CC BY
79
УДК 57.022:57.042:574.23
ВЛИЯНИЕ КОНДИЦИОННОЙ ПОВСЕМЕСТНОЙ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК НА УСТОЙЧИВОСТЬ ОСОБЕЙ DROSOPHILA MELANOGASTER К ДЕЙСТВИЮ СТРЕСС-ФАКТОРОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ (ОКСИДАТИВНОМУ СТРЕССУ, ТЕПЛОВОМУ ШОКУ, ГОЛОДАНИЮ)
Л.А. ШИЛОВА, Е.Н. ПЛЮСНИНА*, А.А. МОСКАЛЕВ***
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар *Сыктывкарский государственный университет, г. Сыктывкар **Московский физико-технический институт, г. Долгопрудный Lubov.schilova@yandex.ru
Исследовано влияние кондиционной повсеместной сверхэкспрессии генов репарации ДНК, которые участвуют в распознавании повреждений ДНК (Hus1, mnk), эксцизионной репарации ДНК (mei-9, mus210, Rrpl) и репарации двуцепочечных разрывов ДНК (Brca2, Ku80, spnB, WRNexo) на устойчивость дрозофил к действию стресс-факторов различной природы - оксидативного стресса (20 дМ параквата), теплового шока (35 оС) и голодания. Показано, что в большинстве случаев наличие в геноме дрозофил дополнительных активных копий генов репарации ДНК не стимулировало стрессоустойчивость особей, а, напротив, ухудшало ее. Полученные результаты также демонстрируют важную роль данных генов в обеспечении стрессоустойчивости целого организма.
Ключевые слова: Drosophila melanogaster, репарация ДНК, стрессоустойчи-вость, кондиционная повсеместная сверхэкспрессия
L.A. SHILOVA, E.N. PLYUSNINA, A.A. MOSKALEV. INFLUENCE OF CONDITIONALLY UBIQUITOUS OVEREXPRESSION OF DNA REPAIR GENES ON RESISTANCE OF DROSOPHILA MELANOGASTER INDIVIDUALS TO DIFFERENT STRESS FACTORS (OXIDATIVE STRESS, HEAT SHOCK, STARVATION)
The influence of conditioned ubiquitous overexpression of DNA repair genes, which are involved in damage recognition (Husl, mnk), excision repair (mei- 9, mus210, Rrpl) and double-strand break repair (Brca2, Ku80, spnB, WRNexo) on Drosophila resistance to different stress factors - oxidative stress (20 ^M paraquat), heat shock (35 °C) and starvation was studied. It is shown that in most cases overexpression of DNA repair genes did not stimulate stress-resistance of Drosophila individuals. The results also demonstrate the important role of these genes in provision of stress-resistance of the whole organism.
Keywords: Drosophila melanogaster, DNA repair, stress-resistance, conditioning ubiquitous overexpression
Введение
Все живые организмы подвергаются влиянию абиотических и антропогенных стрессоров и их жизнеспособность зависит от эффективности механизмов ответа на эти воздействия. Одним из наиболее важных механизмов ответа на стресс на молекулярно-клеточном уровне является распознавание и репарация повреждений ДНК. Известно, что мутации генов репарации ДНК значительно снижают устойчивость к действию повреждающих агентов [1]. Однако на данный момент имеется лишь небольшое количество сведений по влиянию сверхэкспрессии генов репарации ДНК на продолжительности жизни организмов. Например, введение
в геном дрозофил 1-2 дополнительных копий гена теі-41 (гомолог ATR млекопитающих) приводит к увеличению продолжительности жизни по сравнению с особями дикого типа, однако значительного изменения в эффективности репарации ДНК у таких мух не происходит [2]. Сверхэкспрессия гена 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы в тканях мышей не приводит к увеличению продолжительности жизни [3]. Вероятно, это связано с тем фактом, что 06-метилгуанин не накапливается с возрастом, а потому не играет существенной роли в процессе старения [4].
Ранее нами было показано, что сверхэкспрессия гена ответа на повреждение ДНК D-GADD45 одновременно с увеличением медианной
и максимальной продолжительности жизни повышает стрессоустойчивость особей Drosophila melano-gaster [5]. Цель данной работы - исследовать влияние сверхэкспрессии генов ответа на повреждение ДНК (гомологи HUS1, CHK2), генов эксцизионной репарации (гомологи XPF, XPC, АР-эндонуклеазы-1) и генов репарации двуцепочечных разрывов (BRCA2, KU80, WRNexo) на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию индуктора свободных радикалов параквата, гипертермии и голодания.
Материалы и методы
Для исследования стрессоустойчивости к различным повреждающим агентам использовали линии дрозофил, в геном которых встроены дополнительные копии исследуемых генов под контролем промотора UAS, индуцируемого драйвером GAL4: w1118, UAS-Brca2; w1118, UAS-Hus1; w1118, UAS-mnk (Любезно предоставлены Dr. Schupbach, Princeton University, Princeton, США), w1118, UAS-Ku80; w1118, UAS-mei-9; w1118, UAS-mus210; w1118, UAS-Rrp1; w1118, UAS-WRNexo (Созданы с передачей авторских прав под заказ в Genetivision, Хьюстон, сШа) и линию P{Act5C(-FRT)GAL4.Switch. PRJ3/TM6B, Tb1 (далее - GS-GAL4) (Bloomington Stock Center, США).
Для сверхактивации генов репарации ДНК использовали RU486-активируемый GeneSwitch [6, 7]. Для получения особей дрозофил с кондиционной (мифепристон-индуцибельной) повсеместной сверхактивацией изучаемых генов, самцов линии GS-GAL4, несущих активатор транскрипции GAL4 от дрожжей, скрещивали с виргинными самками, имеющими дополнительную копию исследуемого гена под контролем промотора UAS. При добавлении в корм потомкам скрещивания этих двух линий агониста прогестерона мифепристона (RU486) (Mifepritone, Sigma) активируется экспрессия GAL4, в результате чего запускается транскрипция генов под контролем промотора UAS. В качестве контроля использовали мух c тем же генотипом, живущих на питательной среде без добавления мифепристона.
Для определения устойчивости к оксидативно-му стрессу дрозофил рассаживали в банки с фильтровальной бумагой, пропитанной раствором 20 мМ параквата (Methyl Viologen, Sigma) в 5%-ной сахарозе. Для оценки устойчивости к тепловому шоку мух содержали при температуре 35 °С в банках со стандартной агарно-дрожжевой питательной средой. Для определения устойчивости к голоданию дрозофил помещали в банки с фильтровальной бумагой, пропитанной водой, объем выборок составил 110-120 мух на вариант эксперимента. Два раза в день подсчитывали количество умерших особей, после чего анализировали показатели выживаемости. Различия между выборками оценивали с помощью непараметрических критериев Колмогорова-Смирнова, Гехана-Бреслоу-Вилкоксона и ф-критерия Фишера для выборочных долей.
Результаты и обсуждение
Одним из главных повреждающих ДНК агентов являются активные формы кислорода. Их взаимодействие с ДНК приводит к образованию повре-
ждений, включая модификации сахаров, разрывы цепей и аддукты оснований и сахара [8]. В большинстве случаев сверхэкспрессия генов репарации ДНК не приводила к достоверным изменениям, либо снижала среднюю длительность жизни самцов и самок в условиях действия индуктора свободных радикалов параквата на 7-30 % по сравнению с особями без сверхэкспрессии (р<0.05). Анализ других данных выживаемости показал аналогичный результат (таблица). Исключением являются самцы со сверхэкспрессией гена Mus210 (гомолог ХРС) и самки с повышенной активностью гена Hus1 - их средняя продолжительность жизни в условиях окислительного стресса была выше на 15-36 % (р<0.05).
Основным типом повреждений при тепловом шоке являются повреждения белков, однако под его влиянием в результате увеличения темпов метаболизма и выработки свободных радикалов также происходит повреждение ДНК. Обнаружено, что повышенная транскрипция генов репарации ДНК для многих генов увеличила устойчивость дрозофил к гипертермии. Так, у самцов и самок со сверхэкспрессией генов Hus1 и WRNexo, самцов со сверхактивностью Вгса2 и Rrp1 (гомолог АР-эндонуклеазы-1), а также самок со сверхэкспрессией Мпк (гомолог СНК2) средняя продолжительность жизни при 35 °С была выше на 8-25 % по сравнению с контрольными особями (р<0.05). С другой стороны, увеличение транскрипции таких генов, как Ки80, Ме-9 (гомолог XPF), Mus210 у самцов и Ки80, Вгса2, Rrp1 у самок сопровождалось снижением средней длительности жизни на 8-24 % (р<0.05). Оценка других показателей выживаемости показала аналогичный результат (см. таблицу).
Чрезмерное снижение потребления пищи помимо прочих негативных эффектов также вызывает окислительный стресс и дефекты репарации ДНК [9]. Повышенная транскрипционная активность генов Вгса2, Hus1, Мпк, WRNexo у самцов и гена Mus210 у самок привела к повышению средней длительности жизни в условиях голодания на 8-45 % (р<0.05). Анализ других показателей соответствовал этим данным. Однако сверхэкспрессия генов репарации ДНК в остальных вариантах эксперимента с воздействием голодания не повлияла на выживаемость, либо вызвала негативный эффект (таблица).
Таким образом, наиболее положительное влияние (повышение устойчивости к большинству исследуемых стресс-факторов) оказала сверхэкспрессия гена Hus1 у самцов и самок и генов Вгса2 и WRNexo у самцов. Белки, кодируемые этими тремя генами, необходимы для инициации и координации различных механизмов репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК [10-12]. Белок HUS1 является составной частью комплекса 9-1-1, который играет центральную роль в сенсировании повреждений ДНК и инициации задержки клеточного цикла в S-фазе [13, 14]. Продукт гена Вгса2 участвует в распознавании двунитевых повреждений ДНК и их репарации по типу гомологичной рекомбинации [15, 16]. Фермент WRNexo является RecQ-геликазой с эндонуклеазной активностью и участвует в репарации двунитевых разрывов ДНК по типу негомологичного воссоединения концов [17, 18].
Влияние сверхэкспрессии генов репарации ДНК на устойчивость особей Drosophila melanogaster к действию окислительного стресса, гипертермии и голоданию
Паракват 20 мМ
Гипертермия 35 °С
Голодание
Вариант эксперимента М X ± Am 48 ч М X ± Am 24 ч М X ± Am 48 ч
S UAS-Brca2/GS-GAL4 (-) 54 53.3±1.7* 46 33 36.6±0.9 6 32 36.4±1.0 98
S UAS-Brca2/GS-GAL4 + RU486 (+) 46 49.6±3.0 * 9 5 48* 39.6±1.0* 12 * 8 4 44.1±1.5* 81*
? UAS-Brca2/GS-GAL4 (-) 31 40.9±2.0 73 48 41.8±0.8 5 48 42.3±1.1 80
? UAS-Brca2/GS-GAL4 + RU486 (+) * 2 2 35.1±2.1* 82 33* 34.5±0.6* 14* 33* 38.8±1.0 96
S UAS-Hus 1/GS-GAL4 (-) 55 62.4±2.3 28 23 29.8±1.0 9 48 40.6±0.8 86
S UAS-Hus 1/G S-GAL4 + RU486 (+) * 5 5 51.6±3.1* * 0 5 * 2 3 34.6± 1.1* 31* * 8 4 48.9±1.2* 78
? UAS-Hus 1/GS-GAL4 (-) 46 45.9±2.0 66 32 29.5±0.8 45 48 52.1±1.2 59
? UAS-Hus 1/G S-GAL4 + RU486 (+) 55* 62.3±2.8* * 6 4 * 2 3 37.0±0.9* 9* 48 44.6±1.3* 71*
S UAS-Ku80/GS-GAL4 (-) 78 80.0±1.5 9 39 32.8±0.8 38 32 38.9±1.0 30
S UAS-Ku80/GS-GAL4 + RU486 (+) 70 76.7±2.6 18* * 4 2 26.3±0.8* 76* 32 34.9±1.1* 99*
? UAS-Ku80/GS-GAL4 (-) 46 58.3±2.4 56 39 38.9±0.3 2 48 42.1±1.2 100
? UAS-Ku80/GS-GAL4 + RU486 (+) 31 56.1±3.5 58 39 35.8±0.7* 17* * 2 3 36.6±0.9* 76
S UAS-mei-9/GS-GAL4 (-) 78 84.9±3.5 25 39 32.2±0.9 40 48 42.2±2.1 66
S UAS-mei-9/GS-GAL4 + RU486 (+) 46* 59.1±2.6* * 2 5 * 4 2 28.0±0.8* * 9 6 48 40.3±1.0* 87*
? UAS-mei-9/GS-GAL4 (-) 70 69.9±3.5 41 39 36.7±0.7 14 48 53.4±1.8 68
? UAS-mei-9/GS-GAL4 + RU486 (+) 70 73.7±4.4 43 39 39.6±0.7* 9 48 48.6±1.6* 65
S UAS-mnk/GS-GAL4 (-) 54 54.3±2.2 26 31 33.8±0.9 23 33 37.9±0.8 93
S UAS-mnk/GS-GAL4 + RU486 (+) 31* 38.3±1.6* * 6 6 31 32.5±0.8 20 48 40.9±1.4* 73*
? UAS-mnk/GS-GAL4 (-) 55 51.4±1.8 46 31 36.1±0.6 4 48 43.2±1.1 84
? UAS-mnk/GS-GAL4 + RU486 (+) 48 50.9±2.1 * 0 6 48* 40.1±0.8* 5 * 8 4 39.3±1.1 94
S UAS-mus210/GS-GAL4 (-) 55 60.4±2.3 32 32 27.4±0.5 49 48 43.1±1.1 88
S UAS-mus210/GS-GAL4 + RU486 (+) * 0 7 69.5±2.4 30 * 3 2 23.7±0.4* * 5 8 48 38.1±1.1 99*
? UAS-mus210/GS-GAL4 (-) 46 49.1±2.3 67 39 39.4±0.3 2 48 41.4±1.0 93
? UAS-mus210/GS-GAL4 + RU486 (+) * 0 3 42.6±2.1 81* 39 32.6±0.8* * 4 3 48 44.7±1.3* * 9 6
S UAS-Rrp1/GS-GAL4 (-) 72 63.2±1.9 31 24 27.5±0.8 67 56 60.1±1.4 29
S UAS-Rrp1/GS-GAL4 + RU486 (+) 72 62.3±2.2 33 * 9 3 34.4±0.7* * 6 2 * 7 4 50.7±1.3* * 2 6
? UAS-Rrp1/GS-GAL4 (-) 72 68.0±2.7 38 39 38.6±0.5 7 47 55.0±1.1 55
? UAS-Rrp1/GS-GAL4 + RU486 (+) 47* 48.2±2.0* 73* * 4 2 29.3±0.9* 57* 47 49.8±1.6* 51
S UAS-WRNexo/GS-GAL4 (-) 80 81.6±3.0 26 32 29.4±0.6 42 31 32.2±1.1 98
S UAS-WRNexo/GS-GAL4 + RU486 (+) 80 64.9±3.3* 37 32 30.4±0.5 * 6 2 * 8 4 46.8±1.0* 75*
? UAS-WRNexo/GS-GAL4 (-) 95 91.1±4.0 28 32 29.8±0.5 37 48 44.4±0.8 93
? UAS-WRNexo/GS-GAL4 + RU486 (+) * 2 7 77.9±3.5* * 6 3 32 33.6±0.8 21* 48 43.0±0.9 91
Обозначения: $ - самцы; $ - самки; (-) - без сверхэкспрессии; (+) - сверхэкспрессия; М - медианная продолжительность жизни (сут); Х — Ат - средняя продолжительность жизни (сут); 48 ч и 24 ч - процент умерших особей через 48 ч и 24 ч после начала воздействия; * - р<0.05 (М - критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона;
X + Ат - критерий Колмогорова-Смирнова, 48 ч и 24 ч - ф-критерий Фишера). Объем выборок 110-120 мух на вариант эксперимента.
Мутация в гене данного белка у человека приводит к развитию тяжелого заболевания с симптомами преждевременного старения - синдрома Вернера [19]. Полученные результаты демонстрируют важную роль этих генов в обеспечении стрессоустой-чивости целого организма.
Однако в большинстве случаев наличие в геноме дрозофил дополнительных активных копий генов репарации ДНК не стимулировало стрессо-устойчивость особей, а, напротив, ухудшало ее. Отсутствие или слабая выраженность стимулирования стрессоустойчивости может быть связана с недостаточной эпигенетической регуляцией процесса репарации ДНК. Например, показано, что в фибробластах человека повышенная активность генов репарации ДНК замедляет клеточное старение только на фоне одновременной сверхэкспрессии гена деацетилазы гистонов SIRT6 [20]. Другой причиной снижения продолжительности жизни могут быть нарушение баланса между различными внутриклеточными путями и энергетическое истощение. Поскольку репарации ДНК - это процесс, требующий больших энергетических затрат [21], следовательно, сверхактивация изучаемых генов могла привести к чрезмерному расходу энергии в ущерб другим жизненно важным процессам.
Работа поддержана грантом РФФИ № 1404-01596, грантом Президента РФ МД-10902014.4 «Сравнение механизмов ответа Drosophila mela-nogaster на оксидативный, тепловой, холодовой и генотоксический стрессы с использованием полногеномного анализа транскриптомов», грантом Президиума РАН № 12-П-4-1005 ««Экологическая генетика продолжительности жизни модельных животных (Drosophila melanogaster, Mus musculusj» и молодежного гранта УрО РАН № 14-4-НП-103 ««Изучение влияния активации генов стресс-ответа и циркадных ритмов на старение и стрессоустойчивость Drosophila melanogaster».
Литература
1. Moskalev AA., Plyusnina EN., Shaposhnikov M.V. Radiation hormesis and radioadaptive response in Drosophila melanogaster flies with different genetic backgrounds: the role of cellular stress-resistance mechanisms // Biogerontology. 2011. Vol. 12. № 3. P. 253-263.
2. Symphorien S., Woodruff R. C. Effect of DNA repair on aging of transgenic Drosophila melanogaster: I. mei-41 locus // J. of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 2003. Vol. 58. № 9. P. 782-787.
3. Walter C. A., Zhou Z. Q., Manguino D., et al. Health span and life span in transgenic mice with modulated DNA repair // Annals of the New York Academy of Sciences. 2001. Vol. 928. P.132-140.
4. Mizoguchi M, Naito H., Kurata Y. et al. Influence of aging on multi-organ carcinogenesis in rats induced by N-methyl-N-nitrosourea // Jpn. J. Cancer Res. 1993. Vol. 84. № 2. P. 139146.
5. Moskalev A., Plyusnina E., Shaposhnikov M. et al. The role of D-GADD45 in oxidative, thermal and genotoxic stress resistance // Cell Cycle. 2012. Vol. 11. № 22. P. 4222-4241.
6. Osterwalder T. A., Yoon K. S., White B. H., Keshishian H. Conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. №22. P. 12596-12601.
7. Roman G, Endo K, Zong L., Davis R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. №22. P. 12602-12607.
8. Souza-Pinto N. C, Croteau D. L, Hudson E. K. et al. Age-associated increase in 8-oxo-deoxy-guanosine glycosylase/AP lyase activity in rat mitochondria // Nucleic acids research. 1999. Vol. 27. № 8. P. 1935-1942.
9. Heininger K. Ageing is a deprivation syndrome driven by a germ-soma conflict // Ageing research reviews. 2002. Vol. 1. № 3. P. 481-536.
10. Xu M., Bai L., Gong Y, Xie W. et al. Structure and functional implications of the human rad9-hus1-rad1 cell cycle checkpoint complex // J. Biol. Chem., 2009. Vol. 284. № 31. P. 2045720461.
11. Roy R., Chun J., Powell S.N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection // Nat. Rev. Cancer., 2011. Vol. 12. № 1. P. 68-78.
12. Kuper J., Kisker C. DNA Helicases in NER, BER, and MMR // Adv. Exp. Med. Biol., 2013. Vol. 767. P. 203-224.
13. Abdu U., Klovstad M., Butin-Israeli V., et al. An essential role for Drosophila hus1 in somatic and meiotic DNA damage responses // J. Cell Sci. 2007. Vol. 120. № Pt 6. P. 1042-1049.
14. Kadir R., Bakhrat A., Tokarsky R., et al. Localization of the Drosophila Rad9 protein to the nuclear membrane is regulated by the C-terminal region and is affected in the meiotic checkpoint // PLoS One. 2012. Vol. 7. № 5. P. E38010.
15. Brough R., Wei D., Leulier S., et al. Functional analysis of Drosophila melanogaster BRCA2 in DNA repair // DNA Repair (Amst). 2008. Vol. 7. № 1. P. 10-19.
16. Klovstad M., Abdu U., Schbpbach T. Drosophila brca2 is required for mitotic and meiotic DNA repair and efficient activation of the meiotic recombination checkpoint // PLoS Genet. 2008. Vol. 4. № 2. P. E31.
17. Boubriak I., Mason P. A., Clancy D. J., et al. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease // Biogerontology. 2009. Vol. 10. №
3. P. 267-277.
18. Saunders R. D., Boubriak I., Clancy D. J., et al. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity // Aging Cell. 2008. Vol. 7. № 3. P. 418-425.
19. Opresko P. L., Cheng W. H., von Kobbe C., et al. Werner syndrome and the function of the Werner protein; what they can teach us about the molecular aging process // Carcinogenesis. 2003. Vol. 24. № 5. P. 791-802.
20. Mao Z., Tian X., Van Meter M., et al. Sirtuin 6 (SIRT6) rescues the decline of homologous recombination repair during replicative sense cen-
ce// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. № 29. P. 11800-11805.
21. Halmosi R., Berente Z., Osz E., et al. Effect of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors on the ischemia-reperfusion-induced oxidative cell damage and mitochondrial metabolism in Lan-gendorff heart perfusion system // Mol. Pharmacol. 2001. Vol. 59. № 6. P. 1497-1505.
Статья поступила в редакцию 07.05.2014.
