CC BY
127
УДК 579.24, 579.222
ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ И ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ LACTOBACILLUS A CIDOPHIL US Д№75
UDC 579.24, 579.222
THE EFFECT OF PROBIOTIC AND PATHOGENIC BACTERIA METABOLITES ON ANTAGONISTIC ACTIVITY OF
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS D№ 75
Вахитов Тимур Яшэрович
Д.6.И
Вербицкая Наталья Борисовна к.б.н.
Добролеж Ольга Васильевна
Vakhitov Timur Yasherovich Dr. Sei.Biol.
Verbitskaya Natalya Borisovna Cand.Biol. Sei.
Dobrolezh Olga Vasilievna
Полевая Елена Валерьевна к.ф.н.
Polevaya Elena Valeryevna Cand.Pharm. Sei.
Кобатов Алексей Иванович к.т.н.
Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, Россия, 197110, Санкт-Петербург, ул.Пудожская, д. 7 nata_verb@yahoo. сот
Исследовано влияние композиций бактериальных метаболитов Aktoflor и Patogen на антагонистическую активность L. acidophilus Д№75. Показано, что обе композиции метаболитов стимулируют интегральную антагонистическую активность (АА) штамма за счет индукции синтеза бактериоцина и снижения в популяции доли низкоактивных клонов. Показано преимущество метаболитов пробиотических бактерий Aktoflor. Результаты исследования могут быть использованы для повышения пробиотического потенциала бактериальных препаратов
Ключевые слова: АНТАГОНИЗМ, ФАКТОРЫ АНТАГОНИЗМА, МЕТАБОЛИТЫ ПРОБИОТИЧЕСКИХ И ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, БАКТЕРИОЦИНЫ, ИНДУКЦИЯ
Kobatov Aleksey Ivanovich Cand.Tech. Sci.
State research institute of pure biopreparations, Saint-Petersburg, Russia
In the article we investigated the effect of the bacterial metabolites compositions (Aktoflor and Patogen) on antagonistic activity of L. acidophilus D № 75. It was shown the both compositions stimulate integrated antagonistic activity of L.acidophilus D № 75 by inducing the synthesis of the bacteriocin and decreasing the proportion of low active clones in the population. We have also shown the advantage of probiotic bacteria metabolites (Aktoflor). The results can be used to enhance the probiotic potential of the bacterial preparations
Keywords: ANTAGONISM, ANTAGONISM FACTORS, PROBIOTIC AND PATOGENEC BACTERIA METABOEITES, BACTERIOCINES, INDUCTION
Антагонистические свойства бактерий являются одним из механизмов формирования и функционирования микробиоценозов [1]. В большинстве случаев антагонистическое действие бактерий опосредовано образованием специфических продуктов обмена (токсинов, антибиотиков, литических ферментов, бактериоцинов), которые могут синтезироваться как в монокультурах, так и в присутствии гетер о логичных клеточных популяций. При этом при совместном культивировании антагонистическая активность выявляется чаще и с большей выраженностью [2]. Стимуляция синтеза бактериоцинов у лактобацилл в
присутствии неродственных бактерий или, в ряде случаев, их метаболитов впервые была обнаружена в 1989 г. [3]. Авторы показали, что биосинтез бактериоцина рейтерина у L. reuteri 1063 стимулировался при прямом взаимодействии продуцента с бактериями, относящимися к разным группам (p. Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus). Индукция биосинтеза рейтерина в присутствии клеток Е. coli наблюдалась начиная с соотношения Е. coli/L. reuteri 0,5-1,0, а ее эффективность возрастала при увеличении концентрации культуры-индуктора (Е. coli). При определенных условиях наблюдали 5-кратное увеличение синтеза бактериоцина. L. plantarum NC8 также синтезировал бактериоцин только в присутствии культуры-индуктора (фильтраты культуральных сред культур-индукторов и диализное культивирование этих культур с антагонистом данного эффекта не обеспечивали). Всего в качестве индукторов было исследовано 82 штамма, из них 41 проявляли активность. Минимальное количество индуцирующих клеток составило 104, а максимальный эффект наблюдался при 106 клеток с дальнейшим насыщением и независимо от природы культуры-индуктора
[4].
В наших экспериментах, однако, на примере симбиотической культуры L. acidophilus «Витафлор» была обнаружена стимуляция синтеза бактериоцина фильтратами культуральной среды Е. coli М-17 (Актофлор) и синтетической композицией выделенных из нее низкомолекулярных метаболитов (Актофлор-С). Коэффициент стимуляции антагонизма лактобацилл к Е. coli М-17 зависел от концентрации, состава, соотношения и стереоизомерных форм метаболитов и варьировался от 1,5 до 7,9 [5].
Проявление антагонистической активности у бактерий зависит от ряда факторов, среди которых, прежде всего, следует назвать разнообразие видов антагониста и жертвы в конкретных условиях внешней среды [6]. В работах А.В. Семенова, исследовавшего влияние фильтратов культуральных сред гетерологичных популяций, было показано, что в зависимости от видовых
особенностей участников взаимодействий активность штамма-антагониста может оставаться на базальном уровне, повышаться или понижаться. Кроме того, возможен вариант инверсии - стимуляция антагонистом роста чувствительной культуры [7-9]. Так, фильтраты культуральной среды С. albicans стимулировали антагонизм S. aureus к L. acidophilus, L. casei и S. hominis, а фильтраты Е. agglomerans ингибировали антагонизм S. aureus к S. hominis, инвертировали к L. acidophilus и обладали индифферентным эффектом к L. casei [8]. Результаты исследований позволили автору сформулировать критерии отбора штаммов для создания биопрепаратов, состоящих из антагониста и его стимулятора. На основе взаимной стимуляции антагонизма предложена новая комбинация бактерий из известных пробиотиков (Е. coli М-17 и Е. faecium), превосходящая по антагонистической активности монопрепараты [7]. Вместе с тем, недостатком полиштаммовых пробиотиков может быть их поливариантное терапевтическое действие [10]. Для стандартизации терапевтического действия бактериальных пробиотиков предпочтительнее регулировать их антагонистическую активность комплексами метаболитов определенного состава.
Целью работы являлось исследование влияния стандартизованных комплексов метаболитов гетерологичных бактерий на АА штамма L. acidophilus Д№75, являющегося производственным штаммом препарата Витафлор-форте [10], в экспериментах in vitro.
Материалы и методы
Культуры бактерий. Объектами исследования являлись производственный штамм препарата Витафлор-форте Lactobacillus acidophilus Д№75 и условно-патогенные тест-культуры (Escherichia coli 075, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Все культуры хранили в сублимированном виде.
Питательные среды. В работе использовали жидкую, полужидкую и плотную питательные среды семейства МРС (Манна-Рогозы-Шарпа) следующего состава,
Научный журнал КубГАУ, №92(08), 2013 года г/л:
Среда МРС-1 (жидкая): панкреатический гидролизат казеина (Serva) - 10,0; дрожжевой экстракт (BBL) - 8,0; peptonized milk (Himedia) - 47,0; глюкоза -20,0; L-цистина гидрохлорид - 0,1; К2НРО4 - 2,0; Mg2SÛ4 - 0,2; M11SO4 - 0,02; tween-80 -1,0 мл. pH после стерилизации - 6,75.
Среды МРС-2 (полужидкая) и МРС-5 (плотная) отличаются от среды МРС-1 наличием агара (4,0 и 18,0 г/л) соответственно.
Standart Nutrient Agar (Serva, США) готовили из коммерческой сухой среды в соответствии с инструкцией.
Все среды стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 0,5 атм. в течение 15 мин.
Комплекс метаболитов пробиотических бактерий (Aktoflor, включающий основные компоненты препарата Актофлор®-С), г/100 мл : метионин - 0,34; формиат натрия - 1,55; янтарная кислота - 1,62; натрия ацетат - 11,61; вода очищенная - до 100 мл.
Комплекс метаболитов патогенных бактерий (Patogen), г/100 мл: аланин -
0,17; серии - 0,21; метионин - 0,28; цистеин - 0,23; глицин - 0,15; натрия ацетат -7,70; натрия формиат - 0,51; натрия лактат - 1,68; вода очищенная - до 100 мл.
В предварительных экспериментах было показано, что метаболиты в заданных концентрациях не оказывали влияния на рост тест-культур на твердых и жидких средах.
Условия культивирования штамма Д75 в среде МРС-1 с комплексами Aktoflor и Patogen.
1) Выращивание штамма при высокой плотности засева (1 х 107 КОЕ/мл).
Штамм засевали в среду МРС-1 с 1 мг/мл соответствующего комплекса метаболитов. Выращивание проводили в плоскодонных полистироловых
96-ячеечных планшетах при 37°С. Динамику роста лактобацилл оценивали по величине оптической плотности на фотометре для микроплат BioTek ELx800™ на длине волны 630 нм. Контролем служил рост штамма в среде без добавок метаболитов.
2) Выращивание штамма при низкой плотности засева (не более 10 КОЕ/мл).
Штамм Д75 засевали в среду МРС-1 с 1 мг/мл соответствующего комплекса метаболитов. Динамику роста лактобацилл оценивали по количеству жизнеспособных клеток, определяемому высевом в полужидкую среду МРС-2. Контролем служил рост штаммов в среде без добавок метаболитов.
Получение фильтратов культуральной среды штамма Д№75. Штамм выращивали в среде МРС-1 и в МРС-1 с 1 мг/мл исследуемых метаболитов (37°С, 24 часа, плотность засева 1x107 КОЕ/мл); клетки осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин при 4°С). В полученных супернатантах устанавливали значение pH 5,8 подтитровкой растворами NaOH, после чего фильтровали через мембраны «Millipore» с диаметром пор 45 мкм. Были получены следующие варианты фильтратов:
Фильтрат 1 - фильтрат штамма Д№75, выращенного в среде МРС-1 без добавок метаболитов;
Фильтрат 2 - фильтрат штамма Д№75, выращенного в среде МРС-1 с добавкой соответствующего комплекса метаболитов в начале культивирования;
Фильтрат 3 - фильтрат штамма Д№75, выращенного в среде МРС-1 с добавкой соответствующего комплекса метаболита на 8-ом часу культивирования (начало стационарной фазы).
Определение антагонистической активности штамма Д№75. АА определяли in vitro с использованием диффузионных методов и методов тестирования в жидких средах.
1) Метод перпендикулярных штрихов.
В среду МРС-5 вводили добавки комплексов Aktoflor и Patogen в разных концентрациях и разливали в чашки Петри (20 мл). В контрольные чашки в
эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду. После высыхания чашек на них по диаметру высевали штамм Д№75 штрихом бактериологической петлей диаметром (3,5±0,5) мм. Посевы инкубировали при 37°С. На 1-4 сутки производили подсев тест-культур петлей диаметром (1,75+0,25) мм штрихом в направлении от зоны роста исследуемого штамма, не касаясь ее и перпендикулярно ей. Посевы инкубировали при 37°С. Результаты учитывали через 1 сутки по величине зоны ингибирования роста тест-культур. Размер зоны ингибирования (R) принимали за радиус эквивалентной площади ингибирования (S), S=n R2. Индексы стимуляции АА рассчитывали путем деления площади ингибирования роста тест-культур на среде с добавками комплексов на соответствующую площадь на среде без добавок метаболитов. Средний индекс стимуляции определяли для 3-х тест-культур, подсеянных после 1 суток выращивания штриха Д№75 на одну чашку.
2) Определение АА отдельных клонов штамма Д№75 методом трехслойного агара.
В нижний слой среды МРС-5 (15 мл) вводили 1,0 мг/мл комплекса Aktoflor. На его поверхность высевали 5-15 клеток штамма Д№75, заливали 5 мл среды МРС-5 и инкубировали посевы 2 суток при 37°С. В 5 мл расплавленной и охлажденной до 42°С среды Standart Nutrient Agar вносили 106 КОЕ S. aureus и распределяли ее по поверхности второго слоя агара МРС-5. Посевы инкубировали 24 часа при 37°С, после чего измеряли радиус и рассчитывали площади зон подавления роста S. aureus отдельными колониями штамма Д№75. Контролем служили чашки, в нижний слой которых не вносили метаболиты пробиотических бактерий.
3) Выращивание тест-штаммов S. aureus АТСС 25923, P.aeruginosa АТСС 27853 в фильтратах культуральной среды штамма Д№75.
Выращивание тест-штаммов проводили при 37°С в плоскодонных полистироловых 96-ячеечных планшетах. Исходный засев составлял (5-6)х107 КОЕ/мл. Контролем служил рост тест-штаммов в среде МРС-1 при pH 5,8.
4) Определение скорости гибели S. aureus в фильтратах 1 и 2 без коррекции pH.
Фильтраты 1 и 2 получали, как описано выше, но без предварительной коррекции pH. Конечные значения pH фильтратов составляли 3,84- 3,91. В фильтраты вносили 18-часовую культуру S. aureus до конечной плотности 103 КОЕ/мл и инкубировали при 37°С в течение 4-х часов. Титр жизнеспособных клеток S. aureus определяли на Standart Nutrient Agar. Индексы ускорения гибели S. aureus рассчитывали путем деления титра S. aureus в культуре без добавок комплексов на соответствующий титр в культуре с добавками комплексов.
Определение содержания молочной кислоты. Процентное содержание DL-молочной кислоты определяли по значению титруемой кислотности (°Т) образцов, так как штамм Д№75 является гомоферментативным [11].
Результаты и обсуждение
В предварительных экспериментах методом трехслойного агара было показано, что АА штамма Д№75 стимулируется отдельными колониями S. aureus АТСС 25923 при отсутствии прямого контакта между культурами. АА штамма Д№75 достоверно возрастала при величине «нагрузки» равной всего 25 колониям S. aureus АТСС 25923 на 1 чашку (индекс стимуляции АА был равен 1,14). По мере увеличения «нагрузки» до тысячи колоний индекс стимуляции возрастал до значения 5,72. Это согласуется с данными литературы о влиянии метаболического пула гетерологичных бактерий на уровень АА лактобацилл.
Состав пула метаболитов ряда гетерологичных бактерий был нами подробно изучен и на основании полученных данных были составлены модельные комплексы метаболитов пробиотических (Aktoflor) и патогенных (Patogen) штаммов [12-14]. В настоящей работе эти комплексы были использованы для изучения механизмов гетерологической индукции антагонистической активности. АА определяли in vitro с использованием диффузионных методов (метод перпендикулярных штрихов, метод трехслойного агара) и методов тестирования в жидких средах (выращивание и инкубация тест-штаммов в фильтратах культуральной среды штамма Д№75).
Влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на АА
штамма Д№75 на плотной среде. Метод перпендикулярных штрихов было показано, что на среде МРС-5 штамм Д№75 проявлял выраженный антагонизм ко всем тест-культурам (табл. 1).
Таблица 1 - Средняя площадь зоны задержки роста тест-культур, см2
Время выращивания штриха штамма Д№75, сутки Средняя площадь зоны задержки роста тест-культур, см2
E.coli 075 S. aureus P. aeruginosa
1 3,14 6,15 0,64
2 12,56 28,26 3,80
3 21,23 >38,47 4,52
4 >38,47 >38,47 4,52
Уровень АА штамма Д№75 возрастал с увеличением продолжительности его выращивания. Чувствительность тест-культур возрастала в ряду: P. aeruginosa АТСС 27853 > E.coli 075 >S. aureus ATСС 25923. Селекции устойчивых клонов не отмечалось, что свидетельствовало о бактерицидном действии антагониста на все тест-культуры. Добавки метаболитов стимулировали АА на всех сроках выращивания штамма Д№75 (таблицы 2 и 3).
Таблица 2 - Зависимость индекса стимуляции АА штамма Д№75 от концентрации
комплекса Aktoflor
Концентрация комплекса Aktoflor, мг/мл агара Индекс стимуляции АА на разных сроках выращивания штамма Д№75
E.coli 075 S. aureus P. aeruginosa АТСС 25923 АТСС 27853
Сутки
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0 1 1 1 - 1 1,00 - - 1 1 1 1
0,25 1 1,69 1,16 - 1,15 >1,36 - - 1,23 1,19 1,17 1
0,5 1 1,82 >1,81 - 1,65 >1,36 - - 1,77 1,19 1,17 1,36
1,0 1,69 >3,06 >1,81 - 2,25 >1,36 - - 1,77 1,19 1,36 1,46
2,0 4,41 >3,06 >1,81 - >6,26 >1,36 - - 3,97 1,40 1,56 1,78
Комплекс Ак1;ойог повышал индекс стимуляции АА в 4-6 раз, комплекс Ра1х^еп - не более, чем в 2,4 раза. АИойог значимо повышал средний индекс стимуляции АА при концентрации 0,25 мг/мл, Ра1х^еп - при 0,5 мг/мл.
Таблица 3 - Зависимость индекса стимуляции АА штамма Д№75 от концентрации комплекса Ра1^еп
Концентрация комплекса Patogen, мг/мл агара Индекс стимуляции АА на разных сроках выращивания штамма Д№75
E.coli 075 S. aureus АТСС 25923 P. aeruginosa АТСС 27853
Сутки
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
0 1 1 1 - 1 1 - - 1 1 1 1
0,25 1 1 1 - 1 1 - - 1 1 1 1
0,5 1,21 1,28 1,33 - 1Д5 1 - - 1,23 1 1 1
1,0 1,69 1,56 1,42 - 1,31 1 - - 2,41 1Д7 1 1
2,0 1,96 2,25 1,81 - 1,65 >1,36 - - 2,41 1Д9 1Д7 1,27
При внесении комплекса Patogen в концентрациях 1-2 мг/мл наблюдалось насыщение среднего индекса стимуляции. При внесении комплекса Aktoflor в максимально исследованной концентрации (2 мг/мл) признаки насыщения среднего индекса стимуляции отсутствовали (рис. 1).
Концентрация метаболитов іігіил
Рисунок 1 - Зависимость среднего индекса стимуляции АА штамма Д№75 от концентрации комплексов Aktoflor и Patogen (время выращивания штамма Д№75 - 1 сутки)
Поскольку метод перпендикулярных штрихов дает представление только об уровне интегральной АА бактериальной популяции, в дальнейшей работе было исследовано влияние комплексов на АА отдельных клонов.
Влияние комплекса Aktoflor на уровень АА отдельных клонов штамма Д№75. Было установлено, что популяция штамма Д№75 является гетерогенной по уровню АА к S.aureus. У 28% низкоактивных клонов площадь задержки роста S.aureus варьировалась от 0,03 см2 до 2,11 см2, а у 72% активных клонов от 5,72 см2 до 9,28 см2. Средняя площадь задержки роста S.aureus единичной колонией всей популяции штамма Д№75 составляла 5,31 см2, причем у низкоактивных клонов она составляла 0,64 см2, а у активных клонов - 7,37 см2. При добавке комплекса Aktoflor средняя площадь задержки роста S. aureus единичной колонией всей популяции возрастала до 16,61 см2, а клоны с низким уровнем АА практически отсутствовали.
Таким образом, эксперименты на плотной среде показали, что исследуемые комплексы стимулировали интегральную АА. Кроме того комплекс Aktoflor снижал степень гетерогенности популяции штамма Д№75 по данному признаку. В
дальнейших экспериментах исследовали влияние комплексов метаболитов на факторы неспецифической и специфической АА (кислотность, выход молочной кислоты, скорость роста, продукцию бактериоцина) в жидкой среде МРС-1.
Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на динамику pH и продукцию молочной кислоты в жидкой среде. Штамм Д№75 является сильным кислотообразователем, о чем свидетельствует снижение pH среды на 2 ед. в процессе культивирования за счет образования молочной кислоты. Добавка комплексов метаболитов не оказывала влияния на динамику кислотности и накопление молочной кислоты (таблица 4).
Таблица 4 - Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на динамику pH и выход молочной кислоты в процессе роста штамма в среде МРС-1 (исходный засев - 1 х107 КОЕ/мл, концентрация комплексов - 1,0 мг/мл, исходное значение pH - 6,75)
Штамм Добавка Время роста, часы
4 8 24
pH Контроль 5,80 4,45 3,84
Aktoflor 5,75 4,50 3,88
Patogen 5,73 4,47 3,91
Молочная кислота, % Контроль 0,90 1,19 1,78
Aktoflor 0,92 1,15 1,71
Patogen 0,92 1,17 1,67
Влияние комплексов Ак1оЯог и Ра1^еп на рост штамма Д№75 в жидкой среде. При высокой плотности засева (107 КОЕ/мл) добавки комплексов не оказывали влияния на динамику роста и выход биомассы, а при низкой плотности засева (не более 10 КОЕ/мл) ускоряли рост штамма. Первое удвоение числа клеток в среде с добавкой происходило при этом через 8 часов, а в контроле - только через 11 часов (табл. 5). Таким образом, комплексы метаболитов ускоряли переход лактобацилл в активное репродуктивное состояние.
Таблица 5 - Влияние комплексов АЙоАог и Patogen на рост штамма Д№75 в среде
Научный журнал КубГАУ, №92(08), 2013 года МРС-1 при низкой плотности засева (5 КОЕ/мл)
Время роста, час КОЕ/мл
Контроль Aktoflor Patogen
0 4 4 4
4 4 3 6
5 5 6 4
6 6 6 2
7 5 5 7
8 5 10 11
9 4 19 21
10 6 45 37
11 14 81 64
12 31 >100 >100
Влияние комплексов метаболитов на бактериоциногенную активность штамма Д№75 в среде МРС-1 оценивали по динамике роста и скорости гибели S. aureus АТСС 25923 в фильтратах культуральных сред антагониста.
Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на бактериоциногенную активность штамма Д№75. Ранее методами гель-хроматографии и ионообменной хроматографии было установлено, что при выращивании в среде МРС-1 штамм Д№75 синтезирует бактериоцин класса 2 подкласса 2а с молекулярной массой порядка 6 кДа. Его биосинтез являлся конститутивным и не зависел от наличия в среде гетерологичных бактериальных популяций. Активность бактериоцина зависела от pH - практически отсутствовала при pH 6,75 и достигала максимума в диапазоне pH 5,0-5,9 [5].
Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на бактериоциногенную активность штамма исследовали при значениях pH 5,8, поскольку более низкие значения pH (< 5,5) существенно ингибировали рост тест-культур. На рисунке 2 показано влияние pH на рост тест-культур в среде МРС-1 на примере S.aureus АТСС 25923.
Время купыиаироннния, часы
Рисунок 2 - Зависимость роста S.aureus АТСС 25923 в среде МРС-1 при различных значениях pH
На рисунках 3 а) и б) видно, что при pH 5,8 фильтрат культуральной среды штамма Д№75, выращенного без добавок комплексов метаболитов (фильтрат 1), подавлял рост S. aureus. Добавки комплексов на разных стадиях роста штамма Д-75 (фильтраты 2 и 3) не оказывали существенного влияния на его бактериоциногенную активность.
Аналогичные результаты получены при изучении комплексов на бактериоциногенную активность штамма Д№75 к Р.aeruginosa (рис. 3 в, г).
s у
■Iff*
¡D 9
1.5
а.
&
Время культнвіфовяння, часы
Вреыя ^іьтнвнркдшя, ЧЙЕЫ
2,5 -I
1,5 ■
Вреш і^льтиичюеання, чявії
—ф Контроль
— *■ -Фнлхтрят 2
Т------1----1-----г
1 2 3 4 5 S
Время флывюиронянмн, ЧІШ
- -Фильтрат 1
— *— ФнльтрктЭ
Рисунок 3 - Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на бактериоциногенную активность штамма Д№75 к S. aureus (а) и (б) соответственно, к P. aeruginosa (в) и (г) соответственно.
Значение индекса стимуляции бактериоциногенной активности во всех экспериментах не превышало 1,35. Более того, при росте P.aeruginosa в фильтрате 3 с комплексом Patogen было отмечено снижение бактериоциногенной активности.
Таким образом, в жидкой среде МРС-1 комплексы Aktoflor и Patogen не оказывали влияния на такие факторы интегральной АА штамма Д№75 как скорость роста и выход биомассы при высокой плотности засева, продукцию молочной кислоты и активность конститутивно синтезируемого бактериоцина. Эти результаты не согласуются с приводившимися выше данными о значительной (в 2-5 раз) стимуляции АА метаболитами в экспериментах на плотной среде МРС-5. Можно предположить поэтому, что комплексы метаболитов индуцируют синтез еще одного бактериоцина или другой субстанции, активность которых проявляется только при значениях pH ниже 5,8 и/или при непосредственном взаимодействии антагониста с тест-штаммами. Для проверки данного предположения исследовали влияние комплексов метаболитов на наличие факторов антагонизма штамма Д№75 в средах при низких значениях pH. Поскольку тест-культуры при этих pH практически не растут, активность бактериоцинов оценивали по скорости гибели S. aureus в фильтратах культуральных сред.
Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на скорость гибели S. aureus АТСС 25923 в фильтратах культуральных сред штамма Д№75 при низких значениях pH (3,84-3,91). Из рисунка 4 следует, что в данных условиях эксперимента гибель клеток S. aureus в контрольном и опытных фильтратах происходила с разной скоростью.
Продолжи le/ь ноет ь инкубации, мин
Рисунок 4 - Влияние комплексов Aktoflor и Patogen на скорость гибели S. aureus в фильтратах штамма Д№75 (pH 3,84-3,91)
Внесение комплексов в среду выращивания штамма Д№75 приводило к ускорению гибели S. aureus. Индексы ускорения гибели в зависимости от продолжительности инкубации варьировались от 1,9 до 9 (табл. 6).
Таблица 6 - Индексы ускорения гибели S. aureus в фильтратах культуральных сред штамма Д№75 с комплексами Aktoflor и Patogen
Комплекс метаболитов pH фильтрата Продолжительность инкубации S. aureus
20 мин. 40 мин. 1 час 2 часа 4 часа
Aktoflor 3,88 1Д 1,9 7,7 9 Полная гибель
Полная
Patogen 3,91 1,0 1,0 3,0 2,9 гибель
При этом значения индексов ускорения гибели S. aureus комплексом Aktoflor в 2 и более раз превышали значения соответствующих индексов комплекса Patogen. Таким образом, результаты этих опытов подтвердили, что в средах штамма Д№75, выращенного с добавками метаболитов, присутствуют некие дополнительные факторы антагонизма, проявляющие свою активность только при низких значениях pH.
Заключение
Исследование показало, что модельные комплексы метаболитов пробиотических (Aktoflor) и патогенных бактерий (Patogen) повышали интегральную антагонистическую активность штамма Д№75 к тест-штаммам в 2-5 раз, независимо от степени чувствительности тест-штаммов к антагонисту (высокой к S.aureus АТСС 25923, промежуточной к E.coli 075 или низкой к Р.aeruginosa АТСС 27853). Индекс стимуляции интегральной АА зависел от вида и концентрации комплексов метаболитов. Показано преимущество комплекса Aktoflor, который значимо повышал средний индекс стимуляции АА при меньших концентрациях и с большей эффективностью по сравнению с комплексом Patogen.
Оба комплекса метаболитов повышали скорость перехода лактобацилл в активное состояние при низкой (не более 10 КОЕ/мл) плотности засева. Кроме того комплекс Aktoflor снижал гетерогенность популяции по уровню АА.
Комплексы метаболитов не оказывали влияния на такие факторы неспецифического антагонизма как продукция молочной кислоты, скорость роста и выход биомассы при высокой (107 КОЕ/мл) плотности засева и не увеличивали специфическую активность конститутивно синтезируемого бактериоцина с оптимумом действия при pH 5,0-5,9.
Вместе с тем среды, полученные при выращивании штамма Д№75 с добавками
комплексов метаболитов, ускоряли гибель тест-штаммов при низких значениях pH. Значения индексов ускорения гибели S. aureus в фильтратах этих сред были сопоставимы со значениями индексов стимуляции интегральной АА штамма на плотной среде (2-5). Это дает основание предполагать, что метаболиты могут индуцировать синтез второго бактериоцина или другого фактора антагонистической активности, проявляющего активность при более низких значениях pH, чем конститутивно синтезируемый бактериоцин.
Анализ полученных результатов свидетельствует о существовании не менее 3-х различных механизмов стимуляции АА штамма Д№75 комплексами Aktoflor и Patogen:
1. Стимуляция роста лактобацилл при низкой плотности засева.
2. Стимуляция антагонизма клонов с низким уровнем активности.
3. Индукция синтеза неизвестного ранее бактериоцина или другого фактора антагонистической активности, проявляющего активность при низких значениях pH.
Результаты исследования могут быть использованы для повышения пробиотического потенциала бактериальных препаратов.
Работа выполнена по Государственному контракту № 40.003.13.0 от 20 марта 2013 г. «Изучение механизмов действия метаболитных и бактериалъно-метаболитных препаратов методами геномики и метаболомики. Изучение влияния препаратов на индукцию факторов патогенности и антагонистической активности кишечной микрофлоры»
Список литературы
1.Экология микроорганизмов человека: Учеб.пособие / О.В.Бухарин, A.B. Валышев, Ф.Г. Гильмутдинова и др. Екатеринбург: УрО РАН, 2006. 546 с.
2.Егоров НС. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука, 2004. 503 с.
3.Chung Т.C., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microbial ecology in health and disease. 1989. V.2. P. 137-144.
4.Maldonado A., Jimenez-Diaz R., Ruiz-Barba J.L. Induction of plantaricin production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is mediated by an autoinduction mechanism // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 5. P. 1556-1564.
5.Вербицкая A. H. Изучение индукции антагонистической активности Lactobacillus acidophilus. Магистерская диссертация. СПб., 2006. 88 с.
6.Иркитова А.Н, Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli II Биологические науки. 2012. Том 3. Вып. 1. С. 41-44.
7.Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях: Дисс. ... канд. биол. наук. Оренбург, 2009. 135 с.
8.Семенов A.B. Характеристика антагонистической активности Staphylococcus aureus при межмикробных взаимодействиях // Вестник Томского государственного университета. Биология. Биотехнология и микробиология. 2011. № 3 (15). С. 56-66.
9.Семенов A.B. Антагонизм как результат межмикробных взаимодействий // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал). 2013. №1. С. 1-8.
10.Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритмы выбора / JI.H Петров, НБ. Вербицкая, В.П. Добрица, Г.Н Галкин, НЛ. Петров. СПб.: ФГУП Гос. НИИ ОЧБ, 2008. 136 с.
11. Тамим А.И., Робинсон Р.К. Йогурт и другие кисломолочные продукты: научные основы и технологии. СПб: Профессия, 2003.664 с.
12.Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 // Журн. микробиол. 2005. № 1. С. 16-21.
13.Вахитов Т.Я., Петров JI.H Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология. 2006. Т.75. №4. С. 483-488.
14.Полевая Е.В. Разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов: дисс. ... канд. фарм. наук. СПб, 2013. 207 с.
References
1. Jekologija mikroorganizmov cheloveka: Ucheb.posobie / O.V.Buharin, A.V. Valyshev, F.G. Gil'mutdinova i dr. Ekaterinburg: UrO RAN, 2006. 546 s.
2. Egorov N. S. Osnovy uchenija ob antibiotikah. M.: Nauka, 2004. 503 s.
3. Chung T.C., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microbial ecology in health and disease. 1989. V.2. P. 137-144.
4. Maldonado A., Jimenez-Diaz R., Ruiz-Barba J.L. Induction of plantaricin production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is mediated by an autoinduction mechanism // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 5. R. 1556-1564.
5. Verbickaja A. N. Izuchenie indukcii antagonisticheskoj aktivnosti Lactobacillus acidophilus. Magisterskaja dissertacija. SPb., 2006. 88 s.
6. Irkitova A.N., Kagan Ja.R., Sokolova G.G. Antagonistcheskaja aktivnost' molochnyh kul'tur Lactobacillus acidophilus po otnosheniju k test-shtammam Escherichia coli // Biologicheskie nauki. 2012. Tom 3. Vyp. 1. S. 41-44.
7. Semenov A.V. Harakteristika antagonisticheskoj aktivnosti bakterij pri mezhmikrobnyh vzaimodejstvijah: Diss. ... kand. biol. nauk. Orenburg, 2009. 135 s.
8. Semenov A.V. Harakteristika antagonisticheskoj aktivnosti Staphylococcus aureus pri mezhmikrobnyh vzaimodejstvijah // Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologija. Biotehnologija i mikrobiologija. 2011. № 3 (15). S. 56-66.
9. Semenov A.V. Antagonizm kak rezul'tat mezhmikrobnyh vzaimodejstvij // Bjulleten' Orenburgskogo nauchnogo centra UrO RAN (jelektronnyj zhurnal). 2013. №1. S. 1-8.
10. Bakterial'nye probiotiki: biotehnologija, klinika, algoritmy vybora / L.N. Petrov, N.B. Verbickaja, V.P. Dobrica, G.N. Galkin, N.L. Petrov. SPb.: FGUP Gos. N11 OChB, 2008. 136 s.
11. Tamim A.I., Robinson R.K. Jogurt i drugie kislomolochnye produkty: nauchnye osnovy i tehnologii. SPb: Professija, 2003.664 s.
12. Vahitov T.Ja., Momot E.N., Tolparov Ju.N. Dinamika i funkcii jekzometabolitov v processe rosta periodicheskoj kul'tury Escherichia coli M-17 // Zhurn. mikrobiol. 2005. № 1. S. 16-21.
13. Vahitov T.Ja., Petrov L.N. Reguljatomye funkcii jekzometabolitov bakterij // Mikrobiologija. 2006. T.75. №4. S. 483-488.
14. Polevaja E.V. Razrabotka sostava i tehnologii biologicheski aktivnyh kompleksov na osnove bakterial'nyh jekzometabolitov: diss. ... kand. farm. nauk. SPb, 2013. 207 s.
