CC BY
37
УДК 619:616-091.8:636.52/58 Е.Г. Турицына
ВЛИЯНИЕ ИНДУКТОРА ЭНДОГЕННОГО ИНТЕРФЕРОНА «ПРОВЕСТ» НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ КУР
Изучено морфофункциональное состояние органов иммунной системы кур при применении препарата «Провест», являющегося индуктором эндогенного интерферона. Выявлено его положительное влияние на пролиферацию кортикальных лимфоцитов тимуса, развитие интенсивной плазмоцитарной реакции в фабрициевой бурсе и селезенке.
Ключевые слова: препарат «Провест», куры, морфология, тимус, фабрициевая бурса, селезенка.
Ye.G. Turitsyna ENDOGENOUS INTERFERON INDUCTOR «PROVEST» INFLUENCE ON MORPHOFUNCTIONAL CONDITION OF THE HEN IMMUNE SYSTEM ORGANS
Morphofunctional condition of the hen immune system organs at "Provest" preparation application which is an endogenous interferon inductor is studied. Its positive effect on thymus cortical lymphocyte proliferation, intensive plasma cell specific reaction development in bursa of Fabricius and spleen is revealed.
Key words: "Provest" preparation, hens, morphology, thymus, bursa of Fabricius, spleen.
Индукторы интерферона представляют собой самостоятельный класс гетерогенных по составу высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, объединенных способностью вызывать в клетках и организме в целом синтез собственных, или эндогенных, интерферонов [3]. Наиболее активными продуцентами интерферона являются иммунокомпетентные клетки, широко распространенные в организме и формирующие центральные и периферические органы иммунной системы.
Препараты, созданные на основе двуспиральных и однонитевых нуклеиновых кислот (дсРНК и онРНК), не только «включают» систему синтеза интерферона, но и выступают в качестве регуляторов всей цитокиновой сети, оказывают на иммунную систему поликлональное модулирующее действие [3-4]. В последние годы был сделан важный шаг вперед в понимании процессов взаимодействия нуклеиновых кислот с клетками. Установлено, что нуклеиновые кислоты контактируют на поверхности клеток с Toll-like рецепторами, которые относятся к семейству интерлейкин 1-рецепторов. При этом рецепторами для дсРНК являются белки TLR3 и TLR9, а для онРНК - TLR7 и TLR8 [7-8].
Механизм действия дсРНК и онРНК универсален, что объясняет факты их широкого испытания в различных областях медицины, в том числе в онкологии и при патологии иммунной системы. В то же время препараты на основе нуклеиновых кислот до сих пор не нашли своего применения в ветеринарной медицине. Имеются единичные сообщения об испытаниях дсРНК в качестве иммуномодуляторов и стимуляторов неспецифической резистентности в животноводстве, свиноводстве и птицеводстве [2; 5-6]. Сведения о влиянии дсРНК на гистоархитектонику органов иммунной системы животных и птиц в научной литературе отсутствуют.
Целью исследований явилось изучение влияния индуктора эндогенного интерферона «Провест» на морфофункциональное состояние органов иммунной системы кур. «Провест» представляет собой комплекс натриевых солей однонитевых и двуспиральных рибонуклеиновых кислот, полученных из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae с добавлением поливинилпирролидона, обеспечивающего его пролонгированное действие.
Материалы и методы исследований. Научно-производственные испытания «Провеста» были проведены на птицефабрике «Заря» Красноярского края и на кафедре анатомии и гистологии животных Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. В одном из производственных цехов птицефабрики сформировали три группы суточных цыплят яичного кросса «Родонит-2»: одну контрольную и две опытные. Цыплятам первой опытной группы вводили препарат в дозе 10 мкг/гол., второй опытной группы - в дозе 20 мкг/гол., контрольная птица не получала препарат.
«Провест» перед введением растворяли в разбавителе для сухих вирусвакцин против болезни Марека и вводили его внутримышечно в область бедра полуавтоматическим инъектором ИП-1 одновременно с вакциной
в дозе 0,2 мл. Обработку цыплят производили в условиях инкубатория, перед посадкой в цех выращивания. Контролем служила вакцинированная птица того же возраста, не обработанная данным препаратом.
Материалом для исследований служили тимус, фабрициевая бурса и селезенка. Материал отбирали от 5 голов цыплят каждой группы в суточном, 7-, 14-, 21-, 30-, 45-дневном возрасте. Готовые парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Бёмера или Эрлиха и эозином, на соединительную ткань - по Маллори, Ван Гизону и Футу. Полисахаридные соединения в тканях выявляли по Крейбергу. Плазматические клетки дифференцировали при окраске срезов метиловым зеленым и пиронином в по Браше [1]. Для оценки антителостимулирующих эффектов «Провеста» сопоставляли данные об интенсивности плазмоцитарной реакции с результатами иммунологического мониторинга поствакцинального иммунитета в реакциях ИФА и РЗГА, полученными в лаборатории птицефабрики.
Морфометрические исследования органов включали определение их абсолютной и относительной массы. В тимусе находили соотношение коркового и мозгового вещества (индекс коры); плотность лимфоцитов в условном поле зрения коры и медуллы; количество митозов в верхней зоне коры на 1000 зарегистрированных клеток (митотический индекс); количество и размеры телец Гассаля.
В фабрициевой бурсе измеряли диаметр и площадь лимфатических фолликулов, плотность лимфоцитов в корковом и мозговом веществе, степень развития интерфолликулярной соединительной ткани и её клеточный состав, особое внимание уделяли развитию плазмоцитарной реакции. При её оценке подсчитывали суммарное количество плазматических клеток в 30 полях зрения интерфолликулярной и субэпители-альной соединительной ткани при иммерсионном объективе. На поперечном срезе селезенки определяли количество и размеры лимфатических фолликулов и клеточный состав красной пульпы. Морфометрические исследования проводили с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15х и окулярной сетки Г.Г. Автандилова Достоверность обнаруженных межгрупповых морфометрических отличий оценивали с использованием
1-критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение. Исследование тимуса показало, что за 1,5 месяца наблюдений его абсолютная масса увеличилась у всех экспериментальных птиц в 18-20 раз (Р<0,001), а относительная - в 1,3-1,7 раза (Р<0,01). Статистически значимые межгрупповые отличия данных показателей зафиксировали на седьмые сутки между контрольной и 2-й опытной группой (Р<0,05). У птицы, обработанной «Провестом» в дозе 10 мкг/гол. (1-я группа), наблюдалась тенденция к повышению абсолютной массы органа на 30-е и 45-е сутки жизни.
Комплекс морфологических и морфометрических исследований позволил выявить, что у птицы, обработанной препаратом, соотношение корковой и мозговой зоны (индекс коры) был выше показателей контрольной группы практически во все периоды исследований. Достоверные межгрупповые отличия зафиксировали на 7-е, 14-, 21- и 45-е сутки (рис. 1).
Рис. 1. Соотношение коркового и мозгового вещества (индекс коры) тимуса цыплят в эксперименте,
усл. ед. (*- Р<0,05; **- Р<0,01)
У 7-суточной птицы 2-й группы индекс коры превысил показатели контроля на 21,4% (Р<0,05); у двухнедельной птицы 1-й группы - на 18,9% (Р<0,05); у трехнедельных цыплят 1-й группы - на 14,9% (Р<0,05), а
2-й группы - на 24,8% (Р<0,01); у 45-суточной птицы 1-й группы - на 15,09% (Р<0,05).
Митотическая активность лимфоцитов верхних слоев корковой зоны тимуса под влиянием «Провеста» значительно возросла. Достоверную разницу между группами установили на 7-е, 14- и 21-е сутки (рис. 2).
□ 10 мкг/гол.
□ 20 мкг/гол.
□ КОМ I роль
7сутки 14сутки 21сутки
Рис. 2.. Митотический индекс лимфоцитов тимуса у экспериментальной птицы,
усл. ед. (*- Р<0,05; **- Р<0,01)
У семисуточных цыплят 2-й группы митотический индекс превысил показатели контрольной группы на 54,2% (Р<0,05); у двухнедельных цыплят 1-й опытной группы - на 37,5% (Р<0,05); у трехнедельной птицы 1-й группы - на 29,3% (Р<0,05), а 2-й группы - на 43,9% (Р<0,01).
Важным показателем функциональной активности тимуса является плотность заполнения лимфоцитами коркового и мозгового вещества. У суточной птицы в условном поле зрения коры обнаружили 108,6±2,98 клеток, мозговой зоны - 29,3±1,51 клеток. С возрастом градиент плотности лимфоцитов в коре и медулле увеличился во всех группах, однако у цыплят, обработанных «Провестом», этот процесс протекал наиболее интенсивно. Достоверные межгрупповые отличия зафиксировали на 7-е, 14- и 21-е сутки. У семисуточных цыплят 2-й группы показатель превысил контрольные данные на 9,23% (Р<0,05); у двухнедельной птицы 1-й группы - на 9,08% (Р<0,05); у трехнедельного молодняка кур 2-й группы - на 5,59% (Р<0,05). Максимальное количество лимфоцитов в условном поле зрения коры тимуса наблюдали на 30-е сутки у всей экспериментальной птицы.
В мозговой зоне тимуса достоверную разницу плотности клеток между контрольной и опытной птицей зафиксировали на 14-е и 21-е сутки. У двухнедельных цыплят 1-й опытной группы разница с контролем составила 33,89% (Р<0,05), у 21-суточной птицы 2-й опытной группы - 25,36% (Р<0,05).
Скопления эпителиальных клеток в медулле формировали единичные вакуоли, содержимое которых при окраске по Крейбергу давало умеренную положительную реакцию на кислые гликозаминогликаны. Под влиянием «Провеста» секреция кислых гликозаминогликанов незначительно понижалась.
В мозговом веществе тимуса суточных цыплят встречали единичные тельца Гассаля, размеры которых не превышали 7,92±0,31 мкм. В течение первых двух недель эксперимента количество телец в тимусе опытной птицы было меньше, чем у контрольных цыплят. Достоверную межгрупповую разницу установили на 14-е сутки: в 1-й группе она составила 20,25% (Р<0,05), во 2-й группе - 35,44% (Р<0,01). К концу первого месяца наблюдений в опытных группах произошел резкий подъем содержания тимических телец. Они были мелкими, интенсивно оксифильными, гомогенного вида. В 1-й группе разница с контролем составила 52,7% (Р<0,01), во 2-й группе - 29,11% (Р<0,05). Размеры телец колебались от 8 до 15,5 мкм. Самые мелкие тельца встречали в тимусе суточного молодняка, наиболее крупные - у 30-суточной птицы.
Абсолютная масса фабрициевой бурсы за 45 суток наблюдений увеличилась в 11,3-15,5 раза (Р<0,001). Значительные колебания массы органа наблюдали у птицы трехнедельного возраста. В этот период на вскрытии встречали бурсы крупного размера массой до 1,0-1,2 г с набухшими гиперемированными складками, обильной слизью в полости. Подобные изменения органа, на наш взгляд, являлись реакцией на антигенную стимуляцию против инфекционной бурсальной болезни. У птицы, обработанной «Про-вестом», наблюдалась тенденция повышения массы фабрициевой бурсы. Однако вследствие значительных индивидуальных колебаний достоверная разница с контролем была зафиксирована вещества тимуса (указаны стрелками). Возраст 21 сутки,
только у 45-суточного молодняка кур 1-й 2-я опытная группа. Гематоксилин. *1000
опытной группы (Р<0,05).
Относительная масса фабрициевой бурсы значительно колебалась в течение всего периода наблюдений. За первые три недели она увеличилась в 2,85 раза у птицы 1-й группы, в 3,96 - во 2-й группе, в 4,05 раза в - контроле (Р<0,001). У 30-суточной птицы относительная масса бурсы сократилась во всех группах в 1,7-2,5 раза по сравнению с предыдущим возрастом и только к 1,5-месячному возрасту наметилась тенденция к ее росту. В этот период во всех группах регистрировались случаи резкого снижения абсолютной и относительной массы фабрициевой бурсы, что расценивалось нами как проявление иммунопатологического состояния.
Морфологические исследования показали, что у суточных цыплят складки фабрициевой бурсы содержали мелкие лимфатические фолликулы округлой или овальной формы, их площадь в среднем составила 7154,9±682,7 мкм2. С возрастом у всей экспериментальной птицы количество и размеры фолликулов увеличились. Максимальные показатели были зафиксированы у 30-суточной птицы. Они превысили данные суточных цыплят в 19,3 раза в 1-й группе, в 20,4 раза - во 2-й группе и в 18,5 раза - в контрольной группе (Р<0,001). Достоверные межгрупповые отличия площади лимфофолликулов установили на 7-е и 21-е сутки (Р<0,05). К 1,5-месячному возрасту размеры фолликулов бурсы во всех группах значительно сократились, в них появились признаки кистозного или железистого перерождения.
Определение суммарного содержания плазматических клеток в 30 полях зрения интерфолликулярной и субэпителиальной соединительной ткани фабрициевой бурсы показало значительный рост их количества у всех экспериментальных цыплят, что явилось закономерной реакцией на антигенные стимуляции. Максимальное содержание плазмоцитов было зафиксировано на 30-е сутки наблюдений. У птицы 1-й группы количество плазмоцитов за 30 суток увеличилось в 20,1 раза по сравнению с исходным состоянием и составило 132,6±7,18 клеток (Р<0,001), у птицы 2-й группы - в 22,3 раза и достигло 147,2±6,39 клеток (Р<0,001), у цыплят контрольной группы - в 17,9 раза и составило 118,2±6,19 клеток (Р<0,001). К концу наблюдений, несмотря на продолжающиеся антигенные стимуляции, интенсивность плазмоцитарной реакции снизилась во всех группах. Межгрупповые отличия были статистически значимы на 14-, 21- и 30-е сутки эксперимента (рис. 4).
Следует отметить, что в первую неделю после введения «Провест» вызвал кратковременное подавление плазмоцитарной реакции в бурсе, о чем свидетельствовало незначительное отставание показателей опытной птицы от контрольных величин. Так, при дозе препарата 20 мкг/гол. разница с контролем составила 6,5%, при дозе 10 мкг/гол. - 4,3%.
Исследование абсолютной массы селезенки показало, что за 1,5 месяца наблюдений орган увеличился в 1-й группе в 65 раз, во 2-й группе - в 71, в контрольной группе - в 53 раза (Р<0,001). Достоверные межгрупповые отличия наблюдали на 7-е и 45-е сутки. У 7-суточных цыплят 2-й группы контрольные показатели
были превышены на 46,7% (Р<0,01); у 45-суточной птицы 1-й группы - на 22,29%, 2-й группы - на 33,43% (Р<0,05). Относительная масса органа увеличилась за период наблюдений в 4-5 раз (Р<0,001). Достоверное превышение контрольных показателей зафиксировали у 7-суточной птицы 2-й группы (Р<0,05) и у 1,5месячного молодняка первой (Р<0,01) и второй группы (Р<0,05).
Рис. 4. Суммарное содержание плазматических клеток в 30 полях зрения интерфолликулярной и субэпителиальной соединительной ткани фабрициевой бурсы цыплят в эксперименте (* - Р<0,05)
Морфологические исследования показали отсутствие оформленных лимфатических фолликулов на поперечном срезе селезенки суточных цыплят. Белая пульпа представлена небольшими по площади рыхлыми полями малых лимфоцитов. Импрегнация серебром по Футу выявила нежную сеть аргирофильных волокон, образующих строму органа.
Среди клеток красной пульпы у суточной птицы преобладали эритроциты (28,9±2,35%) и лимфоциты (24,9±1,18%). Значительное место занимали гранулоциты (14,8±1,34%). Наряду со зрелыми гранулоцитами встречали молодые клетки со слабосегментированными ядрами бобовидной, овальной или палочковидной формы и объемной оксифильной, слабозернистой цитоплазмой. Относительное содержание ретикулоцитов составило 13,4±1,02%, макрофагов - 10,4±0,75, фибробластов - 6,44±0,50%. Самыми редкими клетками были плазмоциты, их содержание составило 1,1±0,28%. С возрастом у всех цыплят сократилось содержание эритроцитов, гранулоцитов, ретикулярных клеток и фибробластов, но увеличился уровень лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов.
Обработка птицы «Провестом» вызвала повышение относительного уровня лимфоцитов в опытных группах. Достоверную разницу с контролем установили на 7-е и 14-е сутки при дозе препарата 20 мкг/гол. (Р<0,05), при этом содержание лимфоцитов колебалось в пределах 37-38%.
ш в Плазмоцитарная реакция в селезенке
цыплят в первую неделю после обработки ' «Провестом» была достоверно ниже, чем в контрольной группе (Р<0,05). Однако на 14-, 21- и 30-е сутки содержание плазмоцитов 9 было достоверно выше показателей кон-| трольной группы (Р<0,05). Максимальную интенсивность плазмоцитарной реакции зафиксировали у 30-суточной птицы, обработанной «Провестом» в дозе 20 мкг/гол. (19,7±1,23%).
Поскольку плазматические клетки являются продуцентами антител, нами было проведено сравнение данных об интенсивности плазматической реакции в фабрицие-вой бурсе и селезенки с результатами серологических исследований напряженности поствакцинального иммунитета. Сопоставление показало отсутствие прямой зависимости между уровнем титров антител и сум-
4.
щ
ж
Рис. 5. Плазматические клетки (указаны стрелками) в красной пульпе селезенки. Возраст 21 сутки. Гематоксилин-эозин. *1000
марным содержанием плазмоцитов в фабрициевой бурсе. Так, у 15-суточных цыплят 1-й группы средние по-ствакцинальные титры антител против инфекционного бронхита были выше контрольных показателей в 2,29 раза (Р<0,001), а во 2-й группе - в 1,89 раза (Р<0,01); против инфекционной бурсальной болезни в 1-й группе они были выше, чем в контроле, на 5,33%, во 2-й группе - на 14,1%; против ньюкаслской болезни - на 15,4 и 19,8% соответственно. В то же время количество плазмоцитов в бурсе и селезенке было выше данных контрольной группы только на 10-30%.
Выводы
1. Индуктор эндогенного интерферона «Провест» вызывает морфофункциональные изменения в органах иммунной системы кур, характеризующиеся микроструктурной перестройкой, особенностями цитохимических параметров и сдвигами клеточного состава в тимусе, фабрициевой бурсе и селезенке.
2. «Провест» стимулирует пролиферацию кортикальных лимфоцитов тимуса, обусловливая высокий уровень их митотической активности, что сопровождается повышением плотности клеток в корковом и мозговом веществе; подавляет формирование тимических телец в первые две недели после введения.
3. «Провест» вызывает кратковременное подавление плазмоцитарной реакции в фабрициевой бурсе и селезенке в первые дни после введения с последующей ее активизацией. Высокие титры поствакциналь-ных антител у птицы, обработанной препаратом, свидетельствуют не столько об усилении пролиферации и дифференциации плазмоцитов, сколько о стимуляции биосинтетических процессов в антителообразующих клетках.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомической практики. - М.: РМАПО, 1994. - 505 с.
2. Влияние разных форм природных РНК на иммунный ответ / Ю.С. Аликин [и др.] // Достижения современной биотехнологии: сб. науч. тр. - Новосибирск, 2008. - C. 92-103.
3. Григорян С.С. Индукторы интерферона: итоги и перспективы // Интерферону - 50 лет: мат-лы науч.-прак. конф. - М., 2007. - С. 66-72.
4. Ершов Ф.И. Пять десятилетий интерферона // Интерферону - 50 лет: мат-лы науч.-практ. конф. - М., 2007. - С.11-18.
5. Пролонгированный вестин для профилактики и терапии при инфекционных болезнях поросят / С.И. Прудников, А.А. Духовский, Т.М. Прудникова [и др.] // Ветеринария. - 2008. - № 6. - С. 18-21.
6. Понюхов В.А. Рациональные схемы применения пробиотиков и иммуномодуляторов на основе РНК и их противоэпизоотическая эффективность в промышленном птицеводстве: автореф. дис. ... канд. вет. наук. - Новосибирск, 2006. - 23 с.
7. Соколова Т.М. Интерфероны, дсРНК и вирусы (история изучения и эволюция взглядов) // Интерферону - 50 лет: мат-лы науч.-практ. конф. - М., 2007. - С. 81-92.
8. Toll-like receptor 3: a link between toll-like receptor, interferon and viruses / M. Matsumoto, K. Funami, H. Oshiumi [et al] // Microbiol. Immunol. - 2004. - Vol. 48. - № 3. - Р. 147-154.
