CC BY
112
А. А. Истомина, Н. В. Довженко, Н. Н. Бельчева, В. П. Челомин
ВЛИЯНИЕ МЕДИ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ СИСТЕМУ БРЮХОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ иттоятл МАШБСИиШСА И ТЕвиЬА яизпсл В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ
Интенсивная хозяйственная деятельность в прибрежной зоне и вдоль рек, впадающих в закрытые заливы, приводит к изменениям гидрохимического режима вод, способствуя таким нежелательным явлениям как эвтрофикация и гипоксия. Эти явления в свою очередь могут приводить к серьезным нарушениям в водных экосистемах [1]. Кроме того, на жизнедеятельность морских организмов влияет присутствие в морской воде различных токсичных веществ, таких как тяжелые металлы, полицикличе-ские ароматические углеводороды, поверхностно-активные вещества, пестициды и др. Среди тяжелых металлов медь отличается высокой токсичностью в отношении живых организмов. С одной стороны, она является физиологически важным элементом и входит в состав ряда белков и ферментов, играя при этом важную роль в метаболизме. С другой стороны, медь может способствовать образованию активных форм кислорода (АФК) в клетках, а также вызывать окисление сульфгидрильных групп ферментов, инактивируя их [2].
В ряде работ показано, что повреждающий эффект некоторых токсичных веществ, в том числе и тяжелых металлов, усиливается на фоне изменений естественных факторов среды. Так, например, выживаемость Mytilus edulis в аноксийных условиях заметно сокращается при аккумуляции Cd в мягких тканях моллюска [3]. Одновременное воздействие гипоксии и аммонийного азота вызывает нарушение лизосомальной целостности гемоцитов у Pema viridis на 70%, что почти в 2 раза больше по сравнению с раздельным действием данных факторов [4]. Вследствие этого при нарастающем поступлении загрязняющих веществ в морскую среду необходимо обращать особое внимание на степень изменения ее естественных факторов, таких как содержание кислорода, соленость, температура и др.
В норме в клетках и тканях аэробных организмов всегда образуются АФК (О2- , Н2О2, ОН и др.). Эти соединения высокореактивны и вызывают окислительное повреждение биологически важных молекул, например, ДНК, белков, липидов. У всех организмов присутствует антиоксидантная система (АО), представленная специфическими ферментами и низкомолекулярными компонентами (антиоксидантами), которая сдерживает разрушительное действие АФК. Разнообразные факторы, например экстремальные абиотические факторы среды, такие как гипоксия [5] или чужеродные химические вещества органической и неорганической природы (поллютанты) усиливают генерацию АФК [3], в результате нарушаются механизмы функционирования биохимических систем, что неизбежно ведет к развитию окислительного стресса.
В данной работе исследовалось влияние гипоксии / аноксии и меди на компоненты антиоксидантной системы у двух видов брюхоногих моллюсков — литторины маньчжурской (Littorina mandschurica) и тегулы простой (Tegula rustica), отличающихся ха-
© А. А. Истомина, Н. В. Довженко, Н. Н. Бельчева, В. П. Челомин, 2011
рактером вертикального распределения. Так, литторина обитает на литорали, поэтому подвержена постоянному ежедневному изменению условий обитания. Тегула обитает на сублиторали и находится в более стабильных условиях.
Для оценки воздействия повреждающих факторов, были выбраны следующие показатели АО системы клетки: активность антиоксидантных ферментов — супероксид-дисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), глутатион-Б-трансферазы (ГБТ) и глутатионредук-тазы (ГР); уровень интегральной антирадикальной активности (ИАА) и содержание низкомолекулярного антиоксиданта — глутатиона (ГБН). О степени развития окислительного стресса в клетках судили по накоплению продукта перекисного окисления липидов (малонового диальдегида — МДА).
Материалы и методы исследования
В работе использовали брюхоногих моллюсков L. mandschurica и T rustica, собранных в сентябре 2008 г. в бассейне Прибойная залива Восток (Японское море). Эксперимент состоял из трех серий опытов: 1-я серия (гипоксия/аноксия) — выдерживание моллюсков на воздухе при комнатной температуре в течение 30 ч; 2-я серия — выдерживание в воде с CuSO4 (25 мкг/л воды) в течение двух недель; 3-я серия — выдерживание в воде с CuSO4 (25 мкг/л воды) в течение двух недель с последующей гипоксией/аноксией 30 ч. После каждой серии эксперимента гепатопанкреас от 10 моллюсков объединяли и проводили определение биохимических показателей в четырех параллельных пробах.
Оценка ИАА антиоксидантов проводилась по их способности ингибировать восстановление радикал-катиона ABTS+ (2, 2'-азинобис (3-этилбензотиазолин 6-сульфонат)
[7]. Активность выражали в единицах тролокса. Активность СОД определяли по способности ингибировать реакцию окисления НАДН, вызванную супероксидным радикалом
[8]. Активность КАТ определяли по способности разлагать перекись водорода [9]. Активность ГР определяли по способности восстанавливать окисленную форму глутатиона с использованием НАДФН в качестве восстановителя [9]. Активность ГБТ определяли по методу, описанному Хабигом и соавторами [10]. Концентрацию восстановленного ГБН определяли спектрофотометрически по реакции тиогруппы цистеина с реактивом Эллмана — дитионитробензойной кислотой [11]. Содержание МДА определяли непосредственно в тканях [12] по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Для определения содержания белка в гомогенатах тканей был использован метод Лоури [13].
Все цифровые данные представляют собой среднее значение для четырех серий экспериментов ± стандартное отклонение (M ± m). Статистическая обработка материалов выполнена с использованием статистических средств приложения MS Office Excel. О достоверности изменений исследуемых параметров судили по различиям средних значений, используя критерий Стьюдента. В расчетах принят 5%-ный уровень значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
Как показал сравнительный анализ уровни исследованных биохимических параметров существенно различались у двух видов брюхоногих моллюсков. При этом наибольшие межвидовые различия наблюдались в конститутивных уровнях активности антиоксидантных ферментов СОД и КАТ (рис. 1, а, б). Так, у L. mandschurica активность этих ферментов была в 1,7 и в 6 раз, соответственно, выше по сравнению с T. rustica. На-
300 г
400 г
200
300
200
100
Ж
2 3
12
и
г
л
§
2
№
о
1600
§ 1200
800
1 400
12 3 4
~^\ Ь. тапскскигіса | Т. гшйса
Рис. 1. Активность (ак) супероксиддисмутазы (а), каталазы (б), глутатионредуктазы (в) и глутатион-Б-траисферазы (г) в тканях гепатопанкреаса моллюсков:
1 — контроль, 2 — выдерживание на воздухе (гипоксия/аноксия); 3 — воздействие меди; 4 — воздействие меди с последующей гипоксией/аноксией. * — достоверные различия относительно контроля (п = 4, р < 0,05).
против, в гепатопанкреасе тегулы активность ГР была в 2,1 раза выше, чем у литтори-ны, тогда как активность ГБТ статистически не отличалась между видами (рис. 1, в, г).
При этом следует особо отметить, что по уровню ИАА, характеризующего анти-радикальную активность низкомолекулярных компонентов клетки, и содержанию основного низкомолекулярного антиоксиданта — ГБН, оба вида практически не различались (рис. 2, а, б).
В то же время у L. mandschurica содержание МДА оказалось более чем на 30 % ниже (таблица) по сравнению с Т. гшйса, для которой характерна более низкая конститутивная активность основных антиоксидантных ферментов.
Результаты проведенных экспериментов также показали видовые различия в реакции антиоксидантных ферментов на изменения доступности кислорода в среде. Так,
900
600
1Й1
400
ПЗ
8 300
200
100
Рис. 2. Уровни интегральной антирадикальной активности (а) и глутатиона (б) в тканях гепатопанкреаса моллюсков при различных воздействиях Условные обозначения как на рис. 1.
при экспериментальной гипоксии / аноксии только у литторины изменялась активность СОД (ее активность увеличилась в 2,1 раза). В то время как активность ГР увеличилась в 1,5 и 1,2 раза у обоих видов моллюсков (у литторины и тегулы соответственно). При анализе антирадикального звена АО системы показано, что в период пребывания моллюсков в анаэробных условиях содержание ГБН увеличилось в 2,3 и 1,5 раза (у литторины и тегулы соответственно), а уровень ИАА у обоих моллюсков вырос практически в 2 раза (см. рис. 2, а, б). При этом только у Ь. тапй$оЪит1оа концентрация МДА увеличилась почти на 60 %.
В реакции антиоксидантных ферментов на воздействие меди также наблюдались видовые различия. В этих условиях у Ь. тапй$оЪит1оа увеличилась активность СОД (в 2 раза), но неизменной оставалась активность КАТ. И, напротив, у Т. тшНоа наблюдалось достоверное ингибирование этих антиоксидантных ферментов (в 1,8 и 1,2 раза соответственно). Вместе с тем результаты этих экспериментов показали, что при воздействии меди активность ГР не изменялась у обоих видов брюхоногих моллюсков. Воздействие меди также не оказало заметного влияния на уровень ИАА и содержание ГБН у литторины, но привело к увеличению ИАА (в 2 раза) и некоторому снижению
Уровень малонового диальдегида в тканях гепатопанкреаса моллюсков при различных воздействиях (М ± ш, нмоль/г сырого веса)
Вид Контроль Гипоксия/ аноксия Медь Медь и гипоксия/ аноксия
ЬШоппа тапй$скитка 12,2 ± 0,6 19,3 ± 0,4* 18,0 ± 0,2* 20,0 ± 0,9*
Tegula тшЫеа 18,5 ± 0,8 19,2 ± 0,1 18,0 ± 0,4 27,0 ± 2,4*
* Достоверные различия относительно контроля (п = 4, р < 0,05).
rSH (почти на 25%) у тегулы. Следует особо отметить, что уровень МДА увеличился (на 50%) только у литторины.
Реакция на гипоксийно-аноксийные условия у обоих видов моллюсков, испытавших воздействие меди, оказалась в целом сходной. На фоне общего снижения активности основных антиоксидантных ферментов — СОД и КАТ (см. рис. 1, а, б), статистически достоверное ингибирование наблюдалось только для СОД (25% у литторины и более чем на 40% у тегулы). В то же время активность ГР увеличилась в 2,5 раза только у L. mandschurica. В этой серии экспериментов у обоих видов брюхоногих моллюсков изменялись как индекс суммарной активности антирадикального звена АО системы (ИАА), так и уровень rSH (см. рис. 2, а, б). К концу эксперимента показатель ИАА увеличился у L. mandschurica и у T. rustica более чем на 80 и 40%, тогда как содержание rSH, напротив, снизилось почти на 50 и 10% соответственно. Уровень МДА увеличился у обоих видов: около 70% у литторины и на 50% у тегулы.
Супероксиддисмутаза и каталаза являются основными ферментами антиокси-дантной системы, обезвреживающие супероксидный анион-радикал (О2-) и перекись водорода (Н2О2), которые образуются при восстановлении молекулярного кислорода в процессе аэробного метаболизма. Возможно, что высокий уровень конститутивной активности антиоксидантных ферментов у L. mandschurica отражает особенности биохимических механизмов адаптации этого моллюска к специфическим условиям среды обитания. Обнаруженное нами низкое содержание МДА у литторины по сравнению с тегулой, вероятно, также связано с высокой активностью этих антиоксидантных ферментов, препятствующих развитию перекисного окисления липидов при постоянных стрессовых изменениях внешней среды. В то же время в гепатопанкреасе T. rustica обнаружена высокая активность фермента ГР, восстанавливающего окисленный rSH, что свидетельствует о важной роли rSH в механизмах адаптации этого вида.
Поскольку литторина эволюционно адаптирована к условиям периодической смены прилива и отлива, сопровождающихся возникновением дефицита кислорода, то вполне вероятно, что обнаруженное нами увеличение активности СОД и ГР при экспериментальной гипоксии/аноксии подтверждает гипотезу Гермес-Лима с коллегами [14, с. 441]. Согласно этой гипотезе повышение активности антиоксидантных ферментов у таких организмов связано с «предподготовкой», направленной на минимизацию повреждающего действия окислительного стресса, который неизбежно наступает в период реоксигенации, в фазе прилива.
В окислительно-восстановительном метаболизме существенное значение принадлежит трипептиду rSH, проявляющему антиоксидантные свойства [15] и поддерживающему сульфгидрильные группы функционально важных белков в восстановленном состоянии. В гипоксийно-аноксийных условиях уровень rSH в гепатопанкреасе достоверно возрастал у обоих видов моллюсков. Возможно, это связано не только с его антиоксидант-ными свойствами, но и с участием восстановленной формы rSH в процессах связывания кислорода с тканевым гемоглобином, что в определенной мере способствует удержанию кислорода в тканях ([16], с. 122). Увеличение активности Гр дает нам основания полагать, что в условиях недостатка кислорода метаболизм этих моллюсков направлен на поддержание rSH в восстановленном состоянии, что, в определенной мере, свидетельствует о возрастающей роли сульфгидрильных групп в этот период. Интересно отметить, что, несмотря на увеличение активности антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных компонентов АО системы, уровень МДА у L. mandschurica также увеличился.
Медь является необходимым кофактором ряда ферментов, катализирующих разнообразные окислительно-восстановительные реакции. Считается, что токсическое действие меди состоит в ее способности окислять сульфгидрильные группы ферментов, инактивируя их. Предполагают также, что медь может взаимодействовать с АФК (О2-, НО2) и катализировать через реакции Фентона и Хабера-Вайса образование гидроксильного радикала ([17], c. 1174). Высокая реакционная способность этого радикала, в свою очередь, вызывает окислительную деградацию нуклеиновых кислот, белков и инициирует перекисное окисление липидов [15].
В наших экспериментах при действии меди наблюдалось значимое увеличение уровня СОД в клетках гепатопанкреаса L. mandschurica, что свидетельствует об усиленной генерации оксирадикалов, в частности О2-. Это подтверждается исследованием Уилсона и МакМахона [18], которые выявили прямую зависимость между интенсивностью потребления кислорода и концентрацией меди в тканях Littorina rudis. Кроме того, ионы меди могут усиливать окисление гемоглобина и миоглобина, что приводит к образованию О2- , субстрата для СОД ([19], c. 23).
Шсмотря на увеличение активности СОД, у литторины наблюдалось увеличение окислительной деградации липидов, на что указывает повышение уровня МДА. Значимых изменений в других показателях у литторины мы не наблюдали. У тегулы, несмотря на ингибирование отдельных компонентов АО системы (СОД, КАТ и TSH), действие меди не инициировало перекисного окисления липидов. По-видимому, обнаруженное нами увеличение уровня ИАА на фоне снижения содержания TSH у тегулы при воздействии меди свидетельствует о действии других низкомолекулярных антиоксидантов, не менее важных, чем TSH.
Действие меди в условиях гипоксии/аноксии привело к существенному подавлению защитной системы у обоих видов моллюсков. Токсичность меди усилилась при недостатке кислорода в тканях, что подтверждается увеличением окислительной деградации липидов в гепатопанкреасе обоих видов моллюсков. Инициированное этими факторами повышение у них уровня ИАА свидетельствует об активации низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы в защите от окислительного повреждения [20]. Таким образом, на фоне подавления активности главных антиоксидантных ферментов (СОД, КАТ) наблюдаемое нами увеличение показателя ИАА не защитило ткани моллюсков от окислительной деградации ее компонентов.
Шсмотря на то, что TST также является важным компонентом антиоксидантной системы, инактивирующим вторичные метаболиты окислительного стресса, такие как a-ненасыщенные альдегиды, хиноны, эпоксиды и др., однако, у исследуемых видов моллюсков активность этого фермента не изменилась при всех формах воздействия.
Итак, результаты исследования показали, что конститутивная активность антиок-сидантных ферментов у L. mandschurica выше, чем у T. rustica. Возможно, что эти различия связаны с особенностями экологии видов. Шми обнаружена выраженная видовая специфичность реакции антиоксидантных ферментов на воздействие ионов меди у литторины (активация) и тегулы (ингибирование). В присутствии в среде ионов Си2+ недостаток кислорода инициировал усиление процессов окислительного стресса в организме моллюсков (по сравнению с раздельным действием этих факторов), что выражалось в подавлении главных антиоксидантных ферментов и накоплении продуктов перекисного окисления липидов.
1. Wu R. S. S. Hypoxia: from molecular responses to ecosystem responses // Mar. Pol. Bul. 2002. Vol. 45. P. 35-45.
2. Челомин В. П., Бельчева Н. Н., Захарцев М. В. Биохимические механизмы адаптации мидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди // Биология моря. 1998. №5. С. 319-325.
3. Veldhuizen-Tsoerkan M. B. Anoxic survival time and metabolic parameters as stress indices in sea mussels exposed to cadmium or polychlorinated biphenyls // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 1991. Vol. 20. P. 259-265.
4. Influences of ammonia-nitrogen and dissolved oxygen on lysosomal integrity in green-lipped mussel Perna viridis: Laboratory evaluation and field validation in Victoria Harbour, Hong Kong / Fang J. K. H., Wu R. S. S., Chan A. K. Y., Yip C. K. M., Shin P. K. S. // Mar. Pol. Bul. 2008. Vol. 56. P. 2052-2058.
5. Immune responses of the scallop Chlamys farreri after air exposure to different temperatures / Chen M., Yang H., Delaporte M., Zhao S., Xing K. // J. Experimental Mar. Biol. and Ecol. 2007. Vol. 345. P. 52-60.
6. Челомин В. П., Бельчева Н. Н., Довженко Н. В. Мониторинг загрязнения прибрежных вод на основе биохимических маркеров // Дальневосточные моря России. Исследования морских экосистем и биоресурсов. М.: Ыаука, 2007. C. 617-632.
7. Re Roberta., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M. and Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Rad. Biol. and Med. 1999. Vol. 26. P. 1231-1237.
8. Paoletti F., Aldinuccio D., Mocali A., Carparrini A. A sensitive spectrophotometric method for the determination of superoxide dismutase in tissue extracts // Anal. Biochem. 1986. Vol. 154. P. 526-541.
9. Regoli F., Principato G. Glutathione, glutathione-dependent and antioxidant enzymes in mussel, Mytilis galloprovincialis, exposed to metals under field and laboratory conditions: implications for the use of biochemical biomarkers // Aquat. Toxicol. 1995. Vol. 31. P. 143-164.
10. Habig W. H., Jakoby W. B. Assay for differentiation of glutathione S-transferases // Meth. Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 398-405.
11. Moron M. S., Depierre J. W., Mannervik B. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione s-transferase activities in rat lung and liver // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 582. P. 67-78.
12. Buege J. A., Aust S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology / ed. by S. Fleischer, L. Packer. New York: Academic Press, 1978. P. 302-310.
13. Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L. and Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 266-275.
14. Hermes-Lima M., Storey J. M., Storey K. B. Antioxidant defenses and metabolic depression. The hypothesis of preparation for oxidative stress in land snails // Comp. Biochem. and Physiol. 1998. Pt. B 120. P. 437-448.
15. Freedman J. Н., Ciriolo M. R, Peisach J. The role of glutathione in copper metabolism and toxicity // J. Boil. Chem. 1989. Vol. 264, N 10. P. 5598-5605.
16. Биргер Т. И. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде. Киев: Ыаукова Думка, 1979. 192 с.
17. Valko M., Morris H., Cronin M. T. D. Metals, toxicity and oxidative stress // Cur. Med. Chem. 2005. Vol. 12. P. 1161-1208.
18. Wilson J. G., McMahon R. F. Effects of high environmental copper concentration on the oxygen consumption, condition and shell morphology of natural populations of Mytilus edulis L. and Littorina rudis Maton // Comp. Biochem. Physiol. 1981. Vol. 70. P. 139-147.
19. Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Oxford Univ. press, 2007. 851 p.
20. Ланкин В. З., Тихазе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях: пособие для врачей. М.: РКЫПКМЗ РФ, 2001. 78 с.
Статья поступила в редакцию 9 июня 2011 г.
