CC BY
267
УДК 579.222; 579.6 ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БАКТЕРИЙ
РОДА янооососст НА деградацию н-гексадекана
И.А. Нечаева, Т.М. Лыонг,В.Э. Сатина, О.Н.Понаморёва
Установлена зависимость процесса биодеградации гидрофобных субстратов (на примере н-гексадекана) от способности бактерий рода Rhodococcus выделять в культуральную среду биосурфактантыгликолипидной природы и от степени гидро-фобности клеточной поверхности микроорганизмов-деструкторов. Показано, что по мере накопления трегалолипидов в культуральной среде (238 и 268 мг/л после 6 суток культивирования) происходит уменьшение гидрофобности клеточной поверхности штаммов R.erythropoHsX5 и R.eryt:hropoHsS6Z Степень деградации н-гексадекана для S67 и X.5 составила 89 % и 81 %, соответственно.
Ключевые слова: биосурфактанты, трегалолипиды, Rhodococcus, гидрофоб-ность, биодеградация, н-гексадекан
1. Введение
В настоящее время бактерии рода Rhodococcusпривлекaют внимание исследователей, вследствие их широкого практического применения в биоремедиации окружающей среды от ксенобиотиков, повышении нефтеотдачи почвенных пластов, очистке сточных вод от нефтепродуктов. Данному факту способствуют уникальные биологические, физиологические и биохимические особенности этой группы микроорганизмов. Широкий спектр метаболических возможностей обуславливает способность родококков трансформировать и деградировать разнообразные по химической структуре углеводороды (алифатические, ароматические, нитроароматические, поли- и гетероциклические) и их производные (пестициды, полихлорированные бифенилы, фенолы, нитрилы) [1]. Родококкам свойственны циклический характер развития и наличие морфогенетических переходов «кокк-палочка-кокк». Причём в первые часы роста образуется нестабильный мицелий, не имеющий перегородок и представляющий собой одну клетку. За счёт последующей фрагментации клеточного мицелия на короткие палочковидные формы увеличивается отношение клеточной поверхности к общему объёму клетки, что повышает способность родококков поглощать трудноусваиваемый гидрофобный субстрат [2].
Кроме того, клеточная стенка бактерий данной группы в силу своей липофильности имеет высокое сродство к гидрофобным субстратам и представляет собой мощное липофильное образование, подобного которому нет у других бактерий [3]. Большое значение имеет содержание в ней липидов, которые играют ведущую роль в процессе потребления углеводородов. Также в клеточной стенке нокардиоформных
микроорганизмовсодержатся простые жирные кислоты, гликолипиды, корд-фактор и его аналоги, фосфолипиды, нейтральные липиды. Помимо липидов клеточная стенка родококков включает в себя миколовые кислоты,которые являются специфическими и обязательными структурными компонентами клеточных стенок ряда бактерий, таких как Rhodococcus sp., Mycobacterium sp., Nocardiasp, Pseudonocardiasp .идр\4\.
Способность утилизировать труднодоступные субстраты бактериями рода Rhodococcusпроисходит также благодаря образованию биологических поверхностно-активных веществ (биоПАВ или биосурфактантов) гликолипидной природы, которые способствуют солюбилизации и эмульгированию гидрофобных субстратов.
Вышеперечисленные особенности родококков, в сочетании со способностью выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды, обуславливают перспективность их использования при разработке биопрепаратов для очистки территорий и акваторий, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами.
Целью данной работы являлось выяснение влияния гидрофобности клеточной поверхности бактерий рода Rhodococcus и их способности образовывать биосурфактанты гликолипидной природы на степень деградации н-гексадекана в жидкой минеральной среде.
2. Материалы и методы исследования
Штаммы микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти.
Штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis S67 и Rhodococcus erythropolis X5 входят в состав биопрепарата «МикроБак», который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий [5].
Питательныесреды и условия культивирования. Микроорганизмы культивировали в жидкой минимальной минеральной среде Эванса [6] и полноценной среде Лурия-Бертани [7]. Готовые среды стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин. при 120°С. Инокулирование колб проводили суспензией микроорганизмов, выращенной на среде Лурия-Бертани в течении 24 часов. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл на орбитальной качалке (при 26°С, п=180об/мин) в течение 6 суток в присутствии н-гексадекана (2 %по объему) как единственного источника углевода и энергии.
Определение гидрофобности клеточной поверхности. Гидрофобность определяли по МАТН-тесту (Microbial Adherence to Hydrocarbon) с модификациями [8, 9]. После 6 суток культивирования родококков в условиях, описанных выше, содержимое колб центрифугировали в течение 10 мин., при 12000^на центрифугеTG16WS («Поликом» Россия). Клеточную биомассу дважды отмывали дистиллированной водой и ресуспендировали в фосфатно-магниевом
буфере (рН=7,0), так чтобы значение оптической плотности (ОПбООнм) клеточной суспензии всех образцов было в пределах 0,48 - 0,50. К 3,0 мл клеточной суспензии добавляется 0,5мл н-гексадекана. Содержимое пробирок интенсивно встряхивали в течение 3 минут и оставляли для разделения фаз на 10мин при температуре 37оС. Аккуратно пипеткой отбирали 3 мл нижней водной фракции и измеряли ее оптическую плотность при 600нм. Степень адгезии клеток рассчитывают по формуле: Н( %)=(1- ОП1/ОП0)*100 %, где ОП0, ОП1 - оптическая плотность клеточной суспензии до и после добавления н-гексадекана соответственно. В качестве контрольного образца использовали буферный раствор вместо суспензии клеток.
Определение содержания гликолипидных
биосурфактантов.Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров в бесклеточном супернатанте колориметрическим методом с использованием фенольного реактива по методике [10]. Стандартом служил раствор трегалозы.
Определение н-гексадекана в культуральной среде методом газовой хроматографии. Для определения гексадекана методом газовой хроматографии использовали газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором Кристалл 5000.2 (СКБ Хроматэк, Россия) . Условия хроматографирования были следующими:
газохроматографическая капиллярная колонка:
80ЕАпа1уйса18шепсе:о11еОССарШагуСо1итпВР1 108 30м*0,3 мм *0,53 мкм; температура термостата — 250°С; температура испарителя (инжектора) — 300°С. инжектор с делением потока - коэффициент деления потока 1:1. детектор ионизации в пламени (ДИП): температура детектора — 200 — 250°С; расход воздуха — 18 дм /ч; расход водорода — 1,8 дм /ч; скорость потока газа-носителя — 17,4 см /мин объем пробы — 1 мм3.
Исследуемый образец экстрагировали н-гексаном в стеклянной делительной воронке емкостью 250 мл в течение 5 мин при интенсивном встряхивании содержимого воронки. После расслоения жидкостей отбирали верхнюю фазу. В испаритель (инжектор) вводили 1 мм образца экстракта и осуществляли хроматографическое разделение. Регистрировали пики в области времени удерживания, соответствующие компонентам градуировочной смеси. По полученным хроматограммам рассчитывали концентрацию гексадекана с использованием градуировочной зависимости (зависимость площади пика от концентрации гексадекана).Порядок выхода пиков представлен на рис. 1.
После расслаивания жидкостей слой н-гексана, содержащий
mV «
извлеченные НП
U
гексадекан
время. мин.
Рис. 1. Хроматограммагексадекана, растворитель гексан
3. Результаты и их обсуждение
Начальным этапом биодеградации гидрофобных субстратов, в частности алифатических углеводородов, является их поступление в микробные клетки. Способность к поглощению углеводородных соединений тесно связана с особенностями строения и метаболической организации углеводородокисляющих бактерий. В процессе окисления углеводородов важную роль играет прямой контакт клеток с субстратом, поэтому способность или неспособность микроорганизмов поглощать углеводороды зависит от состава и строения клеточной стенки и, в первую очередь, определяется присутствием гидрофобной клеточной поверхности [3, 11].Гидрофобность клеточной поверхности микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти Rhodococcus erythropolis S67и Rhodococcus erythropolis X5 определяли с помощьюМATH-теста на протяжении 6 суток культивирования с использованием н-гексадекана в качестве гидрофобного субстрата. Наибольшее значение гидрофобности клеточной поверхности составляло 63 % для R. erythropolis S67 и 67 %R. erythropolis X5 после 2 суток культивирования. В работе Рубцовой [12] показана зависимость гидрофобности клеточной поверхности от ростового субстрата и от видовой принадлежности бактерий рода Rhodococcus. Представители R. opacus, R. rhodochrous и R. ruber проявляют высокую (75-90 %) адгезивную активность при культивировании как в присутствии углеводорода, так и без него. Для представителей видов R. erythropolis, R. fascians и R. longus средние показатели клеточной адгезии при использовании глюкозы в качестве источника углерода не превышали 55 %, тогда как культивирование в присутствии н-гексадекана способствовало значительному (до 30 %) повышению адгезивной активности. По-видимому, присутствие углеводорода в среде
культивирования способствует повышению степени гидрофобности клеточной поверхности у представителей данных видов родококков. В нашей работе получены сопоставимые результаты по гидрофобности клеточной поверхности для вида Шойососсш егуйгоро/и(рис.2).
Рис. 2. Содержание трегалолипидов в бесклеточном супернатанте (1) и гидрофобность клеточной поверхности (2) при культивировании микроорганизмов Я. егуШгороШ Х5 (а) и Я. егуШгороШ 867 (б)
на н-гексадекане
Известно, что родококки при культивировании на гидрофобных субстратах продуцируют в культуральную среду биосурфактанты гликолипидной природы, а именно трегалолипиды [13]. Содержание трегалолипидов, выделяемых R. erythropolis S67 и R. erythropolis Х5в культуральную среду, было максимальным после 6 суток культивирования и составило 268 и 238 мг/л, соответственно. По мере накопления биосурфактантов происходит уменьшение гидрофобности клеточной поверхности данных микроорганизмов (рис. 2). Полученные результаты показывают взаимосвязь между гидрофобностью клеточной поверхности и образованием биосурфактантов. В работе [14] показано уменьшение гидрофобности клеточной поверхности бактерий рода Gordoniaс 60 до 2 % при обнаружении в культуральной среде биосурфактантов. Полученные нами результаты и данные других авторов согласуются с гипотезой о том, микроорганизмы, образующие биосурфактанты, способны изменять свои поверхностные свойства [15]. Следует отметить, что у штамма S67 в меньшей степени происходит снижение гидрофобности клеточной поверхности (с 61 % до 38 %), чем у штамма Х5 (с 54 % до 14 %), в то время как оба этих микроорганизма продуцируют в культуральную среду практически одинаковое количество трегалолипидов (268 и 238 мг/л, соответственно). Таким образом, на изменение гидрофобности клеточной поверхности родококков оказывает влияние не только образование биосурфактантов, но и особенности строения их клеточной стенки, содержащей липиды. Известно [16, 11, 10], что при росте R. rhodochrous и R. ruber на средах с жидкими и газообразными н-алканами индуцируется избыточный синтез липидных компонентов клеточной стенки, что способствует гидрофобизации клеточной поверхности. Мы можем предположить, что у изучаемых нами родококков при культивировании на н-гексадекане количество образуемых липидов клеточной стенки будет различаться. Такое различие в физиологическом поведении углеводородокисляющих родококков интересно для дальнейшего изучения.
В результате продуцирования биосурфактантов происходит эмульгирование гидрофобного субстрата, который становится более доступным для микробных клеток и как следствие этого ускоряется процесс биодеградации. Для выяснения зависимости убыли н-гексадекана от содержания гликолипидных биосурфактантов проводили определение остаточного содержания н-алкана газохроматографическим методом. На протяжении 6 суток культивирования происходит постепенное потребление н-гексадекана штаммами R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67, что выражается в уменьшении процентного содержания углеводорода в культуральной среде до 0,23 и 0,37 %, соответственно. В работе [17] деградация 1 % гексадекана Rhodococcussp. NJ2, P. aeruginosaPSA5 и O. intermedium составила 81 %, 50 % и 23 %, соответственно. Способность
бактерий рода Rhodococcus к росту на среде, содержащей длинноцепочечные алканы от Сю до С36, изучали в работе [18]. В результате проведённых кинетических экспериментов доказали, что R. opacusR7 с большей скоростью деградирует н-алканы с меньшим числом углеродных атомов, а именно 88 % С12, 69 % С16, 51 % С2о, 78 % С24. Таким образом, полученные нами результаты по деградации н-гексадекана согласуются с литературными данными, что демонстрирует способность бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 эффективно деградировать гидрофобный субстрат (89 и 81 %, соответственно).
Заключение
Бактерии-деструкторы углеводородов нефти R. erythropolis S67 и R. erythropolis X5- компоненты биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных территорий, являются эффективными продуцентами гликолипидных биосурфактантов при росте в жидкой минеральной среде на н-гексадекане и обладают гидрофобной клеточной стенкой. Вышеперечисленные физиологические особенности микроорганизмов рода Rhodococcus при росте на н-гексадекане способствуют потреблению данного субстрата, так как эффективность биодеградации на прямую зависит от способности микроорганизмов поглощать гидрофобный субстрат.
Список литературы
1. Серебренникова М. К., Тудвасева М. С., Куюкина М. С. Биологические способы очистки нефтезанрязнённых сточных вод (обзор) // Вестник Пермского университета. 2015. Вып. 1. №10. С. 15-30.
2. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Анохин Б.А. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях среды // Вестник Пермского университета. 2007. Вып. 5. №10. С. 107-112.
3. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1996. №6. С. 579-585.
4. Гоголева О.А., Немцева Н.В. Углеводородокисляющие микроорганизмы природных экосистем // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал). 2012. №2. С. 1-7.
5. Патент 2378060 РФ.Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами,способегополученияиприменения/ A.E. Филонов [и др.] // Опубл.10.01.2009.Бюл.№1.
6. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat //Meth Microbiol.1970.V.2. P.277-327.
7. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonasputida // Appl. Microbiol.1975. V.30. Р.1046-1053.
8.Methods for investigating biosurfactants and bioemulsifiers: a review / S.K.Satpute, A.G.Banpurkar, P.K.Dhakephalkar et al // Crit Rev Biotechnol. 2010. V. 30. №2. P.127-144.
9. Rosenberg M. Bacterial adherence to hydrocarbons: a useful technique for studying cell surface hydrophobicity// FEMS Microbiology. 1984. V.22. P. 289-295.
10. Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. №3. P. 350-356.
11. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Рычкова И.М. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков // Микробиология. 2000. №1. С. 62-69.
12. Рубцова Е.В., Куюкина М.С., Ившина И.Б. Влияние условий культивирования на адгезивную активность родококков в отношении н-гексадекана // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т.48. №. 5. С. 501-509.
13. Production and application of tregalose lipid biosurfactants / A.Franzetti, I.Gandolfi, G.Bestetti et al// Eur J Lipid Sci Technol. 2010. V. 112. P.617 - 627.
14. Franzetti A., Bestetti G., Caredda P. Surface-active compounds and their role in the access to hydrocarbons in Gordonia strains // FEMS Microbiol Ecol. 2008. №63. P. 238-248.
15. Ron E., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants// Environ Microbiol. 2001.V.3.N4. P. 229-236.
16. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие) : дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.07. Пермь, 1997. 197 с.
17. Mishra Sh., Singh S.N. Microbial degradation of n-hexadecane in mineral salt medium as mediated by degradation enzymes // Bioresource Technology. 2012. №111. P. 148-154.
18. Biodegradation of variable-chain-length n-alkanes in Rhodococcus opacus R7 and the involvement of an alkane hydroxylkase system in the metabolism / J.Zampolli, E.Collina, M.Lasagni et al // AMB Express. 2014. V.4. №73. P. 2-9.
Лыонг Тхи Мо, аспирант, luongmo@,mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Нечаева Ирина Александровна,канд. биол. наук, доц., nechaeva1902@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Понаморёва Ольга Николаевна, д-р хим. наук, зав. кафедрой, olgaponamoreva@mail.ru, Россия, Тула,Тульский государственный университет,
Сатина Валерия Эдуардовна,магистрант, lerysya-93@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
INFLUENCE OF THE PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE BACTERIA GENUS RHODOCOCCUS ON THE DEGRADATION
N-HEXADECANE
I. A. Nechaeva, T.M. Luong, V. E. Satina, O.N. Ponamoreva
Abstract: The dependence of the process of biodegradation of hydrophobic substrates (for example, n-hexadecane) on the ability of Rhodococcusbacteria secrete into the culture medium glycolipid biosurfactant and the degree of hydrophobicity of the cell surface of microorganisms-destructors. It was shown that the accumulation in the culture medium trehalose lipids (238 и 268 mg /1 after 6 days cultivation) decreases hydrophobicity of the surface of the cell strains R. erythropolis X5 and R erythropolisS67. The degree of degradation n-hexadecane for X5and S67 was 89 % and 81 %, respectively.
Keywords: biosurfactans, trehalolipids, Rhodococcus, hydrophobicity, biodegradation, n-hexadecane
Luong Thi Mo, graduate student, liiongmo a mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Nechaeva IrinaAleksandrovna, candidate of biological sciences, associate professor, nechaeva1902@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, head of department, olgaponamoreva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Satina Valerya Eduardovna, graduate student, lerysya-93@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University
