CC BY
113
раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
УДК 576.852.22 ББК 28.4
ВЛИЯНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИИ НА МЕТАБОЛИЗМ И АДГЕЗИВНЫЙ потенциал промышленного штамма ЬАСТОБАСТЕМиМ РЬАШАЯиМ 8Р-А3 Назырова Н.Р., Тимербаева Р.Х., Туйгунов М.М., Шаяхметов И.Ф.
Изучено влияние водных извлечений лекарственных трав чистотела большого, барбариса обыкновенного, люцерны посевной на метаболизм и адгезивный потенциал промышленного штамма L. plantarum 8P-A3. Выявлено стимулирующее действие биологически активных веществ лекарственных растений на параметры роста и адгезию штамма L. plantarum 8P-A3.
В настоящее время нормальный биоценоз человека рассматривается как часть сложной экосистемы «человек - его микрофлора -окружающая среда», или как отдельный «метаболический орган», выполняющий самые разнообразные функции. Однако в условиях ухудшающейся экологической обстановки отмечается тенденция к расширению спектра патологических состояний, сопровождающихся нарушением микроэкологического равновесия различных полостей макроорганизма.
Вследствие этого, в современных условиях жизни применение пробиотиков является важным инструментом защиты человека от агрессивной окружающей среды, оказывая разноплановые положительные эффекты на звенья механизма
оздоровления. Поиск новых пробиотиков,
характеризующихся явлениями синергизма медикобиологических свойств их составляющих и
обладающих многокомпонентностью
терапевтического воздействия на макроорганизм, позволит значительно расширить сферу производства комплексных препаратов со
стабильными показателями качества и безопасности [1].
Большой интерес в последнее время вызывает направление, предусматривающее разработку
пробиотиков и продуктов функционального питания, обогащенных специфическими и неспецифическими биокорректорами. Препараты растительного происхождения, содержащие богатый набор биологически активных веществ (БАВ), занимают особое место в группе фармакологически активных средств
пребиотического действия. Природные БАВ используются для получения большого количества лекарственных средств, в частности, перспективными источниками растительного сырья для создания фитопрепаратов являются чистотел большой, барбарис обыкновенный и люцерна посевная. На основании сравнительного анализа применения вышеперечисленных трав в научной,
народной и гомеопатическом медицине выявлено их противовоспалительное, болеутоляющее, бактерицидное, противовирусное,
гепатопротекторное, желчегонное,
иммуномодулирующее, антиоксидантное,
противоопухолевое и другие действия на организм человека. Во всех частях растений найдены алкалоиды, флавоноиды, сапонины, дубильные вещества, витамины, углеводы, незаменимые аминокислоты, микроэлементы, органические кислоты. Опыт клинического использования фитодобавок подтверждает актуальность их применения как неспецифических биокорректоров, но практическая реализация разработанной концепции требует детального и разностороннего изучения метаболических систем и факторов, ответственных за эффекты, влияющие на рост, развитие и спектр биологических свойств изучаемых микробных популяций [2].
Адгезивная активность (АА)
микроорганизмов-пробионтов является ключевым признаком, обеспечивающим механизм их длительной персистенции в организме человека. Вследствие этого, одним из важных критериев оценки перспективности использования
комплексных фитопробиотиков являются адгезивные свойства бактерий в отношении эпителиоцитов слизистых различных биотопов макроорганизма [3].
Цель исследования - изучение в смоделированной in vitro системе «лактобактерии -кишечные энтероциты» адгезивного и метаболического потенциалов лактобактерий, полученных в питательных средах с водными извлечениями (ВИ) лекарственных растений.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования служили производственные штаммы лактобактерий: L.
plantarum 8P-A3, L. fermentum 90T-C4, L. acidophilum K-Ш^, L. acidophilum 100 АШ, L. acidophilum NK1.
Лактобактерии выращивали при температуре 37 °С в течение 1-2 сут в молочно-сывороточных средах (МС) с подобранными концентрациями лекарственных растений: чистотела большого
(Chelidonium majus), барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris) и люцерны посевной (Medicago sativa). Сырье, собранное из произрастающих в диком виде и культивируемых в сельском хозяйстве нашего региона растений, соответствовало требованиям нормативнотехнической документации. ВИ травянистой части и плодов растений получали по оригинальной технологии с термической обработкой растительного сырья. В качестве контроля использовали биомассу лактобактерий,
полученную в МС среде без добавления растительного сырья.
АА бактерий определяли методом цитадгезии на энтероцитах кишечника аутобредных крыс [4]. Животных умерщвляли эфиром, из тонкого кишечника выделяли кусочки размером 5x5 мм, отмывали от слизи и содержимого фосфатным буферным раствором (ФБР), получали энтероциты с помощью электровибрационного прибора модели ВПП. Эпителиальные клетки отмывали центрифугированием в ФБР при 800 об/мин в течение 10 мин.
Культуру лактобактерий отмывали от питательной среды центрифугированием в ФБР при 1000 об/мин в течение 10 мин и из клеточных осадков готовили микробную взвесь. При постановке теста по определению АА использовали взвесь энтероцитов с концентрацией (1,5-2)x106 кл/мл и взвесь лактобактерий с концентрацией 109
кл/мл. Клеточно-бактериальную взвесь в соотношении 1:1000 инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 40 мин, отмывали центрифугированием в ФБР от не прилипших бактерий. Из осадка готовили мазки, фиксировали и окрашивали азуром А.
При оценке АА каждого штамма лактобактерий подсчитывали средний показатель адгезии (СПА), коэффициент участия энтероцитов в адгезивном процессе (К) и индекс адгезивности микроорганизма (ИАМ). Низкоадгезивными
считали штаммы при микроскопическом обнаружении до 5 микробных клеток, среднеадгезивными - 5-10, высокоадгезивными -
при прилипании более 10 бактерий на 1
эпителиальную клетку.
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами [5].
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования позволили установить масштаб штаммовых различий лактобактерий в адгезивных взаимоотношениях с эпителиальными клетками кишечника. В качестве контроля рассматривали штамм
Ь. р1аМатш 8Р-А3, используемый в
иммунобиологической промышленности.
Установлена разность показателей исходного уровня адгезивности лактобактерий (СПА - от 2,1 до 8,0 лактобактерий на один энтероцит) (табл. 1).
Таблица 1
Адгезивная активность лактобактерий к энтероцитам тонкого кишечника аутобредных крыс
Микроорганизмы-пробионты Количество опытов (n) СПА (M±m) ( К m) ИАМ
L. fermentum 90T-C4 5 5,7±0,б 58,3±2,8 9,8
L. plantarum BP-A3 (К) 5 б,В±1,2 б3,5±3,9 10,7
L. acidophilum 100 АШ 5 2,б±0,5** 34,8±2,5** 7,5
L. acidophilum К3-Ш24 5 2,4±0,3** 31,3±1,7** 7,7
L. acidophilum NK1 5 4,1±0,7* 47,2±2,б* 8,7
Примечание: * - различие статистически значимо (р < 0,05) ** - различие статистически значимо (р < 0,001)
Анализ исследований АА позволил отнести промышленные штаммы лактобактерий L. plantarum 8P-A3, L. fermentum 90T-C4 к среднеадгезивным, остальные изученные нами штаммы лактобактерий в опытах in vitro обладали низкой адгезивностью в отношении энтероцитов крыс. Исходя из результатов опытов, в качестве объекта дальнейших исследований использовали промышленный штамм L. plantarum 8P-A3.
При оценке адгезивности полученных биомасс
штамма Ь. рїапїагиш 8Р-А3 к эпителиальным клеткам тонкого кишечника аутобредных крыс установлена статистическая значимость различий АА лактобактерий, выращенных в питательных средах МС с ВИ лекарственных трав (опыт) с результатами АА лактобактерий, выращенных в питательных средах без растительного сырья (контроль). На рисунке представлена адгезия штамма Ь. рїапґагиш 8Р-А3 к энтероцитам кишечника аутобредных крыс.
Б
Рисунок. Колонизация кишечного эпителия крысы бактериями штамма Ь. pla.nta.rum 8Р-А3. Окраска азуром А, ув. 300.
Примечание: культуры микроорганизмов получены в питательных средах:
А - на основе молочной сыворотки (контроль);
Б - с подобранным содержанием ВИ чистотела большого (опыт).
Под влиянием ВИ лекарственных трав (чистотела, барбариса, люцерны) происходит
повышение адгезивных свойств штамма Ь. рїапґагиш 8Р-А3. Как видно из рисунка, микроорганизмы, полученные в питательной среде с ВИ чистотела, характеризуются высокой адгезивностью (СПА - (12,9±1,2) микробных клеток, адгезированных к 1 энтероциту).
Бактериальная популяция лактобактерий в опытных сериях с подобранной концентрацией ВИ лекарственных трав характеризовалась
статистически значимым увеличением
концентрации жизнеспособных клеток и стабильностью биологических свойств при хранении (табл. 2).
Характеристика параметров роста и адгезивной активности штамма Ь. рІаШагит 8Р-А3 в питательных средах с ВИ лекарственных трав
Т аблица 2
Среда МС Параметры роста культуры Адгезивная активность
содержание живых клеток в lg к концу роста (M±m) максимальная удельная скорость, M'max^ (M±m) время генерации, tdmin ч (M±m) СПА (M±m) К (M±m) ИАМ
с чистотелом 10,05+0,03* 1,1б+0,03** 0,55+0,02** 12,9±1,2** 82,0±3,9* 15,7
с барбарисом 10,12+0,02* 1,79+0,02** 0,39+0,04** 14,1±1,1** 85,4±4,1* 17,7
с люцерной 10,09+0,03* 1,30+0,03** 0,б0+0,02** 10,2±1,1* 79,5±4,1* 12,8
контроль 9,80+0,03 0,71+0,02 0,97+0,03 б,8±1,2 б3,5±3,9 10,7
Примечание: * - различие с контролем статистически значимо (р<0,05);
** - различие с контролем статистически значимо (р<0,001).
Кинетика роста микробной популяции Ь. р1аМатш 8Р-А3 характеризовалась наличием всех фаз роста. Анализ кривых роста в питательных средах на основе молочной сыворотки (контроль) и в средах на основе молочной сыворотки, содержащих ВИ лекарственных трав (опыт), позволил установить укорочение лаг-фазы в 2-2,5 раза, увеличение удельной скорости роста и сокращение времени генерации бактериальной популяции в 1,5-2,5 раза.
На основании проведенных исследований установлено выраженное стимулирующее действие БАВ лекарственного сырья на параметры роста бактерий штамма Ь. р1аМатш 8Р-А3, что обусловлено, по-видимому,
многокомпонентностью источников питания. Относя к неспецифическим механизмам контроля регуляции роста весь комплекс трофических компонентов и физико-химических факторов среды развития, следует отметить, что опыт изучения параметров роста культуры Ь. р1аМатш 8Р-А3 показал преимущественное влияние БАВ лекарственных средств на общую скорость протекания основных процессов
жизнедеятельности. Сравнительная характеристика биологических свойств культур лактобактерий, полученных в питательных средах на основе
молочной сыворотки с содержанием ВИ трав, позволила сделать выводы, что БАВ, экстрагированные из травянистой части лекарственных растений (флавоноиды, алкалоиды, сапонины, витамины и др.) повышают адгезивную и метаболическую активности лактобактерий.
Развитие микробной культуры можно представить как сложный многоступенчатый динамичный процесс, обусловленный
метаболическими влияниями через среду обитания и направленный на достижение популяцией максимальной численности на каждом этапе и в конкретной среде развития. Среди всего спектра БАВ, интегрирующих развитие микроорганизмов и всей микробной популяции в целом, следует выделить вещества и метаболиты, включающиеся в отдельные звенья биосинтеза и тем самым оказывающие регулирующий эффект на развитие и численность популяции. В соответствии с этим требуют дальнейшего решения вопросы регламентации характеристик и уровней
содержания в препаратах-пробиотиках
пребиотических компонентов из растительного
сырья, разработки методологии контроля гигиенической безопасности, стандартизации
методов количественного определения БАВ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тихомирова Н.А. Технология продуктов лечебно-профилактического питания. М.: МГУПБ, 2001. 242
с.
2. Попкова С.М., Кичигина Е.Л., Лещук С.И. и др. Оценка влияния отваров лекарственных растений и противобактериальных антител к бифидобактериям на их адгезию in vitro. // Журнал микробиол. 2004. № 2. С. 70-74.
3. Карпунина Т.И., Горовиц Э.С., Чиненкова А.Н. и др. Повышение эффективности терапевтического действия пробиотиков. // Микробиол. журнал. 1998. № 2. С. 104-107.
4. Горская Е.М., Манохина И.М., Горелов А.В. и др. Методические рекомендации по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника. // М. 1989. 7 с.
5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М., 1962.
Поступила в редакцию 14.06.06 г.
