CC BY
100
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 579.083.13
A. Б. Маргулис, А. Р. Курбангалиева, Н. В. Белоногова, Л. З. Латыпова,
B. Я. Пономарев, Э. Н. Хакимуллина, Е. Ю. Тризна, М. И. Богачев, А. Р. Каюмов
ВЛИЯНИЕ ХЛОРПРОИЗВОДНЫХ 2(5Я)-ФУРАНОНА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Ключевые слова: 2(5Н)-фураноны, токсичность, ферментативная активность, прокариоты.
Исследовано влияние хлор- и серосодержащих производных 2(5Н)-фуранона на клетки грамположительных бактерий. Показано, что 5-гидрокси-4-[(4-метилфенил)сульфанил]-3-хлор-2(5Н)-фуранон в концентрации 1 мкг/мл значительно подавляет рост клеток бацилл. Снижение активности глутаминсинтетазы в клетке позволяет сделать вывод, что одной из клеточных мишеней этого соединения является азотный метаболизм.
Keywords: 2(5Н)-/игапопез, toxicity, enzymatic activity, prokaryotes.
The effect of chlorine- and sulfur-containing 2(5H)-furanones to the cells of gram-positive bacteria is studied. 3-Œloro-5-hydroxy-4-[(4-methylphenyl)sulfanyl]-2(5H)-furanone in a concentration of 1 mcg / ml significantly inhibits cell growth of Bacilli. Reduced activity of glutamine synthetase in the cell leads to the conclusion that one of the cellular targets of this compound is nitrogen metabolism.
Введение
За последние годы значительно участились случаи возникновения и развития инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, при этом большинство инфекционных заболеваний вызывают грамположительные бактерии [1]. Действие используемых в настоящее время антибиотиков обладает разной эффективностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, так как у первых резистентность к антибиотикам развивается намного быстрее [2]. Это обуславливает необходимость разрабатывать новые антибактериальные препараты, которые бы эффективно подавляли рост и развитие грамположительных бактерий. На роль таких лекарственных средств претендуют
галогенированные фураноны [3].
Ранее было показано, что бромированные фураноны из морской водоросли Delisea pulchra оказывают подавляющее действие на чувство кворума у грамотрицательных бактерий [4]. Фуранон воздействует на видоспецифичный [5] и невидоспецифичный аутоиндукторы AI-I (неацилированные гомосеринлактоны) и AI-II соответственно, замедляет роение клеток и подавляет образование биопленок, не воздействуя при этом на рост клеток [6]. При этом рост грамположительных бактерий в присутствии фуранона замедляется при его концентрациях, не токсичных для клеток млекопитающих, что делает эти соединения весьма перспективными лекарственными препаратами [7, 8]. В то время как действие фуранонов на грамотрицательные бактерии хорошо изучено, механизмы подавления роста грамположительных бактерий почти не изучены [9]. Вероятно, фураноны воздействуют на какой-либо плейотропный регуляторный белок, регулирующий уровень азотного, углеродного,
фосфорного или энергетического обмена клеток B.subtilis [3, 10]. Тем не менее, известны некоторые мишени фуранонов в клетках грамположительных микроорганизмов. Это развитие генетической компетенции (т.е. природная способность поглотить чужеродную ДНК) у Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae [11].
В данной работе был синтезирован ряд хлор- и серосодержащих 2(5Я)-фуранонов и исследовано их действие на клетки грамположительных бактерий.
Материалы и методы исследования
Мы исследовали действие ряда хлорированных фуранонов (Рисунок 1) на рост грамположительных бактерий B.subtilis и Staphylococcus aureus.
5-Гидрокси-3,4-дихлор-2(5Я)-фуранон (мукохлорную кислоту, Ф1) (Шосткинский завод химических реактивов, Украина)
перекристаллизовывали из воды, т.пл. 127°С. 5-Гидрокси-4-[(4-метилфенил)сульфанил]-3-хлор-2(5Я)-фуранон (Ф2) [12] и 5-[(4-метилфенил)сульфонил]-3,4-дихлор-2(5Я)-фуранон (Ф3) [13] синтезированы по известным методикам.
O O
3
H OH
Cl
Cl
з
Рис. 1 - Структурные формулы тестируемых фуранонов 1-3
Для культивирования бацилл использовали синтетическую среду SMM [14], 100 мл которой включает (мл): солевой основы (95,75), L-триптофана (1), микроэлементов (1), глюкозы (1.25) и источник азота как указано в работе [15]. Состав составляющих растворов: солевая основа, г/л: K2HPO4 • 3H2O - 18.34; KH2PO4 (безводный) - 6.0; MgSO4 • 7H2O - 0.2; цитрат Na • 3H2O - 1; L-триптофан - 5 мг/мл; KNO3 - 202 г/л; NH4Cl - 107 г/л; Д-глюкоза - 40%; микроэлементы, г/л: CaCl2 -0.55; FeCl2 • 6H2O - 1.35; MnCl2 • 4H2O - 0.1; ZnCl2 - 0.17; CuCl2 • 2H2O - 0.043; CoCl2 • 6H2O - 0,06; Na2MnO4 • 2H2O - 0.06. Культивирование бактерий проводили в колбах объёмом 100 и 250 мл при соотношении объёма среды к объёму колбы 1:7.5 на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 37°С. Посевным материалом служил 24-часовой инокулят, выращенный на среде SMM, содержащей 20 мМ KNO3 и 4 мМ NH4Cl .
Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (ОП590) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на планшетном спектрофотометре TEKAN infinite F200 PRO при длине волны 600 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1см кювете, равное единице. Количество биомассы выражали в единицах оптической плотности.
Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин. Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Tris-HCl буфере, рН 9,0. Культуру Bacillus subtilis JB20-36 выращивали 22-24 часа на богатой питательной среде. Бопт. (590нм) составила 0,2 ед. Затем культуру центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин. 1мл супернатанта инкубировали 5 мин на водяной бане при 37°С. То же самое проделывали с 1 мл казеина. Затем казеин приливали к супернатанту и тщательно перемешивали. Смесь из 1 мл казеина и 1мл супернатанта инкубировали 15 мин при 37°С, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ, перемешивали и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через плотный фильтр. Отбирали 1 мл фильтрата и добавляли к нему 5 мл 6% Na2CO3 и 1 мл 0,6н реактива Фолина. Смесь ставили на 20-30 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 630 нм на спектрофотометре СФ-34. Параллельно ставили контроль на субстрат следующим образом: смешивали 1 мл супернатанта и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 370С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. Смесь фильтровали. С фильтратом поступали, как описано выше. За единицу активности фермента принимали его количество, вызвавшее увеличение оптической плотности при длине волны 630 нм на 1 единицу за 1 час. В опытных образцах на этапе отделения супернатанта в инкубационную смесь вносили фураноны в исследуемых концентрациях.
Клеточный экстракт готовили с модификациями метода [15]. Вкратце, 15 мл культуры центрифугировали в течение 3 мин при 8 тыс.об/мин. Осадок ресуспендировали в 400 мкл буфера DB (50 мМ трис-HCl, pH 7.4, 50 мМ KCl, 0.5 мМ PMSF, и 0.1 мг/мл лизоцима) и инкубировали 20 минут при 37°С. Затем суспензию подвергали пятикратной обработке на ультразвуковом дезинтеграторе УЗД2 в течение 20 секунд ультразвуком с частотой 22 кГц. Суспензию снова центрифугировали в течение 1 минуты при 13 тыс. об/мин для удаления остатков клеточной стенки и неразрушенных клеток.
Активность глутаминсинтетазы определяли по [16]. В реакционную смесь, содержащую 0.4 мл двухкратного буфера RM (50 мкМ имидазола, 45 мкМ гидроксиламина, 81 мкМ глутамата натрия, 27 мкМ MgCl2x6 H2O, pH 7,3), вносили 50 мкл клеточного экстракта и доводили объем смеси до 0.8 мл дистиллированной водой. Затем полученную смесь инкубировали 5 минут при 370С и вносили 10 мкл АТФ до конечной концентрации в растворе 1.5 мкМ. Смесь инкубировали 90 минут при 370С, реакцию останавливали внесением 1мл буфера SM (55 г/л FeCl3x6H2O, 20 г/л трихлоруксусной кислоты, 31 мл 6М HCl). Реакционную смесь инкубировали 5 минут при комнатной температуре и центрифугировали 5 мин при 6 тыс. об/мин. Замеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм на TEKAN infinite F200 PRO. Активность глутаминсинтетазы рассчитывали по формуле: ОП540
Активность = _x 1.67 х 1000
[Сб ] x t x Т
где [Сб ] = концентрация белка; t = время реакции в мин; Т = толщина кюветы в см; 1.67 - коэффициент экстинкции; 1000 - коэффициент пересчета в нмоль; активность = нмоль / мин * мг белка Активность глутаминсинтетазы выражали ее в условных единицах на общее количество белка в экстракте, определенное по методу Мэрион Брэдфорд [17].
Влияние хлорированных фуранонов на жизнеспособность бацилл
Ранее было показано, что концентрация фуранонов 5 мкг/мл подавляет рост бактерий в 2 раза [3]. Мы начали наши исследования с определения действия фуранонов на рост клеток бацилл в условиях лимитации по источнику азота. Для этого ночную культуру клеток B.subtilis 168, выращенную на среде SMM с 4 мМ аммонием в качестве источника азота, рассевали в среды SMM с 20 мМ нитратом натрия в качестве источника азота и концентрациями исследуемого фуранона 1, 2.5, 5 мкг/мл. Клетки культивировали 6 часов до достижения контрольной культурой (выращенной на среде без содержания фуранона) поздней стационарной фазы роста (ОП590=0.8). Затем инкубирование прекращали и замеряли оптическую плотность культуры.
На рис. 2 показан рост клеток B.subtilis 168 в поздней стационарной фазе роста в присутствии фуранонов в % от контроля, которым служила культура на среде без фуранона.
ОПбОО, в % от контроля
120 и
100 80 60 40 20
Й
т ЛЙ
fil
I
0,1 0,25 0,5 1 2,5 5
Концентрация фуранона в среде, мкг/мл
Рис. 2 - Влияние тестируемых фуранонов 1-3 на рост клеток B.subtilis на синтетической среде SMM в условиях лимитации по источнику азота. Контролем служили клетки, выращенные на среде, не содержащей фуранон
При концентрации фуранона Ф1 1 мкг/мл уже наблюдалось подавление роста бактерий в 2 раза по сравнению с контролем. Фуранон Ф2 рост клеток подавлял в 2 раза при концентрации 2.5 мкг/мл. Фуранон Ф3 выраженным бактериостатическим действием в исследованных концентрациях не обладал.
Ранние исследования показали, что эффект фуранонов на клетки бактерий зависит от среды культивирования и доступности основных источников питания [3]. Поэтому мы провели тот же эксперимент в условиях достатка по основным источникам питания. Для этого ночную культуру клеток B.subtilis 168, выращенную на среде SMM с 4 мМ аммонием в качестве источника азота, рассевали в среды SMM с 20 мМ хлорида аммония в качестве источника азота и концентрациями исследуемого фуранона 1, 2.5, 5 мкг/мл. Как и на среде с нитратом натрия, фураноны Ф1 и Ф2 подавляли рост бактерий в 2 раза при концентрациях 1 и 2,5 мкг/мл, в то время как фуранон Ф3 действия не оказывал.
Таким образом, фураноны Ф1 и Ф2 могут представлять интерес в качестве
бактериостатического средства.
Влияние хлорированных фуранонов на внеклеточную ферментативную активность бацилл
Мы оценивали способность исследуемых фуранонов изменять активность общего пула внеклеточных секретируемых протеаз B. subtilis JB20-36 in vitro. Добавление фуранонов Ф1 и Ф3 непосредственно в реакционную смесь не привело к изменению активности фермента, что означает отсутствие эффекторных свойств исследуемых соединений по отношению к данному ферменту (Рисунок 2).
Активность, в % от контроля
120
Л
100 80 60 40 20 0
f
Й
ffll
гЬ
контроль 0,1 1 10
Концентрация фуранона в среде, мкг/мл
Рис. 3 - Влияние тестируемых фуранонов 1-3 на активность протеазы В. ^20-36.
Контролем служили образцы без добавления фуранона
В то же время фуранон Ф2 незначительно снижал активность внеклеточной протеазы в концентрации 10 мкг/мл (рисунок 3). Таким образом можно заключить, что фураноны не оказывают влияния на внеклеточную протеолитическую активность бактерий, являющуюся одним из факторов патогенности грамположительных микроорганизмов [18].
Влияние хлорированных фуранонов на внутриклеточную ферментативную активность бацилл
Также выясняли влияние фуранонов на общий обмен веществ бактерий. Одним из ключевых внутриклеточных ферментов является
глутаминсинтетаза (ГС), которая в клетках бактерий осуществляет АТР-зависимый синтез глутамина из глутамата и аммония. Поскольку глутамин является основным компонентом азотного метаболизма микробной клетки, регуляция активности и синтеза ГС в клетке подвержена строгому контролю, который позволяет сохранить количество фермента на необходимом уровне при разных условиях роста. Мы исследовали активность ГС в экстракте клеток, выращенных в присутствии фуранонов.
Ночную культуру клеток В^иЬиШ 168 разводили средой 8ММ с 20 мМ нитратом натрия таким образом, чтобы получить культуру с ОП590=0.2. В опытные колбы вносили фуранон до конечных концентраций 1, 2.5, 5 мкг/мл, при которых проявлялся бактериостатический эффект (см рисунки 2). Клетки культивировали до достижения контрольной культурой ОП590=0.8, что соответствует поздней стационарной фазе роста, затем собирали центрифугированием в течение 3 мин при 8000 об/мин. и определяли в них активность глутаминсинтетазы.
На рис. 4 показано влияние фуранонов Ф1 Ф2 и Ф3 на активность глутаминсинтетазы в клетках бацилл.
1
2
3
0
Активность, % от контроля
120% 100% 80% Н 60% 40% -20% -0%
i
Контроль 1.0 2,5 5.0
Концентрация фуранона в среде, мкг/мл
Рис. 4 - Влияние фуранона 2 на активность глутаминсинтетазы в клетках штамма B.subtilis 168 in vivo (А) и in vitro (Б). Контролем служили клетки, выращенные на среде, не содержащей фуранон
Наши данные показали, что фуранон Ф1 не подавляет активность глутаминсинтетазы в клетках при концентрации до 5 мкг/мл и выше. Чтобы проверить действие этого химического вещества на саму молекулу фермента, в экстракт контрольных клеток вносили фуранон до конечных концентраций 1, 2.5, 5 мкг/мл и замеряли уровень активности глутаминсинтетазы. Внесение фуранона также не вызывало снижения активности фермента (не приведено). Это позволяет констатировать, что фуранон Ф1 не подавляет фермент глутаминсинтетазу в клетках бацилл.
Напротив, фуранон Ф2 подавляет активность глутаминсинтетазы в клетках при концентрации 2.5 мкг/мл и выше. Чтобы проверить действие этого химического вещества на саму молекулу фермента, в экстракт контрольных клеток также вносили фуранон до конечных концентраций 1, 2.5, 5 мкг/мл и замеряли уровень активности глутаминсинтетазы. Внесение фуранона также вызывало незначительное снижение активности фермента, которое, однако, было достоверным только при концентрации фуранона 5 мкг/мл. Следовательно, фуранон Ф2 подавляет фермент глутаминсинтетазу в клетках бацилл. Фуранон Ф3 не вызывал подавления активности глутаминсинтетазы ни в клетках, ни в условиях in vitro.
Таким образом, наши исследования показали, что фуранон Ф2 (5-гидрокси-4-[(4-метилфенил)сульфанил]-3-хлор-2(5Я)-фуранон) в низких концентрациях, а именно 1 мкг/мл, значительно подавляет рост клеток бацилл. Снижение активности глутаминсинтетазы в клетке позволяет сделать вывод, что одной из клеточных мишеней этого соединения является азотный метаболизм. Однако молекулярные механизмы этого влияния остаются пока не выясненными и требуют дальнейших исследований.
Ранее нами также были получены данные, свидетельствующие о вариабельности гидрофобных свойств поверхности грамположительных бактерий
(Bacillus subtilis и Staphylococcus epidermidis) и о том, что гидрофобность клеточной поверхности при обработке бактерий ауторегуляторами усиливается у грамотрицательных и снижается у
грамположительных [19, 20]. Аналогичные исследования планируются и для регуляторов, представленных в статье.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК№ 14.B37.21.0175).
Литература
1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis / M. B. Edmond, S. E. Wallace, D. K. McClish, M. A. Pfaller, R. N. Jones, R. P. Wenzel // Clinical Infectious Diseases. - 1999. - P. 239-244.
2. Jones, R. N. Antimicrobial spectrum and potency of dalbavancin tested against clinical isolates from Europe and North America (2003): initial results from an international surveillance protocol / R. N. Jones, T. R. Fritsche, H. S. Sader, B. P. Goldstein // J. Chemother. - 2005. - V. 6 - P. 593-600.
3. Ren, D. Differential Gene Expression To Investigate the Effect of (5Z)-4-Bromo-5-(Bromomethylene)-3-Butyl-2(5H)-Furanone on Bacillus subtilis / D. Ren, L. A. Bedzyk, P. Setlow, D. F. England, S. Kjelleberg, S. M. Thomas, R. W. Ye, T. K. Wood // Applied and environmental microbiology. - 2004. - P. 4941-4949.
4. Bassler, B. L. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing / B. L. Bassler // Curr. Op. Microbiol. - 1999. - V. 2. - P. 582-587.
5. Manefield, M. Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein / M. Manefield, R. de Nys, N. Kumar, R. Read, M. Givskov, P. Steinberg, S. Kjelleberg // Microbiology. - 1999. - V. 145. - P. 283-291.
6. Ren, D. Inhibition of biofilm formation and swarming of Escherichia coli by (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)- 3-butyl-2(5H)-furanone / D. Ren, J. J. Sims, T. K. Wood // Environ Microbiol. - 2001. - V. 3. - P. 731-736.
7. Kjelleberg S. Inhibition of gram positive bacteria / S. Kjelleberg, P. D. Steinberg, C. Holmstrom // International patent WO 99/53915l - 1999.
8. Kuehl, R. Furanone at subinhibitory concentrations enhances staphylococcal biofilm formation by luxS repression / R. Kuehl, S. Al-Bataineh, O. Gordon, R. Luginbuehl, M. Otto, M. Textor, R. Landmann // Antimicrob Agents Chemother. - 2009. - V. 53. - P. 41594166.
9. Ren, D. Inhibition of biofilm formation and swarming of Bacillus subtilis by (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone / D. Ren, J. J. Sims, T. K. Wood // Lett Appl Microbiol. - 2002. - V. 34. - P. 293-299.
10. Yeo, W. H. Phellinone, a new furanone derivative from the Phellinus linteus KT&G PL-2 / W. H. Yeo, E. I. Hwang, S. H. So, S. M. Lee // Arch Pharm Res. - 2007. - V. 30. - P. 924-926.
11. Solomon, J. M. Who's competent and when:regulation of natural genetic competence in bacteria / J. M. Solomon, A. D. Grossman // Trends Genet. - 1996. - P. 150-155.
12. Kurbangalieva, A. R. Synthesis of novel arylthio derivatives of mucochloric acid / A. R. Kurbangalieva, N. F. Devyatova, A. V. Bogdanov, E. A. Berdnikov, T. G. Mannafov, D. B. Krivolapov, I. A. Litvinov, G. A.
Chmutova // Phosphorus, Sulfur, Silicon, Relat. Elem. -
2007. - V. 182. - P. 607- 630.
13. Латыпова, Л. З. Синтез и строение новых сульфонов и сульфоксидов 2(5Я)-фуранонового ряда / Л. З. Латыпова, А. Р. Курбангалиева, О. А. Лодочникова, Е. А. Бердников, Г. А. Чмутова // Материалы XI Молодежной конф. по органической химии (Екатеринбург, 23-29 ноября 2008 г.). - Екатеринбург. -
2008. - С. 135-138.
14. Anagnostopoulos, C. Requirements for transformation in bacillus subtilis / C. Anagnostopoulos, J. Spizizen // J. Bacteriol. - 1961. - V. 81. - P. 741-746.
15. Kayumov, A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolisis / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology. - 2008. - V. 154. - P. 2348-2355.
16. Patterson, J. A. Glutamine synthetase activity in the ruminal bacterium Succinivibrio dextrinosolvens / J. A. Patterson, R. B. Hespell // Appl Environ Microbiol. - 1985. - V. 50. - P. 1014-1020.
17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.
18. Каюмов, А.Р. Сравнительный анализ структуры белковых токсинов водных патогенных микроорганизмов / А. Р. Каюмов, М. И. Богачев, Е. О. Михайлова // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2011. - № 7. - С. 175-180.
19. Евтюгин, В.Г. Гидрофобизованные производные широкопористого криогеля поливинилового спирта: новые возможности применения в биотехнологии / В.Г.Евтюгин, А.Б.Маргулис, О.В.Бушманова, Е.В.Никитина, А.И.Колпаков, Л.Г.Дамшкалн, В.И.Лозинский, О.Н.Ильинская // Вестник Казанского технол. ун-та.- 2010.- №9.- С. 89-96.
20. Евтюгин, В.Г. Электронно-микроскопическое исследование морфологических изменений клеток кишечной палочки в условиях голодового стресса / В. Г. Евтюгин, А. Б. Маргулис, О. Н. Ильинская, М.К.Кадиров // Вестник Казан. технол. ун-та.- 2011.-№12.- С.167-171.
© А. Б. Маргулис - канд. биол. наук, дрц. каф. микробиологии К(П)ФУ, anna.margulis@ksu.ru; А. Р. Курбангалиева - канд. хим. наук, доц. каф. органической химии К(П)ФУ, almira99@mail.ru; Н. В. Белоногова - асп. каф. микробиологии К(П)ФУ; Л. З. Латыпова - асп. каф. органической химии К(П)ФУ; В. Я. Пономарев - канд. техн. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; Э. Н. Хакимуллина - канд. биол. наук, дрц. каф. микробиологии К(П)ФУ; Е. Ю. Тризна - студ. К(П)ФУ; М. И. Богачев - канд. техн. наук, доц. каф. радиосистем С- Петербургского госуд. электротехнического ун-та, rogex@yandex.ru; А. Р. Каюмов - канд. биол. наук, асс. каф. генетики К(П)ФУ.
