CC BY
39
Г. Е. Лунев, К. Е. Федоров, О. В. Зеленников
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ЭСТРАДИОЛА НА РАЗВИТИЕ ГОНАД ГОРБУШИ (ОЖОЯНУКСНиБ СОКВтСНА \VALB.):
ОБРАБОТКА МОЛОДИ ПОСЛЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПОЛА
Введение. Данные многочисленных исследований свидетельствуют о лабильности эндокринных механизмов регуляции гаметогенеза у рыб и о важной роли половых стероидных гормонов в осуществлении этого процесса [1,10,14,16]. В аквакультуре воздействие эстрогенами применяется для изменения половой дифференцировки гонад рыб с целью получения однополых популяций [13,14,15]. При разработке и оптимизации этой биотехники исследователи обычно ограничиваются анализом соотношения полов при различных вариантах гормональной обработки (тип препарата, способ введения, доза, период и продолжительность воздействия). Анализ накопленных экспериментальных данных показывает, что наиболее выраженный эффект переопределения пола достигается при воздействии эстрогенами незадолго до начала половой дифференцировки гонад [14]. Конечный эффект обработки эстрогенами - передифференцировка гонад в яичники - хорошо известен, тогда как ранние этапы стимулированной гормонами инверсии пола остаются мало изученными. Между тем отмечающийся при этом переход гениальных клеток от митотических к мейотическим циклам, а позднее к превителлогенезу составляет суть процесса формирования репродуктивного фонда, определяющего потенциальную плодовитость особи. Нам неизвестны работы, в которых воздействие эстрогенами применялось бы для анализа механизмов формирования фонда ооцитов периода превителлогенеза.
Удобным объектом для такого исследования может служить молодь тихоокеанских лососей рода ОпсогЬупсИш, для которых характерен моноциклический тип воспроизводства и соответствующее ему формирование только одной генерации ооцитов. У горбуши, созревающей на втором году жизни, наблюдается также наиболее высокий темп гаметогенеза, самое быстрое формирование одной генерации ооцитов и ранняя блокировка ее пополнения [3]. В отличие от других тихоокеанских лососей, для горбуши характерен непрямой механизм дифференцировки пола: после протогинической феминизации гонад в эмбриогенезе, на личиночном этапе развития происходит естественная инверсия пола. Несмотря на то, что явление инверсии пола у горбуши описано давно [6], эндокринные механизмы этого процесса не исследованы.
Целью работы стало изучение влияния экзогенного эстрадиола на процессы гаметогенеза у самок и самцов горбуши после завершения процесса половой дифференцировки гонад. Основная задача - проследить изменения состава и динамики фонда половых клеток у обработанных гормоном рыб.
Материал и методика. Икра горбуши (Oncorh.yn.husgorbuscha \Уа1Ь.) была получена на Оль-ском рыбоводном заводе (Магаданская область) и за 71 сутки инкубации успела набрать 260 гра-дусодней. При доставке в аквариальную лаборатории ихтиологии Биологического НИИ СПбГУ зародыши находились на стадии пигментации глазных бокалов. Икру, а потом и личинок содержали в отсеках 200-литрового инкубатора, работающего по принципу системы оборотного водоснабжения при температуре воды в пределах от 9.0 до 9.6 "С.
Сразу после перевода на активное питание (в возрасте 72 суток от вылупления) молодь горбуши разделили на две партии: одна служила контролем, другая получала с кормом 0.1%-ный
© Г. Е. Лунев, К. Е. Федоров, О. В. Зеленников, 2007
И
масляный раствор эстрадиола-дипропионата (опыт). В опытном и контрольном вариантах осуществлялось смешанное кормление: первые 2-3 раза рыб кормили мороженым мотылем, а затем 3-5 раз гранулированным кормом (с избытком). Подопытной горбуше в корм (мотыль) замешивали суточную дозу гормона. В связи с накоплением эстрадиола в теле рыб и связанным с этим повышением их смертности дозировку гормона и долю мотыля в суточном рационе изменяли по ходу эксперимента так, как это показано в табл. 1. Начиная с возраста 109 суток подопытных рыб разделили на два варианта: в первом опыте гормональную обработку продолжали, а во втором варианте - рыб перевели на безгормональную диету. Опыты завершили, когда рыбы достигли возраста 144 суток.
Контрольных и подопытных рыб содержали в непроточных аквариумах объемом 50 и 25 л при температуре 13.6-14.6 °С и средней плотности посадки 0.8-1.0 г/л. Воду интенсивно аэрировали и в конце дня заменяли на 70-80%. Гидрохимические параметры воды, используемой в лаборатории для содержания рыб, были таковы: кислород (02) - 7.0-10.8 мг/л, ион аммония (1МН4+) - 0.1-0.5 мг/л, жесткость (по Са2+и Р^2+) - 11 мг/л, щелочность (НС03~) - 3.1 мг/л, pH - 7.4-7.8.
Гонады фиксировали в жидкости Буэна у рыб в возрасте 72,109 и 144 суток. После проводки по спиртам возрастающей концентрации среднюю часть гонады рыб заливали в парафин-воск, разлагали на серийные срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали железным гематоксилином по Гейденгайну согласно общепринятым методикам [8].
Для сравнительной оценки состояния гонад у контрольных и подопытных рыб подсчитывали половые клетки всех этапов развития: гонии, ооциты периода ранней профазы мейоза и ооци-ты периода превителлогенеза - на 6 срезах гонад (по 3 среза правой и левой гонады). Для того чтобы одни и те же клетки не учитывать дважды, подсчитывали только клетки с ядрами и, в зависимости от их размеров, делали пропуски соответствующего количества срезов. Площадь среза гонад определяли с помощью окулярной сетки на первом и последнем срезах, на которых производился подсчет половых клеток.
Измерения диаметров ооцитов старшей генерации проводили на их медиальных срезах по малой и большой осям; данные этих двух измерений усредняли. У каждой особи измеряли диаметр 20 ооцитов, выбранных случайным образом. Шаг ячеи окулярной сетки и цену деления окуляр-микрометра определяли по линейке объект-микрометра. Полученные данные обрабатывали статистически. Достоверность различий средних устанавливали по критерию Стьюдента [4].
Результаты исследований. Развитие гонад у интактной горбуши. Возраст 72 суток,
В начале эксперимента масса мальков варьировала в пределах от 146 до 265 мг (средняя -200.3+15.5 мг) при длине от 28 до 33 мм (30.3±0.7). Половые железы были изучены у 7 рыб.
Таблица 1. Изменение количества мотыля и дозы эстрадиола-дипропионата в суточном рационе подопытной молоди горбуши в возрасте 72-144 сут. от вылупления
Возраст рыб, сутки Количество мотыля, в % от массы рыб Доза эстрадиола в корме, мкг/г Суточная доза гормона, мкг/г массы тела
72-74 40 33.3 13.3
75 50 33.3 17.8
76-80 50 100 50
81-94 25 200 50
95-108 25 100 25
109-138 12.5 100* 12,5*
139-144 50 100* 50*
* Эстрадиол с кормом получали только рыбы в опыте 1.
У самок (2 экз.) площадь поперечных срезов яичников составила 0.040 и 0.065 мм2; половые клетки были представлены преимущественно ооцитами периода превителлогенеза. Их число варьировало в пределах от 5 до 9 на срез, кроме того, у одной особи были
отмечены отдельные группы ооцитов ранней профазы мейоза. Размер ооцитов периода превителлогенеза в яичниках самок был сходным: диаметр изменялся в пределах 100-125 мкм, что свидетельствовало об относительно синхронном развитии ооцитов.
У самцов (5 экз.) площадь поперечных срезов гонад варьировала в пределах
0.0021-0,0042 мм2, т. е, была в десять раз меньше, чем у самок. Состав фонда половых клеток различался, У двух самцов присутствовали исключительно гонии (от 1-2 до 6-8 на поперечном срезе гонады), т. е. у этих рыб инверсия пола была завершена, тогда как у трех других самцов в гонадах помимо гониев присутствовали одиночные превителлоген-ные ооциты диаметром 35-40 мкм, что свидетельствовало о незавершенности половой дифференцировки гонад у этих особей.
Возраст 109 суток. Мальки имели массу тела 148-768 мг (в среднем 488.2±64.6) при длине 25-47 мм (39.1±2.1). Были исследованы гонады 2 самок и 4 самцов.
У самок площадь поперечных срезов гонад составила 0.19 и 0.23 мм2. В гонадах находились ооциты периода превителлогенеза, диаметр наиболее крупных из которых достигал 210 мкм. Количество этих ооцитов варьировало от 5 до 10 на срез; ооцитов периода ранней профазы мейоза у самок в этом возрасте обнаружено не было.
У самцов площадь гонад на поперечных срезах составляла 0.01-0.03 мм2. Половые железы были неоднородны по состоянию. У двух особей половые клетки были представлены исключительно гениями (до 10-15 на срез). У двух других самцов помимо гониев в гонадах присутствовали ооциты периода превителлогенеза (до 2-4 на срез), а также небольшие группы ооцитов (3-5 клеток) в состоянии ранней профазы мейоза. Как было показано ранее, у 72-суточных самцов с незавершенной инверсией гонад превителлоген-ные ооциты имели диаметр 35-45 мкм. У 109-суточных рыб размер таких клеток составил уже 60-95 мкм, т.е. был в 2 раза больше.
Возраст 144 суток. Среди горбуши в этом возрасте было исследовано 25 особей, масса рыб варьировала в интервале 760-3597 мг, длина - 45-79 мм. У самок (9 экз.) площадь поперечных срезов гонад составляла 0.47-1.18 мм2 (табл. 2). В гонадах находили исключительно ооциты периода превителлогенеза диаметром 189-264 мкм, лишь у одной особи обнаружили отдельные ооциты в состоянии ранней профазы мейоза. Ооциты периода превителлогенеза развивались синхронно, о чем свидетельствовал низкий коэффициент вариации их диаметра (0=5-10%), рассчитанный для каждой из рыб (рис. 1).
В том же возрасте самцы имели достоверно (р<0.001) меньшие размеры гонад, чем самки (площадь поперечного среза варьировала в пределах от 0.02 до 0.29 мм2). Состояние половых желез у изученных особей (16 экз.) существенно различалось.
Рис. 1. Состояние яичников у самок контрольной горбуши.
Возраст 144 суток после вылупления. Синхронное развитие ооцитов периода превителлогенеза. Шкала=80 мкм.
У пяти самцов репродуктивный фонд был представлен исключительно гениальными клетками (рис. 2), среднее число которых на поперечном срезе половых желез варьировало от 0.2 до 20.2. Таких рыб можно считать типичными самцами с завершенной естественной инверсией пола; аналогичное состояние гонад отмечали у подавляющего большинства
Рис. 2. Состояние семенников у самцов контрольной горбуши.
Возраст 144 суток после вылупле-ния. После завершения инверсии пола фонд половых клеток составляют только сперматогонии. Шкала=50 мкм.
У других одиннадцати рыб гонады были крупнее, поскольку помимо гениев среди половых клеток можно было обнаружить также немногочисленные ооциты периода ранней профазы мейоза и периода превителлогенеза. Среднее число и диаметр превителло-генных ооцитов оказались достоверно ниже (р<0.001), чем у самок. Очевидно, что эта группа рыб объединяет самцов с незавершенной инверсией пола.
Анализируя развитие гонад у содержавшейся в лаборатории молоди горбуши, можно сделать ряд заключений. У подавляющего большинства самок происходило синхронное развитие ооцитов периода превителлогенеза и отсутствовал резервный фонд половых клеток (гонии и ооциты периода ранней профазы мейоза); как исключение у одной из 9 рыб наблюдались немногочисленные ооциты периода ранней профазы мейоза. Это совпадает с более ранними наблюдениями [2] о том, что приблизительно у 10% самок горбуши после формирования генерации ооцитов периода превителлогенеза в гонадах сохраняются половые клетки более ранних этапов развития. Данное явление было обозначено как состояние асинхронного оогенеза. У самцов с завершенной инверсией пола развитие семенников происходило за счет митотического размножения гениальных клеток. Кроме того, у части самцов была отмечена не характерная для горбуши задержка инверсии пола,
о чем свидетельствовало длительное (вплоть до возраста 144 сут.) присутствие в гонадах немногочисленных ооцитов.
Развитие гонаду получавшей эстрадиол горбуши. Возраст 109 суток. В возрасте 109 суток молодь горбуши, более месяца получавшая с кормом эстрадиол-дипропионат, имела массу от 193 до 604 мг (в среднем 321.2±39.0 мг) и длину от 23.5 до 43.5 мм (36.7±1.9 мм).
У исследованных самок площадь поперечных срезов гонад составила 0.18 и 0.24 мм2; фонд половых клеток был представлен в основном превителлогенными ооцитами (7-10 на срезе) диаметром до 210 мкм. У одной из исследованных рыб на срезах гонад присутствовали также группы ооцитов периода ранней профазы мейоза (от 2 до 8 клеток на срез) и одиночные гонии. Приблизительно у 10% превителлогенных ооцитов отмечали признаки начавшейся дегенерации: нарушение целостности яйцевой оболочки, выраженная хромофилия и грубозернистая структура цитоплазмы на периферии клетки.
Таблица 2. Состояние гонад у молоди горбуши в возрасте 144 суток в контроле и после обработки раствором
эстрадиола-дипропионата в период активного питания
Вариант опыта Пол рыб Кол-во рыб Длина рыб, мм Масса рыб, мг Площадь среза гонад *’ Кол-во половых клеток на срез Диаметр ооцитов*
Общее Гонии РПМ*2 ППР*3
Контроль ?? 9 65.2±3.9 2277.2±347.0 73.8*6.9 7.1±0.5 0 0.1±0.1 7.0*0.5 228.2*9.6
45.0-76.0 760.0-3597.0 46.8-117.7 5.3-9.3 0.0-0.5 5.3-9.3 189.0-264.0
Су=17.9 0=45.7 028.0 0=20.2 О300.0 0=21.0 012.6
16 65.3*2.1 2168.4±190.6 5.0*1.2 10.9*1.7 7.8*1.8 1.8*0.6 1.4*0.5 87.4*9.3
48.0-79.0 875.0-3584.0 0.9-19.7 0.2-20.4 0.2-20.2 0.0-8.0 0.0-4.8 57.0-137.0
Су=12.6 О35.2 0=99.5 0=62.3 0=94.5 0=131.7 0136.3 0=35.2
Опыт 1 ?? 14 47.0*2.1 964.Ш26.3 73.9*7.7 7.4*0.5 0 0 7.4*0.5 211.6*4.9
33.0-60.0 310.0-1990.0 36.0-133.0 4.7-9.5 4.7-9.5 190.0-246.0
Су=17.0 049.0 038.8 0=24.5 0=24.5 0=8.6
о'сГ 6 48.3*3.3 1056.3*210.9 11.5*1.5 6.5±1.5 0.7±0.6 08*0.7 5.1*1.3 122.2*25.8
36.0-56.0 353.0-1684.0 5.0-15.0 1.0-10.5 0.0-3.8 0.0-4.2 1.0-9.3 75.0-245.0
016.6 048.9 032.4 О56.1 0=212.6 0=225.9 062.0 0=51.7
Интер- 3 52.0*2.6 1295.0±188.6 35.0*11.8 5.7*1.7 5.7*1.7 143.0*25.5
сексы 47.0-56.0 975.0-1628.0 12.0-51.0 2.3-7.5 2.3-7.5 93.0-177.0
Су=8.8 Су=25.2 0=58.3 0=51.5 051.5 030.9
Опыт 2 ?? 17 53.7*1.6 1243.6±114.9 53.7*3.8 6.3±0.4 0 0 6.3±0.4 198.8*5.5
45.0-73.0 706.0-2626.0 25.0-86.0 4.3-9.5 4.3—9.5 173.0-254.0
Су=12.4 038.1 0=29.2 0=23.3 023.3 011.4
а'сГ 9 48.3*1.6 865.0*92.9 9.8*2.2 5.7*1.6 0.8±0.5 1.3*0.8 3.6*0.8 113.0*11.9
43.0-57.0 540.0-1421.0 2.0-23.0 1.5-16.2 0.0-4.0 0.0-7.0 1.5-8.7 80.0-189.0
0=10.1 0=32.2 068.6 082.2 0=178.0 0185.2 Су=6 5.6 0=31.6
Интер- 1 52.0 1058.0 7.0 3.0 3.0 125.0
сексы
Примечание. Гормон молоди замешивали в корм с возраста 72 по 144 сут. (опыт 1) и с возраста 72 по 109 сут. (опыт 2); данные представлены как среднее ± ошибка, ниже пределы изменений (мин-макс); Сь - коэффициент вариации; *' - площадь среза гонады (10 3 * мм2 ); *2 - РПМ - ооциты периода ранней профазы мейоза; *3 - ППР - ооциты периода превителлонегеза; *4 - средний диаметр ооцитов периода превителлонегеза в микрометрах.
У подопытных самцов площадь поперечных срезов гонад (0.05 и 0.12 мм2) была в несколько раз выше, чем у контрольных; состав фонда половых клеток у двух исследованных рыб различался. У одного из самцов (рис. 3, А) половые клетки были представлены гониями, многочисленными ооцитами периода ранней профазы мейоза (до 15-20 клеток на поперечном срезе) и единичными ооцитами начала периода превителлогенеза, диаметр которых составлял 25-30 мкм. У другого самца (рис. 3, Б), помимо гониев и ооцитов периода ранней профазы мейоза, в гонадах находили значительно различающиеся по размеру превителлогенные ооциты: в начале превителлогенеза были встречены как очень мелкие (диаметром около 30 мкм), так и более крупные клетки (диаметром 50-70 мкм).
Появление большого количества ооцитов ранней профазы мейоза в гонадах, по размеру и форме подобных семенникам у контрольной горбуши, можно объяснить только тем, что обработка эстрадиолом стимулировала переход гениальных клеток к мейозу, а затем и к превителлогенезу. Различия в состоянии гонад у исследованных рыб объясняются тем, что гормональному воздействию подвергали рыб с различным исходным состоянием гонад. У самцов с исходно завершенной инверсией пола после гормональной обработки в гонадах произошло новообразование ооцитов периода ранней профазы мейоза и формирование одной генерации ооцитов периода превителлогенеза, тогда как у самцов с исходно незавершенной инверсией пола, помимо новообразования ооцитов и их перехода к превителлогенезу, происходил также и рост уже имевшихся превителлогенных ооцитов, что обусловило формирование двух генераций ооцитов.
На срезах гонад у обоих подопытных самцов, кроме развивающихся ооцитов, можно было видеть и группы резорбирующихся половых клеток. Это были небольшие клетки с оптически прозрачной цитоплазмой и ядром в «пикноморфном» состоянии, что позволяло предполагать: у подопытных рыб происходила резорбция гониев и/или ооцитов периода ранней профазы мейоза. Таким образом, при экзогенном гормональном воздействии имела место стимуляция развития одних и гибель других половых клеток.
Возраст 144 сут. Опыт 1. У молоди горбуши, получавшей эстрадиол в течение 72 суток, значительно возросла смертность: за время эксперимента погибло около 50% от первоначального числа рыб, в то время как в контроле - менее 5%. Масса тела подопытных рыб варьировала в пределах от 310 до 1990 мг(103191); длина - от 33 до 60 мм (49.5 1.4), что значительно ниже (р<0.001), чем у контрольных рыб (см. табл. 2).
Вследствие значительной вариации в состоянии гонад у подопытных рыб мы смогли разделить выборку на самок и самцов лишь условно, с учетом основных критериев уровня развития половых желез: площади гонад на поперечных срезах, числа и диаметра ооцитов периода превителлогенеза.
Рис. 3. Состояние гонад у самцов горбуши, получавших эстрадиол.
Возраст 109 суток. Л - многочисленные ооциты ранней профазы мейоза и отдельные ооциты начала периода превителлогенеза; Б - одиночные крупные ооциты периода превителлогенеза и многочисленные ооциты периода ранней профазы мейоза. Шкала = 30 мкм.
У предполагаемых самок (14 экз.) в гонадах (площадь срезов 0.36-1.33 мм2) находили только ооциты периода превителлогенеза диаметром 190-245 мкм, т. е. состав фонда половых клеток у этих подопытных рыб был таким же, как и у контрольных самок. Однако, в отличие от последних, у большинства подопытных рыб в цитоплазме ооцитов было отмечено появление оптически прозрачных вакуолей. Количество и размер таких вакуолей у разных особей значительно варьировали: от единичных мелких до значительного количества вакуолей, наиболее крупные из которых достигали в диаметре до 60 мкм (рис. 4, А). У трех рыб наблюдали нарушения целостности оболочек некоторых превителлогенных ооцитов и разрушение их ядер, что свидетельствовало о резорбции этих половых клеток (рис. 4, Б).
Рис. 4. Яичники генотипических самок горбуши, получавших эстрадиол.
Возраст 144 суток. А - Видны крупные вакуоли в цитоплазме ооцитов периода превителлогенеза. Б - дененерация ооцитов. Шкала=80 мкм.
К генотипическим самцам можно было отнести подопытных рыб, у которых половые железы были намного (р<0.01) меньше (площадь срезов 0.05-0.15 мм2), чем у особей первой группы. У четырех самцов половые клетки были представлены исключительно превителлогенными ооцитами; причем характерным для гонад этих рыб было присутствие либо единичных крупных (диаметром около 245 мкм) ооцитов (рис. 5, А), либо многочисленных более мелких ооцитов (диаметром 75-100 мкм; рис. 5, Б). У других двух самцов помимо ооцитов периода превителлогенеза в гонадах встречали также гонии и ооциты периода ранней профазы мейоза. Превителлогенные ооциты у этих особей значительно различались по диаметру - от 25-30 мкм (самое начало превителлогенеза) до размеров, приближающихся к показателям у самок. Можно предположить, что эти рыбы являются самцами с исходно незавершенной инверсией пола, у которых при воздействии эстрадиолом произошло формирование нескольких генераций превителлогенных ооцитов.
Среди подопытных рыб были три особи, в гонадах которых одновременно присутствовали женские и мужские половые клетки: помимо ооцитов периода ранней профазы мейоза и периода превителлогенеза были обнаружены гонии и сперматоциты. Наблюдались индивидуальные различия в соотношении и уровне развития мужских и женских половых клеток. У двух рыб гонады по многим признакам были близки к яичникам подопытных генотипических самок, о чем свидетельствовала площадь поперечных срезов гонад (0.51 и 0,42 мм2), количество ооцитов периода превителлогенеза (7.5 и 7.2 на поперечном срезе гонад) и их диаметр (159 и 177 мкм). В половых железах этих рыб мужские половые клетки были представлены одиночными цистами, заполненными сперматоцитами
I порядка. У третьей рыбы площадь срезов гонад составила 0.12 мм2, на их поперечных срезах насчитывали в среднем 2.3 ооцита периода превителлогенеза средним диаметром 93 мкм; эти показатели были ближе к таковым у генотипических самцов. Причем у этой особи правая и левая части гонад значительно различались по состоянию. На одной части гонады сперматогенная ткань, представленная гениями и сперматоцитами I и II порядков, явно преобладала (рис. 6), в другой - преобладали ооциты периода превителлогенеза. Начало активного сперматогенеза у этой особи, вероятно, свидетельствовало о передиф-ференцировке гонад из яичников в семенники.
Рис. 5. Гонада подопытного самца, получавшего эстрадиол.
Возраст 144 суток. А - Всю площадь гонад занимают единичные крупные превителлогенные ооциты; Б - Видно значительное количество превителлогенных ооцитов. Шкала=50 мкм.
Опыт 2. У горбуши, получавшей эстрадиол в возрасте 72-109 суток, через 36 суток после оконания воздействия масса тела варьировала от 540 до 2626 мг (1109.5 84.9); длина - от 43 до 73 мм (51.91.2). Т аким образом, показатели длины и массы тела у рыб в опыте
1 и опыте 2 были сходны, однако оказались достоверно (р<0.001) меньше, чем у контрольной молоди (см. табл. 2). В опыте 2 также, как и в опыте 1, выборка рыб была разделена на самок и самцов условно на основании тех же характеристик половых желез.
У выделенных таким образом самок (17 экз.) площадь среза гонад варьировала от 0.25 до 0.86 мм2. В яичниках присутствовали исключительно превителлогенные ооциты (от 4.3 до 9.5 на срез). Диаметр превителлогенных ооцитов был незначительно меньше, чем у молоди, 72 суток получавшей гормон, и достоверно меньше, чем у контрольных самок (см. табл. 2). У большинства рыб они развивались синхронно, о чем свидетельствовал низкий коэффициент вариации их диаметров (Си до 10%). Однако у 4 самок этой группы с такими же по размерам гонадами среди относительно крупных ооцитов часто находили клетки меньшего диаметра, коэффициент вариации диаметра ооцитов у таких рыб достигал 37%.
У выделенных условно самцов (9 экз.) гонады были достоверно меньше (р<0.001),чем у самок (площадь срезов от 0.02 до 0.23 мм2). У 5 из них можно было обнаружить только превителлогенные ооциты, как правило, немногочисленные (1.5-3.2 на срез). У разных рыб средний диаметр ооцитов существенно различался (от 88 до 189 мкм; см. табл. 2), но при этом у каждой особи это были близкие по размерам ооциты. У других 4 особей, помимо превителлогенных ооцитов (1.5-5.2 на срез), можно было встретить гении и ооциты
Рис. 6. Интерсексуальное состояние гонад у горбуши, получавшей эстрадиол. Возраст 144 суток. Шкала=80 мкм.
ранней профазы мейоза. Ооциты периода превителлогенеза были, как правило, разноразмерные (коэффициент вариации диаметра - до 44%). Некоторые из них, вероятно, только что вступили в превителлогенез, поскольку имели небольшой диаметр (около 30 мкм).
Одна подопытная рыба отличалась по состоянию гонад от всех остальных особей тем, что, помимо гониев и ооцитов ранней профазы мейоза и превителлогенеза, в ее гонадах была обнаружена сперматогенная ткань (сперматогонии и сперматоциты). Гонады этой рыбы были невелики, а по числу и диаметру превителлогенных ооцитов сходны с половыми железами генотипических самцов. В отличие от особи в опыте 1 с аналогичным состоянием гонад, у этой рыбы не было обнаружено резорбирующихся половых клеток.
Обсуждение результатов исследованиий. Согласно представленным в работе наблюдениям у большинства (68%) интактных самцов горбуши инверсия пола была не завершена, в том числе и в возрасте 144 сут. Однако по литературным данным [2,5,7], в сходных условиях содержания окончание инверсии пола у самцов горбуши происходит к возрасту 40-50 сут.
Развитие ооцитов в гонадах у большинства самцов (их диаметр за время наблюдений увеличился с 35-40 мкм до 60-95 мкм) позволяет говорить не о задержке, а о нарушении процесса естественной инверсии пола. Точные причины этого нарушения нам неизвестны, однако можно предположить, что такое нарушение могло произойти вследствие ненамеренного попадания в воду следовых количеств эстрадиола-дипропионата. Это могло произойти при инкубации материала в эмбрионально-личиночный период онтогенеза, поскольку в этот момент рыб содержали в одной системе замкнутого водоснабжения с эмбрионами и личинками горбуши, инъецированными эстрадиолом в желточный мешок. Мы не можем исключать возможность выведения гормона из желточного мешка и его попадания в общую систему рециркуляции воды. Однако каковы бы ни были причины исходного нарушения инверсии пола у самцов горбуши, они, как видно из представленных выше данных, во много раз перекрываются эффектом последующего гормонального воздействия, что позволяет делать корректные выводы на основании сравнительного анализа состояния гонад у контрольных и подопытных рыб.
В отличие от контрольных рыб, среди молоди горбуши, получавшей эстрадиол, не было ни одной особи с типичным для самцов состоянием половых желез (когда фонд половых клеток в гонадах представлен исключительно гониями).
У генотипических самцов через 36 суток воздействия эстрадиолом наблюдалось массовое новообразование ооцитов периода ранней профазы мейоза и их вступление в превителлогенез. В течение последующих 36 суток независимо от того, продолжалось или было прекращено гормональное воздействие (опыт 1 и 2), у них наблюдали формирование
фонда ооцитов периода превителлогенеза. Эти факты свидетельствуют, во-первых, о гормонозависимой активации мейотических циклов половых клеток и, во-вторых, о их вступлении в превителлогенез.
Способностью отвечать на полоспецифическое гормональное воздействие обладали гонады генотипических самцов как с завершенной, так и с незавершенной естественной инверсией пола. Различия исходного состояния гонад у рыб перед началом гормонального воздействия во многом определяли специфику ответной реакции. У самцов с исходно завершенной инверсией пола (когда в гонадах половые клетки представлены только гони-ями) происходило новообразование ооцитов, тогда как у самцов с незавершенной инверсией пола помимо этого ускорялось и развитие имеющихся ооцитов периода превителлогенеза. Соотношение данных процессов, по-видимому, в значительной степени определяло структуру формирующегося у подопытных самцов фонда ооцитов, в который могли входить либо единичные крупные ооциты превителлогенеза (диаметром более 200 мкм), либо многочисленные, но некрупные ооциты (диаметром 75-100 мкм), либо сразу нескольких генераций разноразмерных ооцитов, что характерно для раннего оогенеза полициклично размножающихся рыб.
Гормональная стимуляция формирования фонда ооцитов периода превителлогенеза у самцов горбуши получена впервые; ранее при обработке молоди горбуши эстрадиолом (с кормом) наблюдали появление только ооцитов периода ранней профазы мейоза [9]. Тот факт, что исследователи не наблюдали вступления ооцитов в период превителлогенеза, возможно объясняется недостаточной продолжительностью периодов гормонального воздействия и/или последующего наблюдения.
В отличие от самцов, у самок горбуши гормональная обработка не привела к увеличению числа ооцитов и не стимулировала их рост. У самок в момент начала опыта уже была сформирована генерация превителлогенных ооцитов, и ее пополнения не происходило ни в контроле, ни в опыте при гормональной стимуляции. Напротив, как было показано выше, часть ооцитов периода превителлогенеза у подопытных самок подвергалась дегенерации. У других ооцитов наблюдали значительные изменения морфофункциональной организации цитоплазмы. Появившиеся в цитоплазме ооцитов у подопытных рыб вакуоли по размерам и характеру расположения существенно отличались от кортикальных альвеол. В отличие от последних эти вакуоли были в несколько раз крупнее (до 50-60 мкм) и располагались беспорядочно по всей цитоплазме, а не на ее периферии. Наиболее вероятно, что содержимое таких вакуолей представляло собой вещество липидной природы, которое вымывается в ходе гистологической обработки. Отложение липид-содержащих включений в ооцитах может быть связано как с действием собственно эстрадиола, так и с тем, что при обработке рыб использовали масляный раствор гормона. Выявленные у подопытных самок дегенеративные изменения в гонадах, возможно, могут быть связаны с подавлением (по принципу отрицательной обратной связи) гонадотропной функции гипофиза у подопытных рыб. Аналогичный эффект подавляющего действия эстрогенов, но на ооциты периода трофоплазматического роста был отмечен ранее [11].
У части рыб (4 особи из 50 проанализированных) после обработки эстрадиолом гонады перешли в интерсексуальное состояние: среди ооцитов развивались цисты со сперма-тоцитами I и II порядков, что означало преждевременную, не характерную для самцов горбуши в речной период жизни активацию сперматогенеза. Таких рыб, судя по значительному числу крупных превителлогенных ооцитов в гонадах, можно было отнести к генотипическим самкам. Учитывая, что у подобных особей нередко обнаруживали дегенерацию ооцитов периода превителлогенеза, можно предположить, что дальнейшее продолжение этих противоположных процессов (развитие сперматогенной ткани и дегенерация ооцитов) может привести к повторной передифференцировке гонад в семенники.
Подобное явление (маскулинизации гонад у самок значительно позже завершения естественной инверсии пола) было выявлено ранее у горбуши, содержавшейся в лабораторных условиях и описано как «вторичный гермафродитизм» [2]. Предпосылкой для интерсексуальности и передифференцировки гонад, по-видимому, является асинхронность гаметоге-неза у этих рыб (наличие резервного фонда половых клеток). Приведенные в работе данные свидетельствуют о том, что обработка экзогенным эстрадиолом увеличивает число рыб с асинхронным гаметогенезом, что, по-видимому, и определяет возможность их перехода в интерсексуальное состояние и в дальнейшем передифференцировку яичников в семенники.
Появление интерсексуальных особей после обработки эстрогенами свойственно и другим тихоокеанским лососям, в отличие от горбуши характеризующихся прямой диф-ференцировкой гонад [12].
В литературе описаны случаи «парадоксального» эффекта обработки рыб половыми стероидными гормонами, когда обработка «мужскими» стероидами (тестостероном и его производными) приводила к феминизации гонад у обработанных рыб (так называемая «парадоксальная феминизация») однако случаи «парадоксальной маскулинизации» неизвестны [14]. Эффект «парадоксальной феминизации» авторы связывают, как правило, с ароматизацией андрогенов (и соответственно их превращением в эстрогены).
Механизм маскулинизации гонад у самок при обработке эстрогенами неизвестен, однако, учитывая последовательность синтеза стероидов (андрогены —> эстрогены) и их половую специфику, можно предложить следующую гипотезу. При обработке рыб эстрогеном происходит изменение баланса половых стероидов: высокий уровень эстрогенов приводит к подавлению их собственного синтеза (подавляется ароматизация), а учитывая, что предшественником эстрогенов является тестостерон [10], можно предположить, что происходит повышение концентрации эндогенных андрогенов. Андрогены в свою очередь стимулируют активацию сперматогенеза в гонадах подопытных рыб, что в конечном итоге приводит к смене гормонального статуса особи, дегенерации ооцитов и передиффе-ренцировке гонад в семенники.
Подводя итог, можно отметить, что явление ювенильного гермафродитизма и фактические данные о вторичном гермафродитизме у горбуши, а также выявленная полоспецифическая чувствительность процессов гаметогенеза к эстрогенному воздействию свидетельствуют о высокой пластичности половой дифференцировки гонад у горбуши.
Выводы. 1. После дифференцировки пола у горбуши реакция гонад на воздействие экзогенным эстрадиолом была полосиецифичной и зависела от их исходного состояния. 2. У самцов горбуши обработка экзогенным эстрадиолом стимулировала мейотические циклы половых клеток и их вступление в период цитоплазматического роста. 3. У обработанных эстрадиолом самок горбуши не происходило пополнения фонда ооцитов, что свидетельствует о блокировке мейотических циклов половых клеток после формирования фонда ооцитов периода превителлогенеза; более того, эстрадиол оказывал подавляющее действие на цитоплазматический рост имевшихся у самок ооцитов и вызывал их дегенерацию. 4. У части рыб наблюдался парадоксальный эффект: воздействие женским половым гормоном - эстрадилом - стимулировало развитие сперматогенной ткани и начало сперматогенеза.
Summary
G. Е. Lunev, К. Е. Fedorov, О. V. Zelennikov. Effect of exogenous estradiol on gonadal development of pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha Walb.): treatment of juvenile fish after sex differentiation.
Hormonal mechanisms of early gamethogenesis were investigated in juvenile pink salmon. Fish at the age of 72-144 days were treated by estradiol with food. The gonads of fish were histologically
investigated. Sex specific effect of estradiol treatment was observed in pink salmon after sex differentiation. Estradiol treatment induced the formation of previtellogenic oocytes in male, whereas decreasing number and growth rate of prevetellogenic oocytes was observed in female of pink salmon.
E-mail: LGELGE@mail.ru Литература
1. Баранникова И. А. Гонадотропные и половые гормоны и их роль в регуляции функции воспроизводительной системы у пойкилотермных животных // Труды ВНИРО. 1975. Т. CXI. С. 34-54.2. Зеленников О. В., Федоров К. Е. Сравнительный анализ состояния гонад и формирования пола у молоди горбуши естественного и заводского происхождения в период подкормки и покатной миграции // Отчет по хоздоговору № 4/98. 1998. 3. Зеленников О. В. Сравнительный анализ состояния яичников у молоди тихоокеанских лососей в связи с проблемой становления моноциклии // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43. С.490-498. 4. Лакин Г. Ф. Биометрия. М., 1990. 5. Персов Г. М. Характеристика раннего периода развития половых желез горбуши в связи с использованием ее как объекта акклиматизации // Рыбное хозяйство: Материалы совещ. по вопр. рыбоводства. 1960. С. 89-92.6. Персов Г. М. Передифференцировка гонад у горбуши (Oncorhynchus gorbuscha Walb.) как норма развития // Науч. докл. Высш. шк. Сер. биол. наук. 1965. №1. С. 26-30.7. Персов Г. М. Ранний период гаметогенеза у проходных лососей // Воспроизводство и акклимат. лососевых в Баренцевом и Белом морях. М.; Л., 1966. С. 7-44. 8. Роскин Г. И. Микроскопическая техника. М., 1951.9. Федоров К. Е., Чмилевский Д. А. Реверсия пола у горбуши // Нетрадиционные объекты морского промысла и перспективы их использования: Тезисы докл. научно-практической конференции. Мурманск, 1997. 10. Devlin R. Я., Nagahama Y. Sex determination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological, and environmental influences // Aquaculture. 2002. Vol. 208. P. 191-364.11. Egami N.Jshii S. Hypophyseal control of eproductive function in. teleost fish // Gen. Comp. Endocrinol. 1962. Suppl. 1. P. 248-253. 12. Hunter G. A., Solar 1.1., Baker I. J., Donaldson E. M. Feminization of coho salmon ( Oncorhynchus kisutch) and chinook salmon ( Oncorhynchus tshawytscha) by immersion of alevins in a solution of estradiol-17p // Aquaculture. 1986. Vol. 53. P. 295-302. 13. Pandian T. J., Sheela S. G. Hormonal induction of sex reversal in fish // Aquaculture. 1995. Vol. 138. P. 1-22. 14. PiferrerF. Endocrine sex control strategies for the feminization of teleost fish // Aquaculture. 2001. Vol. 197. P. 229-281. 15. Schreck, C.B. Hormonal treatment and sex manipulation in fishes // Control of Sex in Fishes. 1974. P. 84-106. 16. Yamamoto T. Sex differentiation // Fish Physiology. 1969. Vol. III. P. 117-175.
Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.
