CC BY
51
УДК 557. 353. 23
Вестник СПбУ. Сер. 3, 2004, вып. 2
Фролов А. А., Федорова М. А., Кулева Н. В.
ВЛИЯНИЕ КАРНОЗИНА НА ГЛИКООКИСЛИТЕЛЬНУЮ МОДИФИКАЦИЮ АКТИНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ И ГИСТОНОВ ПЕЧЕНИ КРЫС В УСЛОВИЯХ САХАРНОГО ДИАБЕТА И ПРЕДЦИАБЕТА, ИНДУЦИРОВАННЫХ СТРЕПТОЗОТОЦИНОМ
Гликоокисление - термин, используемый для описания процессов гликирования, включающих окисление. Гликирование, или неэнзиматическое гликозилирование, является посттрансляционной модификацией, представляющей собой реакции глюкозы, а-оксоальдегидов и других производных Сахаров со свободными аминогруппами белков. Образующиеся при этом фруктозамины постепенно претерпевают необратимые превращения с образованием конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ). Образование их .наблюдается при старении, болезни Альцгеймера, сахарном диабете [9].
В настоящее время показано, что сахарный диабет, проявляющийся в первую очередь повышенной концентрацией глюкозы в плазме крови, сопровождается гликоокислительной модификацией целого ряда белков организма. Такие хронические осложнения сахарного диабета, как ретинопатия, нефропатия, нейропатия и' прогрессирующий атеросклероз сопровождаются накоплением КПГГ, при этом гликоокислительной модификации подвергаются разнообразные мишени, в том числе все типы коллагена, альбумин, белки миелиновых мембран и хрусталлика глаза, липопротеины и нуклеиновые кислоты.
В то время как гликоокисление внеклеточных белков в условиях гипергликемии, связанной с сахарным диабетом, к настоящему времени хорошо изучено [14], о гликоокислительном повреждении внутриклеточных белков известно значительно меньше. Показано преимуще-ствённо гликирование белков клеточного кортекса, связанных с мембраной рецепторов, гемоглобина, растворимых белков цитозоля, а также инсулина и проинсулина. k
Необходимо отметить, что хотя в литературе имеются сведения о гликоокислении актина, этот процесс показан in vivo только в отношении немышечных форм актина [11, 22]. В лаборатории общей биохимии кафедры биохимии СПбГУ в течение нескольких лет проводится изучение гликирования актина скелетных мышц in vitro [4,18] и повреждающего действия ионизирующей радиации на ядерную ДНК, актин скелетных мышц и гистоны гепатоцитов печени in vivo [1].
Карнозин - природный дипептид, который является широко известным эндогенным ан-тиоксидантом возбудимых тканей [2]. В последнее время накапливаются сведения о его анти-гликирующем действии, проявляющемся в ковалентном взаимодействии с карбонильными группами белков и низкомолекулярных карбонильных соединений [8,16], а также генопротек-торном, в частности, радиопротекторном эффекте, показанном в нашей лаборатории [1]. Известно, что in vitro карнозин снижает гликоокисление белков, в первую очередь, за счет своего антиоксидантного действия [18]. По-видимому, в условиях сильно выраженного окислительного стресса, вызванного действием ионизирующей радиации, механизм действия карнозина тот же [1]. Представляется актуальным исследовать соотношения различных механизмов действия карнозина in vivo в менее жестких повреждающих условиях.
Исходя из вышесказанного, в работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследование гликоокислительной модификации актина скелетных мышц крыс в условиях преддиабета и диабета, влияние карнозина на этот процесс.
© Фролов А. А., Федорова М. А., Кулева Н. В., 2004
2. Исследование гликоокислительной модификации гистонов печени крыс в условиях преддиабета и диабета и влияние на нее карнозина.
Материалы и методы. Для индукции преддиабета были использованы самцы крыс линии Wistar с массой тела 125-215 г. Животные содержались по отдельности в пластиковых клетках, получали пищу и воду неограниченно. Первым двум группам крыс (п-5) внутрибрюшинно вводился раствор стрептозотоцина концентрации 45 мг/кг в виде однократной инъекции. Двум другим группам контрольных животных (л=5) был введен физиологический раствор. Первые две группы экспериментальных животных за 24 ч до инъекции стрептозотоцина получили раствор карнозина концентрации 50 мг/кг с питьевой водой, две другие - эквивалентный объем воды и использовались в качестве контроля при исследовании влияния карнозина на гликоокисление белков. Забой крыс путем декапитации производился через 48 ч и 30 дней после инъекции стрептозотоцина.
Для индукции сахарного диабета были использованы самцы беспородных лабораторных крыс, отобранные по концентрации глюкозы в!срови. Животные группами содержались в пластиковых клетках, пищу и воду получали неограниченно. Первым двум группам крыс (п=5) внутрибрюшинно вводился раствор стрептозотоцина концентрации 55 мг/кг в виде однократной инъекции. Двум другим группам контрольных животных (п=5) был введен физиологический раствор. Забой животных путем декапитации производился через 3 недели и 2 месяца после развития сахарного диабета.
Выделение актина из скелетных мышц крыс производили стандартным методом [3]. Выделение ядер гепатоцитов печени и экстракцию фракции коровых гистонов производили методом, описанным Gordon et al. [12].
Для выявления структурныу изменений белков использовали следующие показатели: содержание свободных NH2-rpynn, СО-групп, битирозиновых сшивок, конечных продуктов глубокого гликирования, пентозидинов. Количество свободных NH2-rpynn в белке определяли в ходе реакции с тринитробензолсульфонатом [15]. Определение содержания карбонильных производных осуществлялось посредством реакции с 2,4-динитрофенилгидразином [24]. Оценку изменений других параметров проводили флуоресцентными методами [10].
Оценка средних значений, стандартных отклонений и достоверности повышения концентрации глюкозы в плазме крови производилась с помощью статистического пакета Microsoft Excel для Windows 95 (версия 7.0). Оценка достоверности различий между экспериментальными и контрольными группами производилась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни [5].
Результаты и обсуждение. К настоящему времени известно, что актин является одним из внутриклеточных белков, подвергающихся гликоокислению — комплексному процессу гликирования и окисления в условиях повышения концентрации углеводов и/или дикарбонильных соединений и увеличения продукции свободных радикалов в клетке как in vitro, так и in vivo.
Известно гликоокисление немышечных и гладкомышечных изоформ актина ({3- и у-изо-форм). При инкубации белков цитоскелета нейронов с глюкозо-6-фосфатом была обнаружена гликированная форма актина. Выявленное при инкубации с глюкозо-6-фосфатом гликирова-ние актина скелетных мышц не сказывалось на его функциональных свойствах - полимеризу-емости Г-формы с образованием Ф-формы [22]. Гликоокислительные процессы, затрагивающие немышечный актин, были обнаружены также in vivo, в условиях экспериментального сахарного диабета. Так, было показано, что гликированию подвергается актин субмембранного цитоскелета клеток эндотелия [11]. Представляет интерес гликирование in vivo актина ней-рофиламентов, выполняющих в нейронах функцию аксонального транспорта, так как это белок цитозоля [22]. Аналогичным образом не удалось обнаружить изменения функциональных свойств актина цитоскелета эритроцитов человека под действием диабетического состояния [4]. Гликоокислительную модификацию ^-подобного актина мышц моллюсков изучали in vitro, и у него была выявлена большая степень такого рода изменений по сравнению с а-актином скелетных мышц [6].
Несмотря на успехи, достигнутые в изучении гликирования немышечных актинов, до сих пор гликирование и гликоокисление мышечных актинов, в частности a-актина скелетных
мышц, было выявлено только in vitro. Было показано, что гликирование актина скелетных мышц оказывает влияние на его функциональные свойства, но только при инкубации с фруктозой, а особенно - с глицеральдегидом: наблюдалось уменьшение степени активации актином миози-новой АТФазы, уменьшение полимеризуемости, увеличение связывания фосфофруктокиназы и снижение степени ингибирования ДНКазы I [18]. В той же работе была показана важность окислительной составляющей в изменении функциональных свойств актина, что было подтверждено позднее [4].
В последнее время появляются данные об окислительной модификации актина скелетных мышц in vivo. Показано, что показатели полимеризуемости и степень активации миозино-вой АТФазы снижены при действии на крыс ионизирующей радиации [1], что подтверждает высказанное предположение. Поскольку одновременно с изменениями функциональных свойств в актине были выявлены окислительные повреждения, важно выяснить, связаны ли изменения функциональных свойств актина скелетных мыШц с гликоокислением.
Наблюдаемое через 48 ч статистически достоверное повышение параметров гликиро-вания - интенсивности флуоресценции, связанной с образованием КПГГ, пентозидинов и би-тирозиновых сшивок - на 60,62, 55,05 и 46,99% по сравнению с контролем соответственно (рис. 1, А\ табл.1), в модели преддиабета соответствует повышению концентрации глюкозы в крови. Возможно, она проникает в мышечные клетки и индуцирует повреждения актина за счет аутоокисления глюкозы [17]. Малый масштаб повреждений, вероятно, объясняется незначительным повышением концентрации глюкозы. С другой стороны, этот эффект можно объяснить действием N0, образующемся при метаболизме стрептозотоцина [25], так как известно, что N0 вызывает гликоокислительную модификацию актина in vitro [6]. Реверсию этого эффекта через 30 дней после инъекции стрептозотоцина, несмотря на более заметное повышение концентрации глюкозы, можно объяснить наличием в цитоплазме мышечных клеток эндогенных антиоксидантов, в частности карнозина [2], способных предотвратить развитие окислительного стресса на ранних этапах повреждения белка. Это предположение подтверждается результатами определения карбонильных групп, содержание которых повысилось на 30,68% по сравнению с контролем через 48 ч после инъекции стрептозотоцина и вернулось к контрольному значению через 30 дней (см. рис 1, табл.1). Поскольку свободнорадикальный механизм является основным в фрагментации белка и образовании карбонильных групп [7], этот факт указывает на прекращение окислительного стресса и отсутствие развития карбонильного стресса к тридцатому дню эксперимента. Благодаря своей способности реагировать с карбонильными группами окисленных белков, именно карнозин может препятствовать развитию карбонильного стресса [8].
В модели сахарного диабета наблюдалось значительное статистически достоверное повышение показателей гликоокисления - интенсивности флуоресценции, связанной с образованием КПГГ, пентозидинов и битирозиновых сшивок - на 329,21,386,74 и 399,86% по сравнению с контролем соответственно (см. рис \,А; табл. 2), отражающее протекание гликирования, очевидно, сопровождающегося аутоокислением глюкозы [17]. Столь значительное увеличение этих параметров может быть связано со значительным увеличением концентрации глюкозы в плазме крови. Заметного увеличения содержания карбонильных групп в актине через три недели после развития сахарного диабета обнаружено не было, что указывает на отсутствие окислительной деградации белков, а следовательно, и ее основного фактора - окислительного стресса. Эти данные подтверждают результаты, полученные в модели слабо выраженной гипергликемии. Наблюдаемое через два месяца после развития сахарного диабета снижение флуоресценции, связанной с КПГГ, пентозидинами и битирозиновыми сшивками до 286,14, 226,32 и 230,97% от уровня контроля соответственно, может быть следствием протеолиза поврежденного белка [16].
Таблица 1. Параметры окислительного и гликоокислительного повреждения внутриклеточных белков - гистонов гепатоцитов печени и актина скелетных мышц крыс: контрольных (1), получивших инъекцию стрептозотоцина (2) и карнозина за 24 ч до инъекции стрептозотоцина (3) в модели слабо выраженного сахарного диабета
Белок Параметр Э^позиция $ ч Экспозиция 30 дней
1 2 3 1 2 3
Флуоресценция КПГГ, ед/мг белка . 10,36 • ±2,37 16,64 ±3,26 10,42 ±1,18 22,76 ±4,37 15,72 ±4,03 13,64 ±1,24
Флуоресценция пентозидинов, ед/мг белка 7,43 ±0,90 11,52 ±0,92 8,73 ±1,46 9,16 ±3,04 12,55 ±2,39 11,63 ±2,19
Актин Флуоресценция би- тирозиновых сшивок, ед/мг белка 10,64 ±1,29 15,64 ±1,94 12,33 ±2,61 14,54 ±4,35 16,95 ±2,37 16,34 ±3,32
Аминогруппы, мкмоль/мг белка 0,25 ±0,09 0,27 ±0,15 0,27 ±0,18 0,15 ±0,07 0,26 ±0,08 0,25 ±0,20
Карбонильные группы, нмоль/мг белка 2,64 ±0,62 3,45 ±1,52 1Д4 ±0,45 3,05 ±0,79 - 3,14 ±1,22 1,36 ±0,96
Флуоресценция КПГГ, ед/мг белка 94,00 ±0,02 108,58 ±54,90 37,51 ±13,82 92,98 ±49,18 175,83 ±71,40 756,44 ±285,24
Флуоресценция пентозидинов, ед/мг белка 127,16 ±27,17 126,08 ±50,90 45,50 ±20,62 20,15 ±13,01 21,77 ±8,71 ' 58,33 ±14,43
Гистоны Флуоресценция би- тирозиновых сшивок, ед/мг белка 148,54 ±14,55 201,48 ±80,94 102,55 ±83,20 215,79 ±102,78 232,87 ±122,09 847,32 ±274,10
Аминогруппы, мкмоль/мг белка 0,59 ±0,02 0,65 ±0,22 0,96 ±0,34 0,66 ±0,18 0,14 ±0,08 0,66 ±0,25
Примечание. Параметры анализировались через 48 ч и через 30 дней после инъекции стрептозотоцина. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Несмотря на снижение показателей гликирования, через два месяца после развития сахарного диабета наблюдается значительное статистически достоверное увеличение содержания карбонильных групп в актине на 50,51% по сравнению с контролем (см. рис. 1, А; табл. 2). Это можно объяснить истощением внутриклеточного карнозина на фоне сохраняющейся высокой концентрации глюкозы в плазме крови.
Ранее влияние карнозина на процессы гликирования и окисления актина было исследовано in vitro [18]. Было показано, что карнозин. снижает образование ковалентных белок-белковых сшивок в актине и уменьшает эффект гликирования на степень активации миозино-вой АТФазы. Было также показано, что карнозин проявляет как антиоксидантное, так и антигликирующее действие с явным преобладанием антиоксидантного [4]. Продолжением этих исследований была демонстрация радиопротекторного действия карнозина, которое проявлялось в приближений показателей активации миозиновой АТФазы и полимеризуемости р-акти-на крыс, подвергнутых у-облучению, к контрольным показателям [1].
% от контроля 600
Чти
1 2 3 4 V• 5
Рис 1. Параметры гликоокйсления'актина скелетных мышц (А) й гистонов печени (Б) крыс в моделях преддиабета через 48 ч (Г) и 30 дней (II) после инъекции стрептозотоцина и сахарного диабета , через 3 недели (III) и 2 месяца (IV) после его развития. •
1-флуоресценция, характерная для образования КПГГ, 2-флуоресценция, характерная для образования пентозидинов, 3-флуоресценция, характерная для образования битирозиновых сшивок, 4-количество карбонильных групп в % от этих показателей, наблюдаемых в контрольных группах животных; * - достоверно отличается от контрольной группы (р < 0,01) (то же для рис. 2).
Таблица 2. Параметры окислительного и гликоокислительного повреждений внутриклеточных белков - гистонов гепатоцитов печени и актина скелетных мышц крыс в модели сильно выраженного сахарного диабета
Параметр
Актин
контроль
3
недели
2
месяца
Гистоны
контроль
3
недели
2
месяца
Флуоресценция КПГГ, ед/мг белка
Флуоресценция пентозидинов, ед/мг белка
Флуоресценция битирозиновых сшивок, ед/мг белка
Аминогруппы, мкмоль/мг белка
Карбонильные
группы, мкмоль/мг белка
6,06 ±1,10
5,13 ±0,06
7,20 ±0,24
0,26 ±0,01
0,99 ±0,19
26,01 ±2,61
24,97 ±1,31
35,99 ±1,63
0,30 ±0,01
1,06 ±0,06
17,34 ±1,19
11,61 ±0,14
16,63 ±0,07
0,42 ±0,01
1,49 ±0.08
18,95 ±0,81
10,73 ±1,05
14,92 ±0,54
0,78 ±0,01
0,47 ±0,33
39,05 ±0,86
34,11 ±1,60
42,83 ±1,67
0,66 ±0,05
0,68 ±0,15
12,07 ±0,92
9,20 ±0,64
12,09 ±1,05
0,51 ±0,03
2,50 ±0,55
Примечание. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
В актине скелетных мышц животных, получивших карнозин с питьевой водой за 24 ч до инъекции стрептозотоцина, не было обнаружено изменений флуоресцентных показателей глиссирования по сравнению с контролем уже через 48 ч после инъекции стрептозотоцина (рис. 2, А; см. табл. 1). Это означает, что карнозин либо препятствует началу реакций Майар-да, ковалентно взаимодействуя с потенциальными гликируюшими агентами, в данном случае - глюкозой и продуктами ее аутоокисления, либо стабилизирует образующиеся на первых этапах гликирования фруктозамины, но так или иначе он действует в данном случае как анти-гликирующий агент [16]. Однако этот результат не исключает антиоксидантного действия кар-нозина, так как процесс аутоокисления глюкозы - потенциальный источник свободных радикалов - не требует ковалентного присоединения глюкозы к полипептидной цепи актина [17]. В пользу того факта, что эффект карнозина направлен прежде всего на взаимодействие с карбонильными группами, говорят результаты их определения, свидетельствующие о трехкратном
% от контроля
Рис 2. Параметры гликоокисления актина скелетных мышц (А) и гистонов печени (£) крыс, получивших карнозин (50 мг/кг веса) с питьевой водой за 24 ч до индукции преддиабета через 48 ч СО и 30 дней (//) поскс инъекции стрептозотоцина. •
1-флуоресценция, характерная для образования КПГГ, 2 -флуоресценция, характерная для образования пентозидинов, 3-флуоресценция, характерная для образования битирозиновых сшивок, 4-количество карбонильных групп (А) или аминогрупп (Б) в % от этих показателей, наблюдаемых в контрольных группах животных.
уменьшении содержания таковых уже через 48 ч после инъекции стрептозотоцина и крайне незначительном изменении этой величины спустя 28 дней (см. рис. 2, А\см. табл. 1). Наиболее вероятное объяснение этого факта - процесс так называемого «карнозилирования», т.е. кова-лентного взаимодействия карнозина с карбонильными группами белков [8, 16].
При сопоставлении полученных данных с результатами исследования радиопротекторного действия карнозина, проведенного в нашей лаборатории [1], видно, что доминирующий механизм действия карнозина в этих двух случаях различен. Если в условиях резкого увеличения продукции свободных радикалов, вызванного действием у-излученкя, преобладает антиоксидантный механизм действия карнозина, то в более мягких условиях слабо выраженной гипергликемии на первое место выходит его антигликирующее и «карнозилирующее» действие. *
Гистоны являются наиболее изученными в отношении гликоокислительной модификации белками клеточного ядра. Первоначально гликирование гистонов изучалось in vitrp. Так, было показано, что КПГГ образуются при инкубации гистонов с глюкозой [19], а также с другими гликирующими агентами: D-фруктозой, D-рибозой, D-глюкозо-б-фосфатом, причем было показано, что наиболее активны в этом отношении D-фруктоза и D-рибоза, а количество образующихся КПГГ зависит от концентрации гликирующего агента и времени инкубации [13]. Гликйрование гистонов (а также зависимость этого процесса от времени) было обнаружено in vivo. Но тем не менее в настоящее время нет однозначного мнения относительно агента глики-рования гистонов и механизма протекания этого процесса. В последнее время в качестве наиболее вероятного гликирующего агента рассматривается рибоза и АДФ-рибоза в качестве ее источника [9]. Основной механизм появления АДФ-рибозы в клетке заключается в пострепа-ративном распаде поли(АДФ-рибозы), образующейся под действием фермента поли(АДФ-рибоза)полимеразы при появлении протяженных однонитевых разрывов ДНК [9]. Причинами таких повреждений могут быть: действие на ДНК алкилирующих агентов, например стрептозотоцина [25], карбонильного стресса [23], а также ионизирующей радиации [1]. Другой возможный механизм повреждения гистонов - свободнорадикальный. Свободные радикалы могут образовываться не только при действии ионизирующей радиации, но и в результате повреждения ДНК при карбонильном стрессе [23] и аутоокислении моносахаридов [17]. Роль каждого из этих механизмов при стрессовых воздействиях различного рода до конца не ясна и является одним из актуальных направлений исследований.
Исследование гликирования гистонов печени крыс в модели преддиабета не выявило увеличения флуоресценции, связанной с КПГГ в целом, а также пентозидинами и битирозина-ми в частности, ни через 48 ч, ни через 30 дней после инъекции стрептозотоцина (рис. 1, Б\ см. табл. 1), несмотря на заметное, хотя и недостоверное повышение концентрации глюкозы в плазме крови. Это указывает на отсутствие гликирования в указанной модели. Из литературы известно, что даже большие концентрации глюкозы в плазме крови не вызывают гликоокислительной модификации гистонов через 28 дней [19]. Изучение содержания свободных аминогрупп гистонов показало отсутствие изменения этого параметра через 48 ч после инъекции стрептозотоцина (см. рис. 1, Б; табл. 1). Однако через 30 дней после инъекции стрептозотоцина наблюдается значительное, до 21,21% от контрольного уровня, снижение содержания свободных аминогрупп, что указывает на развитие к этому моменту окислительного стресса. Причиной развития окислительного стресса может быть образование свободных радикалов, обусловленное повреждением ДНК продуктами аутоокисления глюкозы крови [23].
В модели сахарного диабета через три недели после его развития наблюдалось значительное и статистически достоверное увеличение показателей гликоокисления гистонов - интенсивности флуоресценции, связанной с образованием КПГГ, пентозидинов и битирозино-вых сшивок - на 106,07, 217,89 и 187,06% по сравнению с контролем соответственно
(см. рис. 1 ,Б\ табл. 2). Для объяснения этого факта можно привлечь следующие соображения: 1) стрептозотоцин вызывает оксидативный стресс за счет продукции свободных радикалов не только в островковой ткани поджелудочной железы [20]. Этот его эффект может быть опосредован, например увеличением активности ксантиноксидазы, что приводит к продукции супероксид-аниона с последующим образованием Н202 и ОН- [25]; 2) значительное повышение концентрации глюкозы в плазме крови вызывает усиление ее аутоокисления и, как следствие, увеличение продукции ОН' и высоко реактивных карбонильных соединений. Карбонильные соединения гликируют гистоны и повреждают ДНК, усиливая окислительный стресс [17]; 3) в совокупности указанные факторы вызывают значительное повреждение ДНК, запуск репаративных процессов, активацию поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP), пострепаратив-ный распад поли(АДФ-рибозы) полимеразы и усиление гликирования гистонов [9]. Наблюдаемое через три недели после развития сахарного диабета снижение содержания свободных аминогрупп также свидетельствует об увеличении степени гликирования гистонов. В то же время не было отмечено значительного увеличения содержания карбонильных групп, что позволяет предположить наличие в ядре неизвестной системы, обладающей антиоксидантными и антигликирующими свойствами. В настоящее время ведется активный поиск таких веществ, и в качестве возможных вариантов рассматриваются полиамины спермин и спермидин, обладающие антигликирующими свойствами, сходными с таковыми карнозина [14]. Через два месяца после развития сахарного диабета наблюдалось снижение содержания аминогрупп до, 65,38% от контрольного уровня, достоверное как по сравнению с контролем, так и с группой, j находившейся в диабетическом состоянии в течение трех недель. В то же время наблюдалось более чем пятикратное увеличение содержания карбонильных групп (см. рис. 1, Б). Это указывает на развитие окислительного стресса [7J; возможно, вследствие исчерпания упомянутого антиоксидантного фактора. Неожиданным явилось сильное снижение флуоресцентных показателей гликоокисления гистонов. Одним из возможных объяснений этому может быть усиление обновления белков в связи с их гликоокислительным повреждением [16].
В настоящее время известно, что карнозин в физиологических концентрациях подавляет гликирование гистонов in vitro даже при использовании таких сильных гликирующих агентов, как метилглиоксаль и глицеральдегид. Несмотря на это, остается неясным, по какому именно пути осуществляется этот эффект карнозина - антиоксидантному [4] или по пути ковалентно-го взаимодействия с карбонильными группами [8]. В исследованиях радиопротекторного действия карнозина, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что карнозин уменьшает увеличенные под действием ионизирующей радиации показатели гликоокисления, как флуоресценцию, связанную с КПГГ, так и образование карбонильных групп, проявляя при этом и антиоксидантное, и антигликирующее действие [1].
В данном исследовании с использованием модели преддиабеТа в гистонах крыс, получивших карнозин с питьевой водой за 24 ч до инъекции стрептозотоцина, 48 ч спустя наблюдалось снижение показателей гликоокисления - интенсивности флуоресценции, связанной с образованием КПГГ, пентозидинов и битирозиновых сшивок - на 65,45; 63,91 и 49,10% по сравнению с животными, не получавшими карнозин соответственно (рис. 2,Б), статистически достоверное в случае общей фракции КПГГ и пентозидинов. Одним из вероятных механизмов действия карнозина в данном случае представляется его ковалентное взаимодействие с карбонильными соединениями, что приводит к временному замедлению (связанного с возрастом) накопления КПГГ [16]. С другой стороны, наблюдается явление замедления окислительных процессов, которое проявляется в увеличении содержания аминогрупп на 47,70% по сравнению с контролем в гистонах через 48 ч после инъекции стрептозотоцина (см. рис. 2, Б\ табл. 1). Это указывает на антиоксидантный механизм действия карнозина, так как активные формы кислорода - основной источник окислительных повреждений белка [7]. Через 28 дней содер-
жание аминогрупп в гистонах становится на 371,43% выше, чем у животных, не получавших карнозин (см. рис. 2, Б; табл.1) и соответствует таковому у интактных животных, что подтверждает временный характер действия карнозина. Через 30 дней после инъекции стрептозото-цина все флуоресцентные показатели гликирования значительно возрастают по сравнению с контролем (см. рис. 2). Отсутствие изменений в содержании аминогрупп позволяет предположить роль энзиматического гликозилирования в этом явлении. При сопоставлении полученных данных с результатами предыдущих исследований, проводимых на кафедре биохимии СПбГУ, видно, что при воздействии слабо выраженной гипергликемии, так же как и при воздействии у-излучения, карнозин проявляет в отношении гистонов как антиоксидантное, так и антигликирующее действие.
Таким образом, гпикоокисление актина наблюдалось и в модели сахарного диабета, и преддиабета, и было более выражено в первом случае. Гликоокисление гистонов наблюдалось только в модели сахарного диабета. Карнозин предотвращал гликоокисление актина скелетных мышц крыс в условиях преддиабета. Также карнозин снижал степень гликоокисления гистонов печени крыс по сравнению как с животными, не получавшими карнозин, так и с интактным контролем. Полученные данные указывают на важную роль процессов собственно гликирования в развитии гликоокислительной модификации актина и гистонов, а также подтверждают предположение о важности карнозина как фактора, снижающего карбонильный стресс в клетке.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым.
Работа поддержана грантом «Университеты России-2003 У Р. 11.01.017». Summary
FrolovA. A., Fedorova М. A., Kuleva N. V. The effect of carnosine on glycoxidation of skeletal muscle actin and hepatic histones in conditions of diabetes and prediabetes induced with streptozotocin.
Glycoxidation of skeletal muscle actin and hepatic histones in models of streptozotocine induced diabetes and prediabetes and the effect of histidine dipeptide carnosine on this process were investigated. Glycoxidation of both proteins was observed. Carnosine was shown to decrease glycoxidation of actin and histones demonstrating its antioxidant and antiglycation action.
Литература
1. Бакланова M. Ю., Залесова 3. С., Федорова М. А. и др. Механизмы модификации внутриклеточных белков при гипергликемии и действии ионизирующей радиации // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 2002. Сер. 3. Вып. 3. № 19. С. 24-31. 2. Болдырев А. А. Карнозин. Изд-во Моск. ун-та, 1998. 3. Иванов И. И., Юрьев В. А. Биохимия и патобиохимия мышц. Л., 1961. 4. Кулева Н. В., Залесова 3. С. Исследование неэнзиматического гликозилирования и окислительного повреждения актина in vitro и in vivo // Цитология. 2000. Т. 42. С. 66-71. 5. Лакин Г. Ф. Биометрия. М., 1990. 6. Федорова М. А., Кулева Н. В. Сравнение структурно-функциональных свойств актина мышц моллюска Муа arenaria и скелетных мышц кролика. Вестн. С.-Петерб. ун-та. 2002. Сер. 3. Вып. 4 (№ 27). С. 132-136.7. Berlett B.S., Stadtman Е. R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, N 33. P. 20313-20316.8. Brownson C.¡ HipkissA. R. Carnosine reacts with a glycated protein //Metabolism. 2000. Vol. 49. P. 9-13. 9. Cervantes-Laurean D., Jacobson E. L„ Jacobson M. K. Glycation and glycoxidation of histones byADP-ribose// J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, N 18. P. 10461-10469.10. Davies K. J., Delsignore U. E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, N 20. P. 9908-9913. 11. Ghitescu L. D., Gugliucci A., Dumas F. Actin and annexins I and II are among the main endothelial plasmalemma-associated proteins forming early glucose adducts in experimental diabetes // Diabetes. 2001. Vol. 50, N 7. P. 1666-1674.12. Gordon I. S„ RosenfeldB. A., Kaufman A. et al. Evidence for a quantitative tissue-specific distribution of the high-mobility group
chromosomal proteins//Biochemistry. 1980. Vol. 19. P. 4395-4400.13. GugliucciA. Advanced glycation of rat liver histone octamers: an in vitro study // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 203, N 1. P. 588— 593. 14. GugliucciA, Menini T. Circulating advanced glycation peptides in streptozotocin-induced diabetic rats: evidence for preferential modification of IgG light chains // Life Sci. 1998. Vol. 62, N 23. P. 2141-2150. 15. Habeeb A. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid // Analyt. Biochem. 1966. Vol. 14. P. 328-336. 16. Hipkiss A. R. Carnosine and protein carbonyl groups: a possible relationship // Biochemistiy (Moscow). 2000. Vol. 65. N 7. P. 771-779.17. Hunt J. V, Dean R. T„ WolffS. P. Hydroxyl radical production and autoxidative glycosylation // Biochem J. 1988. Vol. 256. P. 205-212. 18. Kuleva N. V, Kovalenko Z. S. Change in the functional properties of actin by its glycation in vitro // Biochemistry (Moscow). 1997. Vol. 62, N 10. 1119-1123.19.LitchfieldJ., LetsingerJ., HaighB. etal. Non-enzymatic glycation of plasma and cellular proteins in a short term STZ-diabetic rat model // Diabetologia. 1998. Vol. 41. №1.20. LubecB., HermonM., HoegerH., LubecG. Aromatic hydroxylation in animal models of diabetes mellitusb // Faseb. J. 1998. Vol. 12. P. 1581-1587. 21. Monnier V. M, Vshwanath V, Frank K. E. Relation between complications of I diabetes and collagen-linked fluorescence 11 New England J. Med. 1986. Vol. 314. P. 403-408.22. Pekiner C., Cullum N. A., Hughes J. N. et al. Glycation of brain actin in experimental diabetes // J. Neurochem. 1993. Vol. 61. P. 436-442. 23. Roberts M. J., Wondrak G. T., Laurean D. C. et al. DNA damage by carbonyl stress in human skin cells // Mutat. Res. 2003. Vol. 522, N 1-2. P. 45-56.
24. Stadtman E. R., Levine R. L. Protein oxidation //.Annu. N. Y. Acad. Sci. 2000. Vol. 97 P. 190-207.
25. Szkudelski T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas // Physiol. Res. 2001. Vol. 50. P. 536-546.
Статья поступила в редакцию 14 декабря 2003 г.
