CC BY
54
2005 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА.. Сер. 3. Вып.
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
Е. Р. Тараховская, Ю. И. Мас.чов
ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ И ТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
FUCUS VESICULOSUS И EU G LENA GRACILIS
Водоросли характеризуются большим разнообразием строения и функционирования ассимиляционных систем, в частности, фотосинтетического аппарата. Наиболее заметны различия в пигментном составе, определяющие оптические свойства водорослей и их экологические предпочтения. У разных таксономических и экологических групп водорослей присутствуют специфические пути повышения интенсивности фотосинтетических процессов, включая наличие разных типов рибулезо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Ру-биско) - ключевого фермента цикла Кальвина и формирование COi-концентрирующих механизмов [5, 21]. В связи с этим большой интерес представляет изучение возможных факторов, регулирующих формирование и свойства фотосинтетического аппарата различных групп водорослей.
F. vesiculosus - широко распространенный представитель бурых водорослей (Phaeo-phyta), относится к выделяемой рядом авторов сборной группе Chromophyta, для которой характерен светособираюший комплекс, содержащий хлорофиллы «а» и «с», p-каротин и большое разнообразие специфических ксантофиллов. У фукуса пузырчатого основными ксантофиллами являются фукоксантин и виолаксантин, в небольших количествах могут присутствовать также зеаксантин, антероксантин и мутатохром; помимо p-каротина встречаются следы а- и г-каротинов [11, 13, 25]. Хлорофилл «с» представлен двумя спектрофо-тометрически трудно разделяемыми формами: «С|» и «с?», обычно соотношение «ci»/«c2» у бурых водорослей составляет от 1 до 2 [13].
Предполагается, что структурная единица светособирающей антенны фукусовых водорослей включает 10 молекул фукоксантина, 1 молекулу виолаксантина, 3 молекулы хлорофилла «с» и 13 молекул хлорофилла «а», связанных с одной молекулой белка. На базе семи таких структур образуются супрамолекулярные комплексы [17].
Е. gracilis (Euglenophyta), подобно зеленым водорослям и высшим растениям, имеет светособираюший комплекс, состоящий из белковых компонентов, ассоциированных с хло-рофиллами «а» и «Ь» и рядом каротиноидов [24]. Однако в отличие от зеленых водорослей, у эвгленовых относительно низкое содержание хлорофилла «Ь», и основными ксантофиллами являются диадиноксантин и диатоксантин [10, 13], также присутствуют зеаксантин, неоксантин и следы эхиненона, 3-гидроксиэхиненона и кантаксантина [13].
Эвгленовые, как и фукусовые водоросли, считаются растениями светового типа, осуществляющими фотосинтез по С3-пути [15, 20, 27]. Однако у F. vesiculosus обнаружены некоторые процессы, напоминающие С4-фотосинтез высших растений, в частности, фикси-
© Е. Р. Тараховская, Ю. И. Маслов, 2005
ровалась значительная активность ФЕП-карбоксикиназы. Возможно, малат и аспартат могут накапливаться в качестве внутриклеточного органического запаса С02, который используется в условиях низкой концентрации углекислоты или повышенного содержания кислорода [18]. Фукусовые не обладают высокой чувствительностью к повышенному содержанию 02 и имеют относительно низкое значение углекислотного компенсационного пункта. Как правило, такие ' параметры характерны для растений, использующих С02-концентрирующий механизм. Вероятно, увеличение концентрации углекислого газа в зоне действия Рубиско осуществляется на базе использования НС03~, содержание которого в морской воде значительно превышает содержание С02, и работы карбоангидразы [15].
В настоящее время у водорослей и цианобактерий выделяют 4 различных типа Рубиско [5]. Большинство растений имеет Рубиско 1типа (четвертичная структура L8S8 - фермент состоит из 8 больших и 8 малых субъединиц). Эвгленовые водоросли (как и зеленые водоросли, высшие растения и большая часть цианобактерий) имеют форму фермента 1а зеленого типа; для хромофитных водорослей (включая F. vesiculosus) характерна другая форма Рубиско -1 красного типа [5,14, 30].
Е. gracilis штамм Z хорошо растет как в автотрофных условиях (на минеральной среде), так и в миксотрофной культуре. Эта водоросль усваивает широкий спектр органических субстратов: глюкозу, этанол, ацетат, сукцинат, жирные кислоты и т. д. [23]. В качестве запасного питательного вещества эвглена накапливает 1,3-(3-глюкан парамилон.
Основным продуктом фотосинтеза и субстратом дыхания фукуса является маннит, а также, в меньших количествах, аланин, аспартат, глутамат и малат. В качестве запасных питательных веществ накапливаются ламинарии, маннит и глицерин [9, 20]. Взрослые растения, по-видимому, не способны усваивать экзогенные органические субстраты. Однако можно предположить, что эти вещества просто не могут проникнуть в организм с хорошо развитой тканевой структурой и плотными клеточными стенками [12]. В настоящее время нет никаких данных о влиянии трофических факторов на зиготы или ранние эмбрионы F. vesiculosus, которые могут оказаться более проницаемыми.
Цель настоящего исследования - изучение влияния двух типов экзогенных факторов (гормональные и трофические) на содержание основных фотосинтетических пигментов и Рубиско в клетках Е. gracilis и 2-клеточных эмбрионах F. vesiculosus.
В качестве объектов исследования использовали зиготы и 24-часовые эмбрионы фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.) и культуру микроводоросли Euglena gracilis штамм Z. Зиготы и эмбрионы фукуса были получены из материала, собранного в районе Морской биологической станции СПбГУ (Белое море) в июле-сентябре 2002-2004 гг. Получение гамет и оплодотворение осуществляли в основном по стандартной методике [3, 26]. Культура Е. gracilis получена из коллекции микроводорослей лаборатории микробиологии Би-НИИ СПбГУ (CALU-520). До начала экспериментов эвглену выращивали в автотрофной культуре при температуре 25 °С и освещенности 4 000 Лк.
В ходе экспериментов в среду культивирования добавляли: индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), кинетин, абсцизовую кислоту (АБК), гибберелловую кислоту (ГК), глюкозу, этанол, маннит, глицерин. Фитогормоны использовали в концентрации 2 мг/л, органические субстраты - в концентрации 5 г/л. Обработку производили следующим образом: сразу же после оплодотворения зиготы фукуса несколько раз промывали раствором соответствующего агента, затем заливали тем же раствором; в качестве контроля использовали зиготы и эмбрионы, развивающиеся в фильтрованной морской воде; в среду с суспензией эвглены, находящейся в экспоненциальной фазе роста, вносили растворы гормонов или трофических агентов. Снятие опытов во всех случаях производили через сутки после внесения в среду соответствующих добавок.
Пигменты экстрагировали 90%-ным ацетоном; эмбрионы фукуса растирали в ацетоне со стеклянным песком (лабораторное стекло) с добавлением небольшого количества Na2S04
и NaHC03 [17; О. А. Шерстнева, личное сообщение]. Расчет количества хлорофиллов «а» и суммы «Ci»+«C2», а также фукоксантина и виолаксантина у фукуса и хлорофиллов «а», «Ь» и суммы каротиноидов у эвглены производили после спектрофотометрирования (СФ-26) по описанным в литературе формулам [16-17].
Количество Рубиско определяли путем нативного электрофореза растворимых белков с последующей окраской гелей, сканированием и расчетом количества связанного с белком красителя. Растительный материал растирали в 20 мМ Трис-HCl буфере (pH 7,8) с защитными добавками [1] на льду в охлажденных фарфоровых ступках. Экстракты центрифугировали дважды по 30 мин при 10 ООО g, супернатанты объединяли и использовали в дальнейшем при электрофорезе. Электрофорез проводили в 5,5%-ном полиакриламидном геле в течение 1 ч при напряжении 300 В. В качестве градуировочного белка использовали гексокиназу (ICN Biomed.), которая наносилась на гели за 15-20 мин до конца электрофореза. Гели фиксировали в течение часа 12%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и затем окрашивали 0,1%-ным раствором Кумасси G-250 в течение 2 ч. Несвязавшийся краситель удаляли, несколько раз промывая гели дистиллированной водой. Рубиско проявляется на электрофореграммах в виде четкой, легко регистрируемой полосы. Гели сканировали, и рассчитывали количества красителя в полосках с помощью комплексов компьютерных программ Adobe Photoshop, Matlab и Microsoft Origin.
Опыты проводились в 4-6 биологических повторностях. На рисунках представлены средние арифметические значения величин и доверительные интервалы для 95%-ной вероятности.
Полученные данные показывают, что экзогенные фитогормоны оказывают существенное влияние на содержание пигментов и Рубиско как в клетках Е. gracilis, так и в эмбрионах F. vesiculosus. Наиболее значительное действие на пигментный состав эмбрионов фукуса оказывают кинетин и АБК (рис. 1, А). В обоих случаях изменения касаются хлорофиллов и практически не затрагивают исследованные каротиноиды. Кинетин вызывает повышение содержания хлорофиллов; воздействие АБК, напротив, приводит к резкому снижению количества этих пигментов. На Е. gracilis, однако, кинетин не оказывает четкого влияния, а АБК вызывает некоторое повышение общего содержания пигментов. Возможно, в данном случае эффекты гормонов отчасти маскируются вследствие расчета содержания пигментов на количество клеток. Известно, что цитокинины способствуют интенсификации клеточных делений [2, 8], в наших экспериментах кинетин также стимулировал деления в культуре эвглены, в то время как АБК несколько тормозила этот процесс (данные не приводятся). Содержание Рубиско увеличивается при обработке кинетином и в эмбрионах фукуса и в клетках эвглены (рис. 2). У высших растений цитокинины участвуют в регуляции ряда физиологических процессов, связанных с деятельностью фотосинтетического аппарата, таких как старение листьев и образование пластид [2, 6, 8]. Обработка цитокининами подавляет деградацию хлорофилла и фотосинтетических белков и стимулирует деэтиоляцию. Эти гормоны влияют на синтез многих белков, кодируемых в ядерном и пластидном геномах, в том числе на малую субъединицу Рубиско и ряд хлорофилл-связывающих белков светосо-бирающего комплекса [6, 27]. Вероятно, подобные функции цитокинины могут выполнять и у различных групп водорослей, в которых они также были обнаружены [6, 24, 28]. У эмбрионов F. vesiculosus кинетин способствует повышению интенсивности фотосинтеза и дыхания, увеличивает активность Фотосистемы I [4].
Представляется интересным наличие довольно сильной, хотя и неоднозначной реакции клеток водорослей на воздействие АБК. В последнее время появляется все больше свидетельств присутствия эндогенной АБК у различных групп водорослей [19, 22]. У высших растений этот гормон контролирует многие аспекты роста и развития, такие как созревание и покой семян, адаптация к воздействиям окружающей среды, процессы старения. В ста-
реющих тканях содержание АБК существенно возрастает, этот гормон вызывает деградацию белков и хлорофилла [2, 28, 31]. Резкое снижение содержания хлорофиллов (см. рис. \,А\ а также уменьшение количества Рубиско (см. рис. 2) в эмбрионах фукуса после обработки АБК подтверждает предположение о том, что этот гормон выполняет у водорослей примерно те же функции, что и у высших растений [19, 22]. ИУК не оказала значимого влияния на пигментный состав и количество Рубиско исследованных водорослей. Под воздействием ГК происходит некоторое снижение содержания пигментов (см. рис. 1) и Рубиско (см. рис. 2). Объяснение этого эффекта в данный момент вызывает затруднения и требует дальнейших исследований.
Изменение содержания пигментов за 24 ч, %
140 120 100 80 60-40 20 0
100 -80 -
Контроль ИУК
□ Хлорофилл «а»
Кинетин Хлорофилл «Ь»
АБК ГК
■ Каротиноиды
Рис. 1. Влияние экзогенных фитогормонов (2 мг/л) на содержание пигментов в 24-часовых эмбрионах Fucus vesiculosus (А) и клетках Euglena gracilis (Б).
Контроль
□ Хлорофилл «а» Е2 Хлорофилл «с»
■ Фукоксантин □ Виолаксантин
ИУК Кинетин АБК
Контроль ИУК Кинетин АБК ГК
□ F. vesiculosus 0 Е. gracilis
Рис. 2. Влияние экзогенных фитогормонов (2 мг/л) на содержание Рубиско в 24-часовых эмбрионах Fucus vesiculosus и клетках Euglena gracilis.
0,14
Контроль Этанол Глюкоза Маннит Глицерин
□ F. vesiculosus 0 Е. gracilis
Рис. 3. Влияние экзогенных трофических факторов (5 г/л) на содержание Рубиско в 24-часовых эмбрионах Fucus vesiculosus и клетках Euglena gracilis.
Добавление в среду органических субстратов маннита и глицерина приводит к снижению содержания Рубиско в эмбрионах фукуса до 50% (рис. 3). Известно, что маннит является основным стабильным продуктом фотосинтеза и субстратом дыхания у фукусовых [7, 20], и, можно предположить, что при повышении его концентрации происходит ингиби-рование образования компонентов фотосинтетического аппарата по принципу обратной связи. Глицерин также участвует в трофическом обмене клеток этих водорослей, накапливаясь в виде запасного питательного вещества [9, 20]. Помимо снижения содержания Рубиско, глицерин вызывает у эмбрионов F. vesiculosus уменьшение количества хлорофиллов «а» и «с» и фукоксантина (рис. 4, А). Как хлорофилл «с», так и фукоксантин у бурых водорослей передают энергию на молекулы хлорофилла «а» светособирающего комплекса и дальше на реакционные центры фотосистем, то есть непосредственно участвуют в процессах световой фазы фотосинтеза [11]. Количество второго мажорного ксантофилла, виолак-сантина, выполняющего в первую очередь фотопротекторную функцию, при добавлении
Изменение содержания
пигментов за А
24 ч, %
160
Контроль Этанол Глюкоза , Маннит Глицерин
□ Хлорофилл «а» 0 Хлорофилл «с»
Щ Фукоксантин □ Виолаксантин
Контроль Этанол Глюкоза Маннит Глицерин □ Хлорофилл «а» □ Хлорофилл «b» I Каротиноиды
Рис. 4. Влияние экзогенных трофических факторов (5 г/л) на содержание пигментов в 24-часовых эмбрионах Fucus vesiculosus (А) и клетках Euglena gracilis (Б).
глицерина не изменяется. Наличие у F. vesiculosus достоверной реакции на внесение в среду трофических факторов позволяет сделать вывод, что зиготы и эмбрионы этой водоросли, в отличие от взрослых растений, способны усваивать экзогенные органические субстраты благодаря большей проницаемости их оболочек. У клеток эвглены к снижению содержания как Рубиско (см. рис. 3), так и основных фотосинтетических пигментов (см. рис. 4, Б) приводит внесение в среду этанола и глюкозы. Оба эти вещества легко усваиваются эвгленой и способны обеспечивать рост этой водоросли даже в полностью гетеротрофных условиях [23]. Представляет интерес некоторое увеличение содержания Рубиско у эвглены при добавлении маннита (см. рис. 3). Возможно, маннит в данном случае выступает в качестве физиологически активного вещества, стимулирующего синтез этого фермента.
Обращает на себя внимание сравнительно низкое содержание Рубиско в клетках F. vesiculosus (по сравнению с эвгленой). Возможно, это объясняется тем, что фукус обладает другой, более эффективной, разновидностью этого фермента, так называемой Рубиско I красного типа [5, 14]. Эта форма Рубиско имеет сниженную оксидазную активность, и, еле-; довательно, менее чувствительна к кислороду [5]. Кроме того, эффективность работы Рубиско у фукусовых водорослей может быть повышена за счет использования СО2-концентрирующих механизмов [15, 18].
В целом полученные нами данные позволяют сделать вывод, что как экзогенные органические субстраты, так и фитогормоны оказывают значительное влияние на пигментный состав и содержание Рубиско эмбрионов F. vesiculosus и клеток Е. gracilis. Влияние трофических факторов на характеристики фотосинтетического аппарата в первую очередь зависит от специфики трофического обмена объектов. Действие же фитогормонов представляется более универсальным, и, вероятно, им принадлежит существенная роль в регуляции формирования и деятельности фотосинтетического аппарата водорослей. Заслуживают дальнейшего изучения возможные механизмы действия фитогормонов на фотосинтетические процессы.
Summary
Tarakhovskaya Е. R, Maslov Y. I. The influence of phytohormones and trophic factors on some pho-tosynthetic apparatus characteristics of Fucus vesiculosus and Euglena gracilis.
The influence of phytohormones (indole-3-acetic acid, kinetin, abscisic acid (ABA), gibberellic acid, 2 mg/'l) and nutrients (ethanol, glucose, mannitol, glycerol, 5 g/1) on ribulose-l,5-bisphosphate carboxy-lase/oxigenase (Rubisco) and principal photosynthetic pigment concentrations is investigated in F. vesiculosus 24-h embryos and E. gracilis cells. Kinetin increases the content of Rubisco and chlorophylls; the ABA treatment leads to the decrease of chlorophylls and fucoxanthin concentrations in Fucus embryos. Rubisco content of Fucus embryos substantially decreases with mannitol or glycerol added to the medium; ethanol and glucose have the same effect on Euglena cells.
Литература
1. Бусова Т. П., Иванова И. Л. Выделение и электрофорез белков в полиакриламидном геле // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. С. 37-51. 2. Полевой В. В. Фитогормоны. Л., 1982. 3. \Полевой В. В\ Тараховская Е. Р., ЫасловЮ. И., Полевой А. В. Роль ауксина в индукции полярности у зигот Fucus vesiculosus L. // Онтогенез. 2003. Т. 34, № 6. С. 432^137. 4. Тараховская Е. Р., Маслов Ю. И. Влияние ряда физиологически активных веществ на развитие ассимиляционного аппарата у эмбрионов Fucus vesiculosus L. // Вестн. С.-Петерб.. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 4. С. 81-87. 5. Badger M.R., Andrews Т. J., Whitney S. M, LudwigM., Yellowlees D. С., LeggatW., Price G. D. The diversity and coevolution of Rubisco, plastids, pyrenoids, and chloroplast-based CCVconcentrating mechanisms in algae // Can. J. Bot. 1998. Vol. 76. P. 1052-1071. 6. Benkova E., Witters E„ Van Dongen W., Ko-larJ., MotykaV., Brzobohaty В., Van Onckelen H. A., Machackova I. Cytokinins in Tobacco and Wheat Chloroplasts. Occurrence and Changes Due to Light/Dark Treatment // Plant Physiol. 1999. Vol. 121. P. 245-251. 1. BidwellR. G. S. Photosynthesis and metabolism in marine algae. VII. Products of photosynthesis in fronds of Fucus vesiculosus and their use in respiration H Can. J. Bot. 1967. Vol.45, N9. P. 1557-1565. 8.BinnsA. N. Cytokinin accumulation and action: biochemical, genetic and molecular approaches // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. Vol.45. P. 173-196. 9. CraigieJ. S. Storage products // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley; Los Angeles, 1974. P. 206-235. 10. Cunningham J. F. X., Schiff J. A. Chlorophyll-protein complexes from Euglena gracilis and mutants deficient in chlorophyll b. 1. Pigment composition // Plant Physiol. 1986. Vol. 80. P. 223-230, 11. DeMartinoA., DouadyD., Quinet-Szely M, Rousseau В., Crepineau F., AptK., Caron L. The light-harvesting antenna of brown algae. Highly homologous proteins encoded by a multigene family // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 5540-5549. 12. Droop M. R. Heterotrophy of carbon // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley; Los Angeles, 1974. P. 530-559. 13. Goodwin T. W. Carotenoids and bilipro-
teins // Ibid. P. 176-205. 14. Gutteridge S.} GatenbyA. A. Rubisco synthesis, assembly, mechanism, and regulation // The Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 809-819. 15. Israel A., HophyM. Growth, photosynthetic properties and Rubisco activities and amounts of marine macroalgae grown under current and elevated seawater CO2 concentrations // Global Change Biology. 2002. Vol. 8. P. 831-840. 16. Jeffrey S. W„ Humphrey G. F. New spectrophotometry equations for determining chlorophylls «a», «b», «C[» and «c2» in higher plants, algae and natural phytoplankton // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1975. Vol. 167, N 1. P. 191-194. 17. Katoh T., Mi-muroM., TakaichiS. Light-harvesting particles, isolated from a brown alga, Dictyota dichotoma. A su-pramolecular assembly of fucoxanthin-chlorophyll-protein complexes // Biochim. et Biophys. Acta. 1989. Vol. 979. P. 233-240. 18. Kawamitsu Y., BoyerJ. S. Photosynthesis and carbon storage between tides in a brown alga, Fucus vesiculosus // Marine Biology. 1999. Vol. 133. P. 361-369. 19. KobayashiM., HiraiN., KurimuraY., Ohigashi H., Tsuji Y. Abscisic acid-dependent algal morphogenesis in the unicellular green Haematococcuspluvialis II Plant Growth Regul. 1997. Vol. 22. P. 79-85. 20. McLachlanJ. Photosynthesis of eggs, sperm, zygotes and embryos oí Fucus serratus II Can. J. Bot. 1978. Vol.56, N4. P. 371-373. 21 .MoroneyJ. V., SomanchiA. How do algae concentrate C02 to increase the efficiency of photosynthetic carbon fixation? // Plant Physiol. 1999. Vol. 119. P. -16. 22. Nimura K., Mizuta H. Inducible effects of abscisic acid on sporophyte discs from Laminaria japónica Areschoug (Laminariales, Phaeophyceae) // J. Appl. Phycol. 2002. Vol. 14. P. 159-163. 23. OgbonnaJ. C„ IchigeE., TanakaH. Interactions between photoauto-trophic and heterotrophic metabolism in photoheterotrophic cultures of Euglena gracilis // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. Vol.58. P. 532-538. 24.ÓrdógV., StirkW.A., VanStadenJ., Novák 0., StrnadM. Endogenous cytokinins in three genera of microalgae from the Chlorophyta // J. Phycol. 2004. Vol. 40. P. 88-95. 25. PassaquetC., Thomas J. C., CaronL., Hauswirth N.. PuelF., BerkaloffC. Light-harvesting complexes of brown algae. Biochemical characterization and immunological relationships // FEBS Lett. 1991 .Vol. 280, N1. P. 21-26. 26. Quatrano R. S. Developmental biology: development in marine organisms // Experimental marine biology / Ed. by R N. Mariscal. New York; London, 1974. P. 303-346. 27. Raven J. A. Carbon dioxide fixation // Algal physiology and biochemistry / Ed. by W. D. P. Stewart. Berkeley, Los Angeles, 1974. P. 434-455. 28. Shu-QingC., Rong-XianZ., Wei L., Zhi-RuiD., Qi-MingZ. The Involvement of Cytokinin and Abscisic Acid levels in roots in the regulation of photosynthesis function in flag leaves during grain fillirtg in super high-yielding Rice (Oryza sativa) II J. Agronomy and Crop Science. 2004. Vol. 190. P. 73-80. 29. StirkW.A., Novak O., StrnadM., VanStadenJ. Cytokinins in macroalgae // Plant Growth Regul. 2003. Vol. 41. P. 13-24. 30. Whitney S. M, BaldetP., Hudson G. S., Andrews T. J. Form I Rubiscos from non-green algae are expressed abundantly but not assembled in tobacco chioropiasts // The Plant Journal. 2001. Vol. 26, N 5. P. 535-547. 31. ZeevaartJ. A. D., Creelman R. A. Metabolism and physiology of abscisic acid //Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 39. P. 439-473.
Статья поступила в редакцию 5 мая 2005 г.
