CC BY
192
„ J. • і Л' - > / ; •••• i
і' ■*•*: " h'-‘if * Г W. «Г ■'% ' ri ; ■iSf t jjp'* v-i.. f \
I ISSN 2304-9081
ІЖШР
Учредители:
Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© Коллектив авторов, 2012 УДК 579.61
1 ? 1 1 О.Л. Карташова , А.В. Ткачев2, Т.М. Уткина , Л.П. Потехина
ВЛИЯНИЕ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ ПОЛЫНИ НА РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ИМИ БИОПЛЕНОК
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск, Россия
Цель. Изучение антимикробной активности эфирных масел полыни в отношении различных видов микроорганизмов, а также их влияния на способность микроорганизмов формировать биопленки.
Материалы и методы. Материалом послужили условно-патогенные микроорганизмы разных видов и 21 эфирное масло полыни. Антимикробную активность эфирных масел определяли бактериологическим методом, биопленкообразование микроорганизмов исследовали фотометрическим методом.
Результаты. Отобраны эфирные масла полыни, обладающие бактерицидной активностью. Установлена способность изученных эфирных масел полыни снижать биопленкооб-разование S. epidermidis, E. coli и C. albicans.
Заключение. Проведенные исследования открывают перспективу для дальнейшего изучения эфирных масел полыни в качестве вспомогательных средств, пригодных для терапии как острых инфекционно-воспалительных заболеваний, так и ассоциированных с перси-стирующей микрофлорой.
Ключевые слова: микроорганизмы, эфирные масла полыни, биопленки O.L. Kartashova 1, A. V. Tkachev2, T.M. Utkina 1, L.P. Potekhina1
INFLUENCE OF ESSENTIAL OILS OF WORMWOOD OF MICROORGANISM GROUTH AND BIOFILM FORMATION
1 Institute of cellular and intracellular symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia
2
N.N.Vorozhtov Novosibirsk Institute of organic chemistry SB RAS, Novosibirsk, Russia
Objective. Studying of antimicrobic activity of essential oils of a wormwood concerning different types of microorganisms, and also their influence on ability of microorganisms to form biofilms.
Materials and methods. Opportunistic microorganisms of different types and 21 essential oils of a wormwood were served as material. Antimicrobic activity of essential oils was determined by a bacteriological method, a biofilm formation of microorganisms was investigated by photometric method.
Results. The essential oils of a wormwood possessing bactericidal activity are selected. Ability of the studied essential oils of a wormwood to reduce biofilm formation of S. epidermidis, E. coli and C. albicans is established.
Conclusion. The data obtained prospect for further studying of essential oils of a wormwood as the supportive applications suitable for therapy both of sharp infectious and inflammatory diseases, and associated with persistent microflora.
Key words: microorganisms, essential oils of a wormwood, biofilms
Введение.
В настоящее время накоплено значительное количество экспериментальных данных, дающих основание сделать вывод о нарастающем распространении резистентных к антибиотикам микроорганизмов [2]. Вклад в решение этой проблемы могут внести фитопрепараты, сочетающие антимикробные свойства с противовоспалительным и регенерирующим действием [3]. Исследования последних лет показали, что природные популяции бактерий существуют, в основном, в виде закрепленных на субстратах биопленках, в составе которых микроорганизмы способны обмениваться сигналами и проявлять координационную активность, свойственную многоклеточным организмам, а также выживать в условиях макроорганизма [7]. Поиск эффективных растительных средств привел к изучению нового объекта - эфирных масел растений, в частности полыни. Известно, что настойки полыни обладают антибактериальной активностью против грамположительных микроорганизмов и нетоксичны для макроорганизма [6].
В связи с вышеизложенным целью работы явилось изучение антимикробной активности эфирных масел полыни в отношении различных видов микроорганизмов, а также их влияния на способность микроорганизмов формировать биопленки.
Материалы и методы.
В работе были использованы культуры Staphylococcus aureus (n=6), S. epidermidis (n=6), Escherichia coli (n=6), Candida albicans (n=6), выделенные от больных с венозно-трофическими язвами нижних конечностей. Идентификацию бактерий проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и биохимических свойств с использованием STAPHYtest, ENTEROtest («Lachema», Чехия). Идентификацию грибов рода Candida проводили согласно методикам Ребровой Р.Н. [5].
Материалом для исследования послужили эфирные масла полыней: Artemisia abrotanum, Artemisia glauca Pall. ex Willd., Artemisia nitrosa Web. ex Stechm., Artemisia dracunculus L., Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess., Artemisia obtusiloba Ledeb., Artemisia tanacetifolia L., Artemisia absinthium L., Artemisia pontica L., Artemisia santolinifolia, Artemisia scoparia Waldst. et Kit., Artemisia sieversiana Willd., Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess., Artemisia frigida Willd.,
полученные в лаборатории терпеновых соединений (зав. лабораторией, д.х.н., профессор А.В. Ткачев) Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН и предоставленные нам под лабораторными шифрами, каждый из которых является уникальным идентификатором образца, связывающим все характеристики и спектрально-аналитические данные с видовой принадлежностью, точными географическими координатами сбора и экологической приуроченностью исследуемого вида растения.
Антибактериальную активность эфирных масел определяли по М.О. Биргеру [1]. Образование микроорганизмами биоплёнок оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных поли-стироловых планшетах [12]. Коэффициент биопленкообразования (КБ) рассчитывали как отношение А540 опыт/ А540 контроль, положительными считали значения более 1,1. Изучение регуляции способности микроорганизмов к биоплен-кообразованию исследуемыми эфирными маслами осуществляли по методике Д.А. Кириллова [4].
Результаты и их обсуждение.
При изучении влияния эфирных масел полыни на бактерии, было установлено, что бактерицидной активностью в отношении S. epidermidis, S. aureus и E. coli обладали эфирные масла Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-07), Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-70), Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. (LTS-06-26), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-06-44), Artemisia sieversiana Willd. (LTS-11-54); S. epidermidis и E. coli - Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. (LTS-00-25), Artemisia pontica L. (LTS-05-27) и Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. (LTS-11-60); S. aureus - Artemisia tanacetifolia L. (LTS-05-05), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-05-38); S. epidermidis - Artemisia absinthium L. (LTS-05-03); E. coli - Artemisia obrotanum (LTS-00-01), Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. (LTS-01-02), Artemisia frigida Willd. (LTS-11-59).
Бактериостатическое действие (рост единичных колоний) на S. epidermidis оказывали масла Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-06-02) и Artemisia frigida Willd. (LTS-11-59), на E.coli Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-11-09) (табл. 1).
Вместе с тем, на C. albicans изученные эфирные масла полыни не оказывали бактерицидного действия, единичные колонии грибов вырастали после соинкубирования с маслами Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-70), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-11-09), Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-08-14).
Таблица 1. Антимикробная активность эфирных масел полыни
Эфирные масла Рост микроорганизмов (КОЕ/мл)
& epidermidis S. aureus E. шИ C. albicans
Контроль 5*105 5*105 5*105 5*104
LTS-00-01 Artemisia abrotanum 5*105 5*106 Роста нет 1*105
LTS-00-02 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 5*105 5*105 1*105 1*106
LTS-00-25 Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. Роста нет 5*105 Роста нет 5*105
LTS-00-42 Artemisia dracunculus L. 1*107 1*106 1*105 5*105
LTS-01-02 Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. <1*103 1*103 Роста нет 5*105
LTS-02-07 Artemisia obtusiloba Ledeb. Роста нет Роста нет Роста нет 5*105
LTS-02-70 Artemisia obtusiloba Ledeb. Роста нет Роста нет Роста нет Единичные колонии
LTS-04-05 Artemisia tanacetifolia L. 1*105 Роста нет 5*104 1*105
LTS-05-03 Artemisia absinthium L. Роста нет 5*105 5*104 1*103
LTS-05-27 Artemisia pontica L. Роста нет <1*103 Роста нет 1*104
LTS-05-38 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 5*105 Роста нет 5*104 1*105
LTS-06-02 Artemisia glauca Pall. ex Willd. Единичные колонии 5*105 1*103 1*103
LTS-06-24 Artemisia dracunculus L. 1*105 1*105 <1*103 5*105
LTS-06-26 Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. Роста нет Роста нет Роста нет 1*103
LTS-06-44 Artemisia glauca Pall. ex Willd. Роста нет Роста нет Роста нет <1*103
LTS-08-14 Artemisia scoparia Waldst. et Kit. 5*105 5*106 1*103 Единичные колонии
LTS-11-09 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 5*105 1*106 Единичные колонии Единичные колонии
LTS-11-50 Artemisia scoparia 1*105 1*106 <1*103 1*104
LTS-11-54 Artemisia sieversiana Willd. Роста нет Роста нет Роста нет 1*104
LTS-11-59 Artemisia frigida Willd. Единичные колонии 1*103 Роста нет 1*106
LTS-11-60 Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. Роста нет 1*105 Роста нет 1*105
Б
Наряду с бактерицидным эффектом, изученные эфирные масла полыни оказывали также индифферентное, стимулирующее и подавляющее (бактерио-статическое) действие на рост микроорганизмов.
Эфирные масла Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02), Artemisia absinthium L. (LTS-05-03), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-06-02), Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. (LTS-00-25) не оказывали влияния на рост S. aureus, а эфирные масла Artemisia obrotanum (LTS-00-01), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-05-38), Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-06-44), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-11-09) - на рост S. epidermidis.
Эфирные масла Artemisia obrotanum (LTS-00-01), Artemisia dracunculus L. (LTS-00-42), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-11-09), Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-11-50) стимулировали рост золотистого стафилококка, а масло Artemisia dracunculus L. (LTS-00-42) - эпидермального стафилококка.
Рост C. albicans стимулировали эфирные масла Artemisia obrotanum (LTS-00-01), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02), Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. (LTS-00-25), Artemisia dracunculus L. (LTS-00-42), Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. (LTS-01-02), Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-07), Artemisia tanacetifolia L. (LTS-04-05), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-05-38), Artemisia dracunculus L. (LTS-06-24), Artemisia frigida Willd. (LTS-11-59) и Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. (LTS-11-60).
Под воздействием эфирных масел Artemisia tanacetifolia L. (LTS-04-05), Artemisia dracunculus L. (LTS-06-24) и Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-11-50) число выросших колоний S. epidermidis снижалось до 1*105 КОЕ/мл, а при влиянии эфирного масла Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. (LTS-01-02) - до <1*103 КОЕ/мл.
В пять раз снижалось число выросших колоний S. aureus под воздействием эфирных масел Artemisia dracunculus L. (LTS-06-24) и Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. (LTS-11-60); до 1*103 КОЕ/мл - после соинкубирования золотистых стафилококков с эфирными маслами Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. (LTS-01-02) и Artemisia frigida Willd. (LTS-11-59); до <1*103 КОЕ/мл - с эфирным маслом Artemisia pontica L. (LTS-05-27).
При изучении антимикробной активности эфирных масел полыни в отношении E. coli установлена их способность лишь подавлять рост данного мик-
6
роорганизма. Так, после соинкубирования кишечной палочки с эфирными маслами Artemisia tanacetifolia L. (LTS-04-05), Artemisia absinthium L. (LTS-05-03), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-05-38) число выросших колоний E.coli снижалось до 5*104 KOЕ/мл; с Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02) и Artemisia dracunculus L. (LTS-00-42) до 1*105 ^Е/мл; с Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-06-02) и Artemisia scoparia (LTS-08-14) до 1*103 KOЕ/мл; с Artemisia dracunculus L. (LTS-06-24) и Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-11-50) до <1*103 ШЕ/мл.
Проведенные исследования позволили также отобрать эфирные масла, подавляющие рост C. albicans: Artemisia pontica L. (LTS-05-27), Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-11-50), Artemisia sieversiana Willd. (LTS-11-54).
На следующем этапе работы определено влияние эфирных масел полыни, не обладающих бактерицидной активностью, на способность микроорганизмов к биопленкообразованию (БПO) и установлено их разнонаправленное действие: индифферентное, стимулирующее и ингибирующее (табл. 2).
Из данных, представленных в таблице, видно, что изученные эфирные масла оказывали, преимущественно, ингибирующее действие на способность S. epidermidis к биопленкообразованию (по сравнению с контролем), за исключением эфирного масла Artemisia dracunculus L. (LTS-00-42), стимулирующего данный признак. После соинкубирования эпидермального стафилококка с эфирным маслом Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. (LTS-01-02) микроорганизм утратил данное свойство (KB <1,1).
Аналогичные данные получены и при изучении способности к BnO E. coli после соинкубирования с эфирными маслами: KB, преимущественно, снижался, исключение составили эфирное масло Artemisia scoparia Waldst. et Kit. (LTS-08-14), стимулирующее KB, а также эфирные масла Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02), Artemisia tanacetifolia L. (LTS-04-05), не изменяющие KB кишечной палочки.
KB C. albicans после их соинкубирования с эфирными маслами Artemisia sieversiana Willd. (LTS-11-54) и Artemisia frigida Willd. (LTS-11-59) снизился незначительно (до 1,1), тогда как под влиянием остальных изученных эфирных масел полыни грибы утрачивали способность к биопленкообразованию. Эфирные масла полыни, напротив, в основном, стимулировали BnO S. aureus, за исключением Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-00-02) и Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. (LTS-00-25), которые не оказывали влияния на данное свойство.
Таблица 2. Влияние эфирных масел полыни на биопленкообразование микроорганизмов
Эфирные масла Kоэффициент биопленкообразования (усл. ед.)
& epidermidis S. aureus E. шИ C. albicans
^нтроль 2,0±0,1 1,4±0,1 1,4±0,1 1,2±0,1
LTS-00-01 Artemisia abrotanum 1,6±0,04 1,5±0,1 Роста нет 0,9±0,01
LTS-00-02 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 1,7±0,1 1,4±0,1 1,41±0,01 0,9±0,02
LTS-00-25 Artemisia nitrosa Web. ex Stechm. Роста нет 1,4±0,1 Роста нет 0,9±0,1
LTS-00-42 Artemisia dracunculus L. 2,4±0,3 1,5±0,002 1,3±0,1 0,87±0,02
LTS-01-02 Artemisia macrocephala Jacq. ex Bess. 0,5±0,1 2,5±0,1 Роста нет 0,93±0,01
LTS-02-07 Artemisia obtusiloba Ledeb. Роста нет Роста нет Роста нет 0,93±0,01
LTS-02-70 Artemisia obtusiloba Ledeb. Роста нет Роста нет Роста нет 0,85±0,01
LTS-04-05 Artemisia tanacetifolia L. 1,6±0,1 Роста нет 1,4±0,02 1,03±0,02
LTS-05-03 Artemisia absinthium L. Роста нет 1,6±0,2 1,2±0,02 0,89±0,02
LTS-05-27 Artemisia pontica L. Роста нет 1,6±0,05 Роста нет 1,03±0,02
LTS-05-38 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 1,5±0,1 Роста нет 1,22±0,1 0,95±0,1
LTS-06-02 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 1,6±0,1 1,6±0,1 1,21±0,1 1,0±0,03
LTS-06-24 Artemisia dracunculus L. 1,4±0,1 1,7±0,2 1,24±0,2 1,0±0,1
LTS-06-26 Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. Роста нет Роста нет Роста нет 1,02±0,1
LTS-06-44 Artemisia glauca Pall. ex Willd. Роста нет Роста нет Роста нет 0,95±0,03
LTS-08-14 Artemisia scoparia Waldst. et Kit. 1,7±0,1 1,9±0,08 1,7±0,02 1,0±0,02
LTS-11-09 Artemisia glauca Pall. ex Willd. 1,5±0,1 1,7±0,07 1,1±0,02 1,04±0,02
LTS-11-50 Artemisia scoparia 1,7±0,1 1,8±0,003 1,3±0,03 1,03±0,01
LTS-11-54 Artemisia sieversiana Willd. Роста нет Роста нет Роста нет 1,1±0,01
LTS-11-59 Artemisia frigida Willd. 1,8±0,1 1,5±0,005 Роста нет 1,1±0,1
LTS-11-60 Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. Роста нет 1,9±0,1 Роста нет 1,04±0,02
в
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2012, №3 Заключение.
Таким образом, проведенные исследования по изучению антимикробного действия эфирных масел полыни и их влияния на образование биопленок бактериями видов S. epidermidis, S. aureus, E. coli, а также грибами C. albicans позволили отобрать эфирные масла полыни, обладающие антибактериальным действием: Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-07), Artemisia obtusiloba Ledeb. (LTS-02-70), Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. (LTS-06-26), Artemisia glauca Pall. ex Willd. (LTS-06-44), Artemisia sieversiana Willd. (LTS-11-54). Вместе с тем, среди изученных образцов, не выявлено эфирных масел, обладающих фунгицидным действием.
В настоящее время доказана роль микробных биопленок в развитии целого ряда инфекций человека [9] и, в связи с этим, необходимо оценивать не только антимикробное действие препаратов, но и их влияние на биопленкооб-разование микроорганизмов. При изучении влияния эфирных масел полыни на БПO установлено, что они оказывали, преимущественно, ингибирующее действие на способность S. epidermidis и E. coli к образованию биопленок, причем наиболее эффективно (с утратой способности) подавляли биопленкообразова-ние C. albicans. Полученные данные представляют интерес в связи с многочисленными сведениями о формировании биопленок Candida sp., что обеспечивает им устойчивость к различным противогрибковым препаратам [8, 13, 14].
Проведенные исследования открывают перспективу для дальнейшего изучения эфирных масел полыни в качестве вспомогательных средств, пригодных для терапии как острых инфекционно-воспалительных заболеваний, так и ассоциированных с персистирующей микрофлорой.
(Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-С-4-1022 «Регуляция биологических свойств микроорганизмов растительными экстрактами как основа разработки антибактериальных средств»)
Литература.
1. Биргер M.O. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982. 464с.
2. Бурмистрова А.Л., Бахарева Л.И., Шафикова Н.Э. Антибиотики и антибиотикорезистент-ность. Проблемы и пути решения. Челябинск: Челябинский дом печати, 2002. 178с.
3. Золотарев П.Н. Выявление и определение антибактериальных свойств фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, и индивидуальных8 веществ // Медицинский вестник Башкортостана. Специальный выпуск. 2006. №1. С. 131-135.
4. Кириллов Д.А. Лекарственная регуляция персистентных свойств микроорганизмов: Ав-тореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2004. 22 с.
5. Реброва Р.Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. М.: Медицина, 1989. 125 с.
6. Супильникова А.В., Супильников А.А. Фитохимическое исследование травы полыни эстрагон и возможности применения препарата на ее основе в медицинской практике // Сб. статей молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». Томск, 2002. 254 с.
7. Толордава Э.Р., Тиганова И.Г., Алексеева Н.В. и др. Микрофлора почечных камней при мочекаменной болезни и поиск средств борьбы с биопленками уропатогенных бактерий // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.. 2012. №4. С. 56-62.
8. Bachmann S., VandeWalle K., Ramage G. et al. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46 (11): 3591-6.
9. Casterton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. 1999. 284: 1318-1322.
10. Dorman H.J.D., Deans S.G. Antimicrobial agents from plants: antimicrobial activity of plant volatile oils // J. Appl. Microbiol. 2000. 88: 308-306.
11. Hammer K.A., Carbon C.F., Riley T. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts // J. Appl. Microbiol. 1999. 86: 985-990.
12. Merrit J.H., Kadouri D.E., O'Toole G.A. Growing and analyzing static biofilms // Curr. Protoc. Microbiol. 2005. 1: 135-139.
13. Mukherjee P., Chandra J. Candida biofilm resistance // Drug. Resis.t Updat. 2004. 7(4-5): 3019.
14. Vediyappan G., Rossignol T., d'Enfert C. Interaction of Candida albicans Biofilms with Anti-fungals: Transcriptional Response and Binding of Antifungals to Beta-Glucans // Antimicrob. Agents Chemother. 2010. 54 (5): 2096-2111.
Поступила 21.09.2012
(Контактная информация: Потехина Лидия Петровна - к.м.н., старший научный сотрудник
Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, 460014 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел. 8 (3532) 774463, e-mail: labpersist@mail.ru)
