля активности Pol г от
суммарной активности 15-18 55-65 15-20
синтеза ДНК, %
Преодоление Т-стопа Нет Есть Есть
Суммарная активность синтеза ДНК Низкая Высокая Высокая
Рис. 3. Влияние концентрации Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток опухолевых линий человека SKOV-3 и HL-60.
Электрофореграмма продуктов синтеза в экстрактах: а - клеток SKOV-3, б - клеток HL-60; в - относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а); г - относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы б).
тельную роль, которую занимает сложный комплекс имеющихся в клетке регуляторных факторов в регуляции активности Pol i.
Как известно, увеальная меланома образуется из клеток хориоидеи. В связи с этим сравнение синтеза ДНК в обоих типах тканей, взятых от одних и тех же людей, дает адекватную картину тех количественных и качественных изменений в Mn-зависимом синтезе ДНК, которые осуществляются в клетке при злокачественной трансформации. Как показали результаты анализа электрофореграмм, основными изменениями в синтезе ДНК при злокачественной трансформации являются крайне возросшая активность Pol i и появление способности преодолевать Т-стоп. Ранее мы проводили оценку количества Pol i методом Вестерн-блоттинга в экстрактах хориоидеи и увеальной ме-ланомы [16]. Показано, что в экстрактах хориоидеи Pol i не определяется, а в экстрактах меланомы наблюдается отчетливая полоса. Это позволяет сделать вывод о том, что сильно возросшая активность Pol i в экстрактах клеток меланом по крайней мере частично обусловлена резким усилением экспрессии данного фермента, произошедшим при злокачественной трансформации клеток. В то же время появление феномена преодоления Т-стопа может говорить о значительных изменениях в комплексе регуляторных факторов, что, по-видимому, вызывает ослабление контроля над высокоошибочными репаративными ДНК-полимеразами и разбалансировку механизмов синтеза ДНК. Высокий ошибочный синтез ДНК, по крайней мере отчасти обусловленный активностью Pol i, может приводить к повреждениям и, как следствие, функциональным выключениям генов регуля-торных факторов, препятствующих бесконтрольному делению клетки, провоцируя тем самым злокачествен-
ную трансформацию клетки. Еще около 40 лет назад была сформулирована мутационная гипотеза возникновения рака, согласно которой ранние события канцерогенеза могут быть следствием генерации мутаций из-за нарушения точности работы механизмов репликации и репарации [22]. Показано, что одним из механизмов запуска мутагенеза в клетках могут являться дерегуляция и неконтролируемое повышение активности репаративных ДНК-полимераз. Ассоциация злокачественного перерождения клеток с нарушением активности таких ДНК-полимераз продемонстрирована на ряде примеров. Например, сверхэкспрессия ДНК-полимеразы ß характерна для опухолей яичников, простаты, молочных желез и пр. [5, 7, 34]. Сверхэкспрессия ДНК-полимеразы к ассоциирована с раком легких [4, 29].
В данной работе также продемонстрировано, что добавление аптамера IKL5, специфично ингибирующего Pol i [18], к экстрактам различных типов клеток приводит к полному или почти полному подавлению образования продуктов
Рис. 4. Влияние аптамера IKL5 на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток меланомы. а - электрофореграмма продуктов синтеза; реакцию проводили в присутствии либо 1 мкМ аптамера IKL5 либо 1 мкМ исходного пула олиго-рибонуклеотидов (pool) в качестве контроля; время реакции варьировало от 1 до 20 мин; б - относительная активность Pol i (вычислена на основании электрофореграммы а).
Рис. 5. Электрофореграмма продуктов синтеза, отображающая влияние аптамера IKL5 на ДНК-полимеразную активность в экстрактах различных тканей. Время реакции 20 мин. Реакцию проводили в присутствии либо 1 мкМ аптамера IKL5 либо 1 мкМ исходного пула олигорибонуклеотидов (pool) в качестве контроля.
с некорректно встроенным G напротив T-матрицы. В связи с этим можно сделать вывод о том, что образование таких продуктов обеспечивается активностью именно Pol i, и ни одна другая ДНК-полимераза человека не способна в значимом количестве образовывать их в присутствии избытка комплементарного dATP. Данный результат служит дополнительным веским доказательством правомерности использования misGvA-метода для определения активности Pol i в экстрактах всех типов клеток.
Подавление высокоошибочной активности Pol i аптамером IKL5 в экстрактах как опухолевых, так и нормальных клеток позволяет надеяться на использование данного аптамера в качестве терапевтического средства. Следует учесть также, что эксперименты по ингибированию Pol i в экстрактах клеток проводили в оптимальных для этого фермента условиях. Очевидно, что в клетках, где концентрация Mn2+ намного ниже, ингибирующее действие аптамера будет более эффективным. Выключение Pol i на ранних стадиях онкоге-неза, возможно, снизило бы скорость мутагенеза и тем самым уменьшило вероятность приобретения одной клеткой необходимых для злокачественной трансформации мутаций, инактивирующих гены регуляторных белков и активирующих онкогены. В свою очередь, подавление активности Pol i уже в злокачественных опухолевых клетках могло бы привести к снижению адаптивности в ответ на воздействие терапевтических агентов. Преимуществом использования для данных целей аптамеров по сравнению, например, с антителами являются отсутствие иммунного ответа, низкая молекулярная масса, крайне высокая специфичность и возможность экспрессии непосредственно в клетке [8, 26].
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, гранты 10-04-01434-а и 10-04-00656-а, а также по контрактам с Минобрнауки 14.740.11.0121 и 14.740.11.0171.
Авторы выражают благодарность Б.О. Глотову и А.В. Макаровой (оба из Института молекулярной генетики РАН) за ценные советы при выполнении работы.
Сведения об авторах:
Институт молекулярной генетики РАН Лахин А.В. - аспирант, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2; e-mail: lahin9@mail.ru
Ефремова А.С. - мл. науч. сотр. Макарова И.В. - науч. сотр.
Шрам С.И. - заведующий сектором нейрофармако-логии.
Тарантул В.З. - профессор, заведующий отделом вирусной и клеточной молекулярной генетики.
Генинг Л.В. - стар. науч. сотр., заведующий сектором развития методов молекулярной генетики.
Офтальмологическая клиническая больница Департамента здравоохранения Москвы
Гришина Е.Е. - профессор, главный врач.
ЛИТЕРАТУРА
1. Генинг Л. В., Гришина Е. Е., Петроченков А. Н., Тарантул В. З. Генетика. 2006; 42: 98-103.
2. Казаков А. А., Гришина Е. Е., Тарантул В. З., Генинг Л. В. Биохимия. 2010; 75: 1031-39.
3. Ash, D. E, Schramm V. L. J. Biol. Chem. 1982; 257: 9261-4.
4. Bavoux C., Leopoldino A. M., Bergoglio V. et al. Cancer Res. 2005; 65: P. 325-30.
5 Bergoglio V., PillaireM. J., Lacroix-TrikiM. et al. Cancer Res. 2002; 62: 3511-14.
6. Blanca G., Shevelev I., Ramadan K. et al. Biochemistry. 2003; 42: 7467-7476.
7. Canitrot Y., Cazaux C., FréchetM. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95: 12586-90.
8. CerchiaL., deFranciscis V. Trends Biotechnol. 2010; 28: 517-25.
9. ConradR. C., Giver L., Tian Y., Ellington A. D. Methods Enzymol. 1996; 267: 336-67.
10. Domínguez O., Ruiz J. F., Lain de Lera T. et al. EMBO J. 2000; 19: 1731-42.
11. FrankE. G., Woodgate R. J. Biol. Chem. 2007; 282: 24689-96.
12. GoodmanM. F. Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 17-50.
13. Haracska L., Acharya N., Unk I. et al. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: 1183-90.
14. HerlingA., KönigM., BulikS., HolzhütterH. G. FEBS J. 2011; 278: 2436-59.
15. Kannouche P., Fernández deHenestrosaA. R., CoullB. et al. EMBO J. 2003; 22: 1223-33.
16. Kazakov A. A., Makarova A. V., Grishina E. E. et al. Curr. Top. in Biochem. Res. 2010; 12: 39-49.
17. Kunkel T. A., Pavlov Y. I., BebenekK. DNA Repair (Amst). 2003; 2: P. 135-49.
18. Lakhin A. V., Kazakov A. A., Makarova A. V. et al. Nucl. Acids Ther. 2012; 22: 49-57.
19. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., Kornberg A. J. Biol. Chem. 1958; 233: 163-70.
20. Lehmann A. R., Niimi A., Ogi T. et al. DNA Repair (Amst.). 2007; 6: 891-99.
21. Loeb L. A., Kunkel T. A. Annu. Rev. Biochem. 1982; 51: 429-57.
22. Loeb L. A., Springgate C. F., BattulaN. Cancer Res. 1974; 34: 2311-21.
23. Makarova A. V., Grabow C., Gening L. V. et al. PLoS One. 2011; 6: e16612.
24. MarraM., Sordelli I. M. Lombardi A. et al. J. Transl. Med. 2011; 9: 171.
25. McCulloch S. D., Kunkel T. A. Cell Res. 2008; 18: 148-61.
26. Missailidis S., Hardy A. Expert Opin. Ther. Pat. 2009; 19: 1073-82.
27. Muñoz-Pinedo C., ElMjiyadN., Ricci J. E. Cell. Death Dis. 2012; 3: e248.
28. Ohashi E., Murakumo Y., Kanjo N. et al. Genes Cells. 2004; 9: 523-31.
29. O-Wang J., KawamuraK., Tada Y. et al. Cancer Res. 2001; 61: 5366-69.
30. Petta T. B., Nakajima S., ZlatanouA. et al. EMBO J. 2008; 27: 2883-95.
31. Prakash S., Johnson R. E., Prakash L. Annu. Rev. Biochem. 2005; 74: 317-53.
32. Sirover M. A., Loeb L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976; 70: 812-17.
33. Smeyers-Verbeke J., May C., DrochmansP., MassartD. L. Anal. Biochem. 1977; 83: 746-53.
34. SrivastavaD. K., HusainI., Arteaga C. L., Wilson S. H. Carcinogenesis. - 1999; 20: 1049-54.
35. Tissier A., McDonald J. P., Frank E. G., Woodgate R. Genes Dev. 2000; 14: 1642-50.
36. Wang T. S, EichlerD. C, Korn D. Biochemistry. 1977; 16: 4927-34.
37. Zhang Y, Yuan F., Wu X., Wang Z. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 7099-10.
nocTymna 05.09.12
EFFECT OF MN(II) ON THE ERROR-PRONE DNA POLYMERASE IOTA ACTIVITY IN EXTRACTS FROM HUMAN NORMAL AND TUMOR CELLS
A. V. Lakhin1, A. S. Efremova1,I. V. Makarova1, E. E. Grishina2, S. I. Shram1, V. Z. Tarantul1, and L. V. Gening1
1 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; 2 Ophthalmological Clinical Hospital, Moscow Department of Health, Moscow, Russia
The DNA polymerase iota (Pol i), which has some peculiar features and is characterized by an extremely error-prone DNA synthesis, belongs to the group of enzymes preferentially activated by Mn2+ instead of Mg2+. In this work, the effect of Mn2+ on DNA synthesis in cell extracts from a) normal human and murine tissues, b) human tumor (uveal melanoma), and c) cultured human tumor cell lines SKOV-3 and HL-60 was tested. Each group displayed characteristic features of Mn-dependent DNA synthesis. The changes in the Mn-dependent DNA synthesis caused by malignant transformation of normal tissues are described. It was also shown that the error-prone DNA synthesis catalyzed by Pol i in extracts of all cell types was efficiently suppressed by an RNA aptamer (IKL5) against Pol i obtained in our work earlier. The obtained results suggest that IKL5 might be used to suppress the enhanced activity of Pol i in tumor cells.
Key words: DNA polymerase iota, melanoma, aptamer, mutagenesis
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.831-005-036.11-054]:577.21.08
Т. В. Тупицына1*, Е. А. Бондаренко1, С. А. Кравченко3, П. Ф. Татарский3, И. М. Шетова2, Н. А. Шамалов2, С. М. Кузнецова4, Д. В. Шульженко4, В. И. Скворцова5, П. А. Сломинский1,
Л. А. Лившиц3, С. А. Лимборская1
сравнительный анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и ACE с риском развития инсульта в русской и украинской
популяциях
1ФГБУ науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва; 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, кафедра фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии, Москва; 3Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев; 4Государственное учреждение Институт геронтологии им. Д. Ф. Чеботарёва НАМН Украины, Киев; 5Министерство здравоохранения Российской Федерации, Москва
Проведен сравнительный анализ ассоциаций между G20210A полиморфизмом гена F2, G1691A полиморфизмом гена F5, -5Т/С полиморфизмом гена GP1BA, инсерционно-делеционным (I/D) полиморфизмом гена ACE и риском развития инсульта в двух этнических выборках - русской и украинской популяциях. Показано, что в русской популяции у лиц с генотипом DD риск развития ишемического инсульта повышен (ОШ = 1,4, 95% ДИ [1,05; 1.78], р = 0,02), в то время как генотипы I/I и I/D ассоциированы с пониженным риском развития ишемического инсульта (ОШ = 0,7, 95% ДИ [0.56; 0,95], р = 0,02). В украинской этнической выборке различия в распределении частот генотипов и аллелей между больными с инсультом и лицами контрольной группы по данному полиморфному локусу не являются статистически достоверными и I/D полиморфизм гена ACE не ассоциирован с риском развития инсульта в украинской популяции (ОШ = 0,8, 95% ДИ [0,48; 1,32], р = 0,45). G20210A полиморфизм гена F2, G1691A полиморфизм гена F5, -5Т/С полиморфизм гена GP1BA не ассоциированы с риском инсульта в обеих этнических выборках.
Инсульт - сложное заболевание, характеризующееся множеством этиологических факторов, вовлеченных в его патогенез, и разнообразием клинических проявлений. Сочетание генетических и средовых
факторов определяет развитие той или иной формы инсульта, влияет на клиническую картину заболевания, его течение, тяжесть и исход. Ежегодно в России переносят инсульт более 450 тыс. человек, в мире эта цифра приближается к 6 млн, и в структуре общей смертности инсульт занимает второе место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии [1].
Одним из основных пусковых факторов в каскаде патогенетических реакций, приводящих к развитию инсульта, является эндотелиальная дисфункция. Ее важнейшая причина - хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, одним из главных компонентов которой является ангиотен-зинпревращающий фермент (ACE). В 16-м интро-не гена ACE был идентифицирован инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм, который заключается в наличии (аллель I) или отсутствии (аллель D) A/u-повтора [29]. Были охарактеризованы распределения частот генотипов и аллелей по этому полиморфному участку гена ACE в популяциях разных народов. Обнаружены межпопуляционные различия в распределении частот генотипов и аллелей по I/D полиморфизму гена ACE [6, 12, 14, 19].
Известно, что конечным этапом патогенеза атеросклероза при развитии цереброваскулярных заболеваний является формирование тромба. К тромбозу раз-
