CC BY
23
РАЗДЕЛ II. БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 582.263(265.52)
Т.А. Клочкова1'2, Н.Г. Клочкова1 , С.О. Очеретяна1, Г.Х. Ким2
'Камчатский государственный технический университет, Петропавловск-Камчатский, 683003;
2Национальный университет Конджу, Конджу 32588, Корея e-mail: tatyana_algae@mail.ru, ghkim@kongju.ac.kr
ВЛИЯНИЕ ДОЛГОВРЕМЕННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ НА МОРСКИЕ ЗЕЛЕНЫЕ ВОДОРОСЛИ PRASIOLA DELICATA И ROSENVINGIELLA CONSTRICTA (CHLOROPHYTA, PRASIOLALES)
В статье обсуждается способность к восстановлению активной жизнедеятельности у камчатских морских супралиторальных видов зеленых водорослей Prasiola delicata и Rosenvingiella constricta после 3-4-летнего экстремального обезвоживания. В ходе экспериментов изучали три разные по морфологии группы растений, принадлежащие к двум биологическим видам: P. delicata (линейные пластины) и R. constricta (многорядные нити с перетяжками и капюшончатые пластины, морфотип «constricta» и мор-фотип «prasiola», соответственно). Собранные растения высушивали в силикагеле до практически полного удаления внутриклеточной жидкости и далее хранили при температуре 4°С в пробирке с силикагелем. Их обводнение в морской воде через разные промежутки времени показало, что P. delicata и R. constricta (морфотип «constricta») могут восстанавливаться и формировать автоспоры даже через четыре года после иссушения, а капюшончатые растения R. constricta (морфотип «prasiola») сохраняют жизнеспособность в течение трех лет. Окрашивание регидрированных клеток флуоресцентным диацетатом показало, что на возобновление происходящих в цитоплазме метаболических реакций требовалось 4-12 дней после регид-ратации образцов. Размножение у всех регидрированных растений осуществлялось автоспорами. Их формирование начиналось от краев пластины, и по мере высыпания процесс фертилизации пластин охватывал практически все растение. Таким образом, оба морфотипа R. constricta и P. delicata демонстрируют исключительную способность к выживанию в условиях долговременного экстремального иссушения даже почти при 100%-й потере внутриклеточной жидкости.
Ключевые слова: абиотический стресс, выживаемость, флуоресцентный диацетат, зеленые водоросли, обезвоживание, регидратация, Prasiola, Rosenvingiella.
T.A. Klochkova1,2, N.G. Klochkova1, S.O. Ocheretyana1, G.H. Kim2 ^Kamchatka State Technical University, Petropavlovsk-Kamchatsky, 683003; 2Kongju National University, Kongju 32588, Korea) Effect of long-term desiccation on the marine green algae Prasiola delicata and Rosenvingiella constricta (Chlorophyta, Prasiolales)
This paper discusses desiccation tolerance and ability to recover and successfully reproduce after 3-4 years of drying in the marine supra-tidal green algae Prasiola delicata and Rosenvingiella constricta from Kamchatka. We collected 3 types of plants with different morphologies belonging to 2 species, such as P. delicata (small linear blades) and R. constricta (multiseriate filaments with constrictions and hood-like small uniseriate blades, hereafter called R. constricta morphotype "constricta" and morphotype "prasiola", respectively). Collected samples were dried in silica gel to the state when they lost almost 100% of intracellular water and became fragile and crisp. Thereafter, they were held at 4°С condition while being inside silica gel-filled plastic tubes. Rehydration experiments showed that P. delicata and R. constricta morphotype "constricta" could revive in seawater after 4 years of desiccation and began reproduction by autospores, whereas hood-like blades of R. constricta morphotype "prasiola" were able to survive 3 years of desiccation. Alive cell staining with fluorescein diacetate (FDA) showed that after rehydration, cells required 4-12 days to recover metabolic processes in the cytoplasm. Reproduction by autospores was observed in all rehydrated plants, usually starting from the margins of thalli and later covering almost the entire plants' surface. Therefore, species P. delicata and R. constricta, including both of its morphotypes, should be regarded as organisms capable of extreme desiccation, since they remain viable for at least 3-4 yeаrs after loosing almost 100% of intracellular water.
Funding statement: This research was supported by Golden Seed Project, Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA), Ministry of Oceans and Fisheries (MOF), Rural Development Administration (RDA) and Korea Forest Service (KFS). This research was also a part of the project "Development of selection techniques of suitable industrial variety in Korean coast", funded by the Ministry of Oceans and Fisheries, Korea, to GHK.
Key words: abiotic stress, desiccation, fluorescein diacetate, green algae, rehydration, Prasiola, Rosenvingiella, survivability.
DOI: 10.17217/2079-0333-2015-34-33-45
Введение
Представители отдела Prasiolales (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) принадлежат к одной из наиболее распространенных групп зеленых водорослей. Роды этого отдела представлены морскими, пресноводными и почвенными видами, и гораздо чаще их регистрировали в холодноуме-ренных, полярных и антарктических регионах [1-6], хотя они распространены и в теплоумерен-ных и тропических регионах [7-8]. Морфологию празиоловых характеризуют определенное разнообразие и высокая фенотипическая пластичность, во многом зависящая от факторов окружающей среды [9]. Они представлены простыми одно- и многорядными нитями, лентообразными или более-менее широкими пластинами капюшончатой формы и даже колониальными формами, состоящими из «пакетов» клеток.
Наиболее многочисленными по количеству видов родами в отделе Prasiolales являются Prasiola (C. Agardh) Meneghini и Rosenvingiella Silva, включающие 34 и 6 видов морских, пресноводных и почвенных водорослей, соответственно [10]. Известно, что их представители предпочитают местообитания с высоким содержанием органического азота [11-13]. Поэтому обычным местообитанием морских представителей этих родов являются скалистые участки побережья, часто посещаемые морскими птицами, птичьи базары [6], места обитаний колоний пингвинов [2]. Очевидно, что морские птицы, совершающие дальние миграции, способствовали распространению празиоловых и формированию у них чрезвычайно широких ареалов. Камчатские морские колониальные птицы в этом отношении не представляли исключения. Об этом можно судить по тому, что белое оперение многих морских чаек на птичьих базарах Ава-чинского залива (юго-восточная Камчатка) часто бывает покрыто зеленым налетом водорослей (рис. 1).
Водоросли, обитающие на скалах в зоне брызг, в супралиторали или в самом верхнем этаже первого горизонта литорали, подвержены крайне неблагоприятным условиям окружающей среды, таким как регулярное иссушение во время отливов [6, 14-15], повторяющиеся циклы замерзания и таяния в холодные осенне-зимние месяцы и высокий уровень солнечной радиации в летние месяцы [16-19]. Известно, что криоагентом, защищающим клетки Prasiola от перемерзания, служит аминокислота пролин, а от солнечной радиации их защищают микоспорин-подобные аминокислоты [17, 20-22]. Выделенное недавно вещество, защищающее клетки почвенной водоросли Prasiola calophylla от вредного воздействия ультрафиолетовой радиации, было названо «празиолин» [22]. В химическом отношении это - ^[5,6гидрокси-5(гидроксиметил)-2-метокси-3-оксо-1-цикохексен-1-ил] глютаминовая кислота.
Из научной литературы известно, что представители родов Prasiola и Rosenvingiella способны переносить значительное обезвоживание [6, 23-24], однако никем из исследователей не было установлено, какой период иссушения и какая степень обезвоживания являются критичными для сохранения у них жизни. Между тем эти сведения чрезвычайно важны для понимания механизмов сохранения биоразнообразия видов в морских прибрежных экосистемах.
Камчатские представители родов Prasiola и Rosenvingiella были собраны нами в августе 2011 г. в Авачинском заливе у о. Старичков и послужили объектом изучения устойчивости пра-зиоловых водорослей к долговременному абиотическому стрессу - экстремальному иссушению и определения их способности к восстановлению активной жизнедеятельности при регидрата-ции. Ниже обсуждаются результаты, полученные в ходе этих исследований.
Рис. 1. Место обитания видов Prasiola и Rosenvingiella на юго-восточной Камчатке: а - боковая стенка скалистого острова во время отлива с супралиторальным поясом зеленых водорослей, образованным Prasiola и Rosenvingiella; б - гнездовья морских чаек, обитающих в местах распространения празиоловых водорослей. Белые пятна на камнях - птичий помет; на оперении брюшка чаек видны зеленые пятна (показано стрелкой)
Fig. 1. Collection site of Prasiola and Rosenvingiella species on southeastern coast of Kamchatka: а - small rocky island during low tide, with green-colored sub-tidal algae belt visible on the stones; б - nests of seagulls on the stones. White spots on stone surfaces are birds' droppings; arrow points to a bird with green feathering because of attached algae
Материалы и методы
Изучение влияния абиотического стресса проводили следующим образом. Пробы водорослей были собраны 7 августа 2011 г. на скалистой супралиторали о. Старичков (Авачинский залив). Для отделения растений от пористого скального грунта использовали специальный скребок. Собранные растения поместили в пластиковые пакеты объемом 1 л и по возвращении в лабораторию положили в морозильную камеру при температуре -10°С. При этом образцы не были сухими и содержали небольшое количество воды, но не были в нее погружены. В таком виде образцы пролежали в морозильной камере до 6 октября 2011 г., то есть 60 дней. Затем их
вынули из морозильной камеры и одну неделю хранили при комнатной температуре. После этого для повторного стресса образцы снова поместили в морозильную камеру при температуре -18°С на две недели. Затем они были подвергнуты оттаиванию и высушиванию в силикаге-ле. Высушенные образцы завернули в бумажную салфетку и поместили в плотно закупоренную пробирку объемом 50 мл, наполненную силикагелем на 50% объема; один раз в год силикагель заменяли на новый. В сухом виде образцы хранили в холодильнике при температуре 4°С в течение 4 лет (до ноября 2015 г.).
Таким образом, в течение четырех лет образцы подвергли следующему непрерывному абиотическому стрессу: 1) медленная заморозка при температуре -10°С, полное отсутствие света (60 дней) ^ 2) оттаивание и выдерживание при комнатной температуре (7 дней) ^ 3) медленная заморозка при температуре -18°С, полное отсутствие света (14 дней) ^ 4) оттаивание и выдерживание при комнатной температуре (1 день) ^ 5) высушивание в силикагеле, хранение при температуре 4°С, полное отсутствие света (4 года).
Через разные промежутки времени (1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 месяцев, 2, 3, 4 года) небольшое количество сухих растений переносили пинцетом в стерильную морскую среду для культивирования -IMR medium, составленную по методике, описанной в работе Klochkova et al. [25]. Чашки Петри с образцами переносили в инкубационный шкаф емкостью 2 м , поддерживающий постоянную температуру (15°С) и освещение (30 цмоль фотонм 2 с \ 12 ч света : 12 ч темноты). Контроль за состоянием культивируемого материала проводили ежедневно. Для этого чашки Петри просматривали под инверсионным микроскопом (Olympus IX70).
Для изучения объектов в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) сухие растения помещали на покровное стекло, покрытое липкой карбонатной лентой, прикрепленное к держателю образцов для СЭМ. После этого образцы напыляли коллоидным золотом и помещали в сканирующий электронный микроскоп JEOL-35 (JEOL, Tokyo, Japan) для дальнейших исследований.
Для определения живых клеток в высушенных в течение трех и четырех лет талломах зеленых водорослей использовали флуорохромный краситель флуоресцентный диацетат (fluorescein diacetate, Sigma), который позволяет отличать живые клетки и мертвые и определять целостность плазмолеммы [26]. Сухой порошок ФДА разводили в 100 %-м ацетоне в концентрации 1 мг/мл и после полного растворения порошка полученный раствор разводили в морской среде для культивирования водорослей (IMR medium) в концентрации 100 мкл раствора на 1 мл воды. Талломы водорослей погружали в этот раствор и выдерживали в нем 10-15 мин. Затем их переносили в чистую морскую воду и тщательно отмывали от раствора во избежание артефактов при исследовании под микроскопом. Все описанные выше процедуры проводили на льду, при этом препарат и образцы защищали от попадания на них света алюминиевой фольгой. Препараты исследовали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом Olympus IX71 (Fluoview FV500).
Результаты
В августе 2011 г. на о. Старичков на разных скалах (далее по тексту: места № 1 и № 2) нами были обнаружены плотные заросли Prasiola delicata (более 99% всех растений на месте № 1) и Rosenvingiella constricta (98,6% растений в пробе, собранной на месте № 2). На месте № 2 среди растений R. constricta попадались редкие капюшончатые пластины Prasiola (1,4% растений в пробе). Смешения растений разных видов на местах № 1 и 2 зарегистрировано не было. Всего нами было собрано три типа растений с разной морфологией, принадлежащих к двум биологическим видам: Prasiola delicata (линейные пластины) и Rosenvingiella constricta (многорядные нити с перетяжками и капюшончатые пластины, в дальнейшем называемые нами R. constricta морфотип «constricta» и R. constricta морфотип «prasiola», соответственно). Видовая принадлежность каждого образца была подтверждена в ходе молекулярно-филогенетического анализа. Подробно эти данные будут обсуждаться в другой публикации авторов настоящей статьи.
В клетках собранных зеленых водорослей не было вакуолей, или же они были настолько мелкими, что оставались не различимыми под световым микроскопом. Цитоплазма всех клеток была плотной, большую часть их объема занимал одиночный хлоропласт.
Сопутствующими видами в каждой пробе были нитчатые и коккоидные сине-зеленые водоросли, зеленая микроводоросль ЕШос1аЛа sp. и пеннатные диатомовые Nitzschia spp., однако количество этих видов было минимальным, и все они становились распознаваемыми только в ходе дальнейшего лабораторного культивирования празиоловых водорослей. Во всех пробах было повышенное количество бактерий, поскольку они были собраны в местах обитания морских птиц.
Часть собранных водорослей из каждой пробы высушили в силикагеле, завернули в сухую бумажную салфетку и поместили на хранение в плотно закупоренную пробирку, наполненную сили-кагелем на 50% объема, и один раз в год силикагель заменяли на новый. Наличие в образце остаточной воды можно определить по цвету силикагеля, так как при соприкосновении с жидкостью он меняет цвет с темно-синего на фиолетовый. Весь период хранения образцов цвет силикагеля всегда оставался темно-синим, что свидетельствовало о том, что внутриклеточная жидкость в пробе отсутствует. Высушенные до такого состояния растения были ломкими, электризовались и разлетались, подобно частицам пыли. Микрофотографии высушенных в силикагеле водорослей, сделанные с использованием сканирующего электронного микроскопа, представлены на рис. 2.
Рис. 2. Микрофотографии высушенных в силикагеле водорослей в сканирующем электронном микроскопе: а - в - талломы Prasiola delicata и Rosenvingiella constricta. Поверхность высушенных растений покрыта многочисленными мелкими и крупными кристаллами морской соли (рис. а, показано стрелками). В пробах попадались растения, клеточная стенка которых была рыхлой и распадалась на отдельные волоконца (рис. б, показано стрелкой). Среди зеленых водорослей изредка попадались ниточки цианобактерий (рис. в, показано стрелкой), но в целом в пробах было минимальное количество сопутствующих организмов; г - иссушенная пластина R. constricta морфотип «prasiola», место № 2. Стрелками показаны разломы и трещины, образовавшиеся на поверхности обезвоженной сморщенной пластины
Fig. 2. Scanning electron micrographs of the silica-gel dried green algae: а - в -Prasiola delicata and Rosenvingiella constricta thalli. Numerous sea salt crystals of varying sizes were attached to the surfaces of the desiccated plants (fig. a, arrows). Some plants had loose cell wall, which disintegrated into separate fibers (fig. б, arrows). Filamentous blue-green algae were sometimes visible among the green algae (fig. в, arrow); however, on overall all samples had a minimal number of accompanying organisms; г - desiccated blade of R. constricta morphotype "prasiola", with furrows (dashed arrow) and cracked cavities on its dried shrunken surface (arrow)
В иссушенном состоянии водоросли хранились при температуре 4°С. Через разные промежутки времени (1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 месяцев, 2, 3, 4 года) их небольшое количество переносили из пробирки в стерильную морскую воду для изучения способности к восстановлению.
Оказалось, что среди всех обнаруженных в пробах организмов самыми не устойчивыми к иссушению были диатомовые и ЕШос1аЛа sp., поскольку они сохранялись живыми в сухом виде 3 и 12 месяцев, соответственно. Виды цианобактерий и зеленые водоросли Р. delicata и Я. сотМ^а морфотип «сошШсШ» оказались крайне устойчивыми к экстремальному иссушению, поскольку могли восстановиться и начать размножение автоспорами в морской воде через любой промежуток указанного выше времени. Капюшончатые растения Я. сотМ^а морфотип «рга8ю1а» оставались живыми в иссушенном состоянии более трех лет, однако затем они постепенно стали утрачивать способность к восстановлению. На исходе 4-го года иссушения эти растения погибли, хотя растения другого морфотипа этого же вида - Я. сот^Ша морфотип «соп81пс1а», иссушенные в аналогичных условиях, оставались живыми и способными к восстановлению при регидратации. Таким образом, Я. сот^Ша морфотип «сошйса» является более устойчивой, чем Я. сотМ^а морфотип «рга8ю1а». Вероятно, именно этим можно объяснить, почему в природе в их смешанных зарослях соотношение разных морфотипов составляет 98,6 и 1,4%, соответственно.
Об устойчивости цианобактерий к иссушению было известно и до наших исследований, поэтому далее мы продолжили работу только с зелеными водорослями. Как показано на рис. 2, высушенные в силикагеле растения были покрыты кристаллами морской соли и часто имели разломы и трещины, образовавшиеся на их обезвоженной сморщенной поверхности. Солевой налет на пластинах является дополнительным фактором, способствующим их медленной биологической коррозии.
После погружения в морскую среду для культивирования все растения моментально втягивали воду, и их клетки увеличивались в объеме в несколько раз. Однако окрашивание клеток флуоресцентным красителем ФДА показало, что после регидратации на возобновление происходящих в цитоплазме метаболических реакций требовалось несколько дней. Так, через четыре дня после регидратации у >30% клеток регистрировали характерную желто-зеленую флуоресценцию ФДА. С течением времени количество таких клеток возрастало. Через 12 дней после регидратации у >80% клеток в каждом растении регистрировали флуоресценцию ФДА. Стоит отметить, что флуоресценция была не очень интенсивной и в то же время явно различимой под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (рис. 3). Таким образом, в цитоплазме клеток активность эстераз восстанавливалась медленно.
Рис. 3. Окрашивание автоспор, отделившихся от растения Rosenvingiella constricta (морфотип «constricta»),
флуоресцентным диацетатом (ФДА). Время - 30-й день после регидратации, период иссушения - 4 года. Микрофотографии сняты под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом: а - автофлуоресценция хлорофилла в хлоропластах (зеленый фильтр, режим «Mito Red»). Всего отделилось 4 пакета, включающие 18 автоспор; б - те же автоспоры, снятые в режиме «transmitted» c наложенной поверх них флуоресценцией ФДА, снятой под синим фильтром в режиме «FITC». У11 клеток из 18 была различима характерная флуоресценция ФДА, однако наиболее интенсивной она была только у 3 клеток (показано стрелками, рис. б, в), т.е. эти клетки были самыми жизнеспособными; в - те же автоспоры, окрашенные ФДА, сфотографированные под синим фильтром в режиме «FITC»
Fig. 3. Fluorescein diacetate (FDA) staining of Rosenvingiella constricta (morphotype "constricta ") autospores observed under confocal laser scanning microscope. Time - day 30 after rehydration; period of desiccation - 4 years: а - chlorophyll autofluorescence inside chloroplasts visualized with "Mito Red" under the green filter. Four packages of autospores separatedfrom the parent plant, including 18 autospores totally; б - transmitted images of the same autospores with overlapped FDA fluorescence. Characteristic green fluorescence of FDA was visible in 11 out of 18 cells; however, intensive fluorescence was observed only in 3 cells (figs. б, в, arrows), implying that they were the most viable; в - FITC image of same autospores stained with FDA. Most viable cells are shown with arrows
Через 30 дней после регидратации растений покрывающий их толстый кутикулярный слой размягчился до слизистого состояния и, очевидно, слизь частично растворилась в воде (рис. 4, а - в; рис. 5, а - г).
Рис. 4. Регидратация капюшончатогорастения Rosenvingiella constricta (морфотип «prasiola»): а - инициальное растение, высушенное в силикагеле в течение 3 лет, а затем помещенное в стерильную морскую воду; б - увеличенный фрагмент пластины на день регидратации 0+. Зеленые клетки в пластине - потенциально живые, белесые клетки между ними - изначально мертвые, с разрушенным хлоропластом. Хотя клетки в пластине формируют пакеты, при высвобождении они всегда отделяются друг от друга; в - высвобождение автоспор на 30-й день после регидратации; г - все автоспоры были разного размера и формы; д - з - развитие проростков из автоспор. У всех автоспор инициальная клетка была заключена в волнистый чехол, напоминающий приспущенный чулок; и - молодой проросток через 20 дней после прорастания автоспоры. Часто молодые пластинки искривлялись в начале роста, а затем формировали линейную многорядную пластину; к - нитчатый таллом через 2 месяца после прорастания автоспоры
Fig. 4. Rehydration of the hood-like blade of Rosenvingiella constricta (morphotype "prasiola "): a - plant that was desiccated in silica gel for 3 years and then transferred to sterile seawater; 6 - magnified view of the blade on day 0+ after rehydration. Green cells are potentially alive, and whitish cells among them are dead, with disintegrated chloroplast. Although cells formed packages inside the blade, they separatedfrom each other upon release; b - release of autospores on day 30 after rehydration; г - all autospores had different sizes and shapes; d - 3 - development of germlings from the autospores. In all young germlings, the basal elongated rhizoidal cell was covered with a cuticle that had undulate margins; u - young filament at 20 days after autospore germination. Young filaments could be twisted at the beginning of growth and later they formed linear multiseriate blade; k -filament at 2 months
after autospore germination
После этого пластины Я. сотМ^а морфотип «рга8ю1а» начинали распадаться на отдельные одиночные клетки, у Я. сотМ^а морфотип «соп81пс1а» - на пакеты из 2-8 клеток и у Р. delicata -на пакеты из двух клеток, реже одиночные клетки. Этот процесс всегда начинался с периферической части и, по мере ее распадения на отдельные клетки и пакеты клеток, он охватывал практически все растение, кроме самой нижней части. Высыпавшиеся клетки не были жгутиковыми (т. е. зооспорами), а также их безжгутиковыми аналогами (т. е. апланоспорами), поэтому мы называем их автоспорами. От одной материнской пластины могло образоваться от нескольких десятков до нескольких сотен автоспор. В течение первых двух лет хранения сухих образцов выживаемость появившихся после регидратации растений от автоспор проростков во всех чашках Петри составляла более 90%. Затем эти показатели стали медленно понижаться, и к концу 4-го года иссушения растений выживало около 16-40% появившихся из автоспор проростков (рис. 3).
Рис. 5. Регидратация растений Rosenvingiella constricta (морфотип «constricta»): а - пучок растений, подвергшихся регидратации после нахождения в силикагеле в течение 4 лет; б - увеличенный фрагмент нижней части растения с однорядно нитчатым строением; в - увеличенный фрагмент пластины с плотноцилиндрическим строением и характерными перетяжками (день 0+ после регидратации); г - высвобождение пакетов из автоспор на 30-й день после регидратации; д - пакет из 4 автоспор на 2-й день. Одна из клеток (верхушечная) пошла в рост; е - развитие проростков из автоспор на 10-й день
Fig. 5. Rehydration of Rosenvingiella constricta (morphotype "constricta"): а - bundle of filaments that were desiccated in silica gel for 4 years and then rehydrated in sterile seawater;
б - magnified view of lower uniseriate filamentous part of thallus; в - magnified view of multiseriate part of thallus with characteristic constrictions (day 0+ after rehydration); г - liberation of autospores in packages of 2-8 on day 30 after rehydration; д - package with 4 autospores on 2nd day after liberation. The upper cell started to grow; е - young germlings at 10 days after autospores germination
Автоспоры капюшончатых растений R. сот^Ша морфотип «рга8ю1а» высыпались по одной и во всех случаях прорастали только одиночными проростками, тогда как у R. сот^Ша морфотип «сошШсШ» из пакетов клеток появлялись группы проростков. Это наблюдение позволяет понять, почему в природе растения указанных выше морфотипов растут одиночными или собранными в группы талломами. У капюшончатых растений R. сот^Ша морфотип «рга8ю1а» все автоспоры имели разные размеры и форму (рис. 4, г), но при этом прорастали однообразно. Через один день после отделения от материнской пластины автоспора прикреплялась к субстрату (рис. 4, д), а еще через день в ней происходило первое клеточное деление (рис. 4, е). По нашим наблюдениям, в среднем клетки растений этого морфотипа делились один раз в сутки. У всех автоспор сохранялась строго определенная клеточная полярность, поскольку формирование пластины шло в одном направлении, а инициальная клетка вытягивалась в противоположном, формируя маленькую подошву (рис. 4, ж). У всех проростков удлиненная инициальная клетка всегда была одета в волнистый чехол, напоминающий приспущенный чулок, и ее хлоропласт был удлиненным, звездчатой формы (рис. 4, з). Во всех других клетках развивающейся пластины размер хлоропласта был в два раза меньше. Через 60 дней после выхода автоспор из материнских пластин проростки сформировали нитчатые растения 1-1,5 мм в длину (рис. 4, и, к). Затем они остановились в росте, хотя в течение многих месяцев оставались живыми.
У R. сотМ^а морфотип «сошШйа» пакеты автоспор, состоящие из 2-8 клеток, сформировали пучки точно таких же нитчатых растений 1-1,5 мм в длину и затем остановились в росте. Мы не смогли проследить формирование у их нитей характерных узких перетяжек, в то же время они имели незначительные перепады толщины, отдаленно напоминающие перетяжки. В целом их рост был более медленным, чем у проростков, появившихся от капюшончатых растений, вероятно, из-за высокой плотности их поселения. Примечательно, что инициальные проростки, образовавшиеся из автоспор морфотипа «сошШйа» (рис. 5, д, е), не были похожи на таковые у капюшончатых растений морфотипа «prasiola», поскольку у последних вытянувшаяся инициальная клетка всегда была в волнистом чехле. Однако нитчатые талломы, появившиеся от разных по морфологии материнских растений, имели одинаковую форму.
Обсуждение
Размножение и жизненные циклы являются особенно интересными аспектами биологии развития видов Рга8ю1а. Половое размножение было зарегистрировано у двух морских видов этого рода - Р. meridionalis [27-28] и Р. stipitata [29-31], а также у одного пресноводного вида -Р. ]аротса [32]. У Р. meridionalis и Р. stipitata одновременно во всех клетках верхней части пластины происходил соматический мейоз, после чего эти же клетки делились посредством митоза, формируя гаметангии [27, 29]. У других представителей этого рода половое размножение отсутствует и жизненный цикл включает гетероморфное чередование поколений - листоподобной пластины и одноклеточного апланоспорангия [1, 4], или изоморфное чередование поколений, когда пластинчатые растения постоянно размножаются только спорами [1]. Видам Prasiola свойственно также вегетативное размножение, происходящее путем фрагментации талломов [9].
У видов рода Rosenvingiella регистрировали формирование гаметангиев. Так, все растения из атлантической популяции R. polyrhiza были гаплоидными, а образовавшаяся при слиянии гамет зигота являлась диплоидной фазой жизненного цикла этого вида, причем из каждой зиготы прорастало четыре растения - два женских и два мужских [1]. У популяции этого вида с Аляски женские и мужские гаметы формируются на одном растении, причем женские крупнее мужских в два раза [4]. Культивирование этого вида в лабораторных условиях показало, что у него происходит партеногенетическое прорастание гамет во взрослые растения.
При изучении камчатских образцов R. constricta мы никогда не находили жгутиковых спор или гамет. Размножение всегда происходило путем формирования автоспор, которое начиналось от краев пластины и по мере высвобождения периферийных клеток охватывало практически всю пластину. Автоспоры высыпались либо отдельными клетками сотМ^а морфотип «рга8ю1а»), либо пакетами по 2-8 клеток, находящимися в общем слизистом чехле constricta морфотип «сошШСа»). При этом из автоспор обоих морфотипов материнских растений вырастали нитчатые талломы, хотя мы не смогли культивировать их до стадии образования характерных узких перетяжек. Анализ ДНК показал, что капюшончатые растения R. сотМ^а морфотип
«prasiola», появившиеся из их автоспор нитчатые талломы и R. constricta морфотип «constricta» (т. е. с перетяжками), принадлежат к одному биологическому виду (Т. Клочкова, неопубликованные данные).
Еще один изученный нами вид - P. delicata размножался только автоспорами, которые прорастали в растения с типичной для этого вида морфологией.
Для зеленых водорослей существует очень мало информации о цитологических изменениях клеток во время обезвоживания [25, 33-34], если сравнивать с подобной информацией по сосудистым растениям [35]. Для экосистем суши засуха всегда являлась одной из самых важных проблем, поскольку приводила к ущербу в сельском хозяйстве, а в самых критичных ситуациях к потере урожая и голоду.
Обезвоживание организма смертельно опасно, поскольку все внутриклеточные метаболические процессы происходят в водной среде. При потере жидкости в клетках неустойчивых организмов происходит необратимая агрегация основных макромолекул и дезинтеграция клеточных органелл [36]. Когда их клетки высыхают на 20%, в них полностью останавливается метаболизм из-за недостатка жидкости для формирования биологических мембран и монослоя воды вокруг белковых молекул [37-38].
Устойчивыми к иссушению организмами считаются те, клетки которых остаются живыми при потере >90% воды, но таких организмов крайне мало, и они, как правило, имеют малые размеры [36, 39]. Так, среди 265 000 видов изученных сосудистых растений только 330 видов, то есть 0,12%, способны пережить подобную экстремальную дегидратацию [40]. Известно, что некоторые мхи и печеночники могут восстановиться после 20-25 лет иссушения, а покрытосеменные и папоротникообразные - после 5 лет [41-42]. Коловратки и тихоходки могут оставаться живыми в иссушенном состоянии до 9 лет [43]. Помещенная в воду сине-зеленая водоросль Nostoc commune возобновила рост после 55 лет иссушения в гербарной коллекции [44], а зеленая почвенная водоросль Protosiphon botryoides - через 43 года [45]. Мы находили уникальный вид зеленой водоросли Chlorococcum sp. на каменных стенах внутри запечатанного храмового комплекса в Корее в условиях полного отсутствия света и влаги, где он много лет оставался живым в виде толстостенных покоящихся цист. После регидратации он возобновил рост в пресной воде [25].
Что касается видов Prasiola и Rosenvingiella, утверждение, что они способны переносить иссушение, высказывалось и ранее [6, 23-24], однако при этом ни в одной из этих публикаций не сказано, какой максимальный период времени они способны пережить в таком состоянии и какая степень обезвоживания является для них критичной. Если судить по материалам и методам указанных выше и других статей, иссушение празиоловых осуществлялось в течение нескольких часов или дней [24, 46].
Наши исследования показали, что виды Prasiola delicata и Rosenvingiella constricta, включая оба типа его морфологии, следует относить к организмам, устойчивым к экстремальному иссушению, поскольку при потере >90% (практически 100%) внутриклеточной жидкости они остаются живыми в течение 3-4-х лет. Стоит отметить, что до высушивания в силикагеле все растения дополнительно испытали температурный шок, когда их дважды подвергли медленной заморозке при -10...-18°С и последующему оттаиванию при комнатной температуре. В альгологии известны случаи успешной криоконсервации живых водорослей с использованием специальных защитных мер. При крайне быстрой заморозке цитоплазма не кристаллизуется, а обретает желеобразную консистенцию, и органеллы не повреждаются, однако при медленной заморозке происходит образование внутриклеточного льда, приводящее к разрушению органелл и смерти клеток.
Во время обезвоживания в клетках растений также происходит ряд необратимых изменений. Во-первых, недостаток воды вызывает сильное уплотнение «головных» групп фосфолипидов в клеточных мембранах и тилакоидах, что в свою очередь приводит к увеличению ван-дер-ваальсовых сил между углеводородными цепями [47]. Иссушенные при комнатной температуре липиды превращаются в гель, а затем при регидратации они снова принимают жидкое состояние, но становятся при этом проницаемыми, и в результате нарушается структурная целостность мембран [48-49].
Во время иссушения клеточные мембраны и белки становятся более восприимчивыми к воздействию активных форм кислорода. Их атака на липиды приводит к сильному окислению плаз-
молеммы, делая ее более проницаемой [50-51], а воздействие на белки вызывает окисление функциональных групп аминокислот, из-за чего белки могут полностью утратить свою активность [49]. При отсутствии воды белки вынуждены компенсировать потери водородных связей путем соединения с другими молекулами, в результате чего может происходить их денатурация [48, 52-53]. Во время регидратации они часто находятся в развернутом состоянии, из-за чего в дальнейшем могут полностью утратить свою активность [48].
Окрашивание клеток камчатских представителей P. delicata и R. constricta флуоресцентным диацетатом (ФДА) показало, что сразу после регидратации в них отсутствует характерная желто-зеленая флуоресценция. Это указывает на неактивное состояние клеточных эстераз. Эстеразы принадлежат классу гидролаз и участвуют в реакциях расщепления сложноэфирной связи в органических соединениях. По существу ФДА является нефлуоресцентной, неполярной молекулой, которая переносится в клетку пассивно и после расщепления в цитоплазме эстеразами начинает светиться под флуоресцентным микроскопом желто-зеленым цветом [26].
Характерная флуоресценция у наших растений появилась через 4-12 дней после регидратации, что указывает на то, что к этому времени в регидрированных клетках возобновился метаболизм. Дальнейшее развитие растений показало, что от одной материнской пластины может быть получено от нескольких десятков до более сотни новых дочерних растений. Таким образом, даже одно перенесшее экстремальный стресс, но сохранившее жизнеспособность растение обеспечивает сохранение вида и восстановление его численности.
Литература
1. Kornmann P., Sahling P.-H. Prasiolales (Chlorophyta) von Helgoland // Helgoländer Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen. - 1974. - Vol. 26. - P. 99-133.
2. Becker E. W. Physiological studies on Antarctic Prasiola crispa and Nostoc commune at low temperatures // Polar Biology. - 1982. - Vol. 1. - P. 99-104.
3. Ettl H., Gärtner G. Syllabus der Boden-, Luft- und Flechtenalgen. - Gustav Fischer Verlag, Stuttgart/Jena/New York. - 1995. - 722 p.
4. Rindi F., Mclvor L., Guiry M.D. The Prasiolales (Chlorophyta) of Atlantic Europe: an assessment based on morphological, molecular, and ecological data, including the characterization of Rosenvingiella radicans (Kützing) comb. nov. // Journal of Phycology. - 2004. - Vol. 40. - P. 977-997.
5. Rodriguez R.R., Jimenez J.C., Delgado C.M. Microhabitat and morphometric variation in two species of Prasiola (Prasiolales, Chlorophyta) from streams in central Mexico // Aquatic Ecology. -2007. - Vol. 41. - P. 161-168.
6. Клочкова Н.Г., Королева Т.Н., Кусиди А.Э. Атлас водорослей-макрофитов прикамчатских вод. - Петропавловск-Камчатский: Камчатпресс, КамчатНИРО. - 2009. - Т. 1. - 216 с.
7. Naw M.W.D., Hara Y. Morphology and molecular phylogeny of Prasiola sp. (Prasiolales, Chlorophyta) from Myanmar // Phycological Research. - 2002. - Vol. 50. - P. 175-182.
8. Morphology and phylogenetic position of a freshwater Prasiola species (Prasiolales, Chlorophyta) in Korea / Kim M.S., Jun M.-S., Kim C.A., Yoon J., Kim J.H., Cho G.Y. // Algae. -Vol. 30. - P. 197-205.
9. Green seaweeds of Britain and Ireland / Eds.: Brodie J., Maggs C.A., John D.M. British Phycological Society, Dunmurry, Northern Ireland. - 2007. - P. 13-31.
10. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. - 2015. - URL: http://www.algaebase.org (дата обращения 01.10.2015).
11. Kobayasi Y. Prasiola crispa and its allies in the Alaskan Arctic and Antarctica // Bulletin of the National Science Museum [Tokyo, Japan]. - 1967. - Vol. 10. - P. 211-220.
12. The marine and terrestrial Prasiolales (Chlorophyta) of Galway City, Ireland: a morphological and ecological study / Rindi F., Guiry M.D., Barbiero R.P., Cinelli F. // Journal of Phycology. - 1999. -Vol. 35. - P. 469-482.
13. Rindi F., Guiry M.D. Composition and spatial variability of terrestrial algal assemblages occurring at the bases of urban walls in Europe // Phycologia. - 2004. - Vol. 43. - P. 225-235.
14. Hunt J.H., Denny M. W. Desiccation protection and disruption: a trade-off for an intertidal marine algae // Journal of Phycology. - 2008. - Vol. 44. - P. 1164-1170.
15. Holzinger A., Karsten U. Desiccation stress and tolerance in green algae: consequences for ultrastructure, physiological and molecular mechanisms // Frontiers in Plant Science. - 2013. - Vol. 4. -P. 327.
16. Jackson A.E., Seppelt R.D. The accumulation of proline in Prasiola crispa during winter in Antarctica // Physiologia Plantarum. - 1995. - Vol. 94. - P. 25-30.
17. Antarctic communities: species, structure, and survival / Eds.: Battaglia B., Valencia J., Walton D.W.H. Cambridge University Press, Cambridge. - 1997. - P. 226-233.
18. DNA damage and photosynthetic performance in the Antarctic terrestrial alga Prasiola crispa ssp. antarctica (Chlorophyta) under manipulated UV-B radiation / LudD., Buma A.G.J., van den Poll W., Moerdijk T.C. W., Huiskes H.L. // Journal of Phycology. - 2001. - Vol. 37. - P. 459-467.
19. Comparative study on the photosynthetic properties of Prasiola (Chlorophyceae) and Nostoc (Cyanophyceae) from Antarctic and non-antarctic sites / Kosugi M., Katashima Y., Aikawa S., Tanabe Y., Kudoh S., Kashino Y., Koike H., Satoh K. // Journal of Phycology. - 2010. - Vol. 46. - P. 466-476.
20. Photoprotective substances in Antarctic macroalgae and their variation with respect to depth distribution, different tissues and developmental stages / Hoyer K., Karsten U., Sawall T., Wiencke C. // Marine Ecology Progress Series. - 2001. - Vol. 211. - P. 117-129.
21. Mycosporin-like amino acids and phylogenies in green algae: Prasiola and its relatives from the Trebouxiophyceae (Chlorophyta) / Karsten U., Friedl T., Schumann R., Hoyer K., Lembcke S. // Journal of Phycology. - 2005. - Vol. 41. - P. 557-566.
22. Prasiolin, a new UV-sunscreen compound in the terrestrial green macroalga Prasiola calophylla (Carmichael ex Greville) Kützing (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) / Hartmann A., Holzinger A., Ganzera M., Karsten U. // Planta. - 2015. - In press. - DOI 10.1007/s00425-015-2396-z.
23. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Макрофитобентос Авачинской губы и его антропогенная деструкция. - Владивосток: Дальнаука, 2001. - 205 с.
24. Physiology and ultrastructure of desiccation in the green alga Prasiola crispa from Antarctica / Jacob A., Wiencke C., Lehmann H., Kirst G.O. // Botanica Marina. - 1992. - Vol. 35. - P. 297-303.
25. Biology of a terrestrial green alga Chlorococcum sp. (Chlorococcales, Chlorophyta) collected from the Miruksazi stupa in Korea / Klochkova T.A., Kang S.-H., Cho G.Y., Pueschel C.M., West J.A., Kim G.H. // Phycologia. - 2006. - Vol. 45. - P. 115-124.
26. Oparka K.J., Read N.D. The use of fluorescent probes for studies of living plant cells // Plant Cell Biology; A Practical Approach. Oxford University Press Inc., New York. - 1994. - P. 27-50.
27. Cole K., Akintobi S. The life cycle of Prasiola meridionalis Setchell and Gardner // Canadian Journal of Botany. - 1963. - Vol. 41. - P. 661-668.
28. O'Kelly C.J., Garbary D.J., Floyd G.L. Flagellar apparatus of male gametes and other aspects of gamete and zygote ultrastructure in Prasiola and Rosenvingiella (Chlorophyta, Prasiolales) from British Columbia // Canadian Journal of Botany. - 1989. - Vol. 67. - P. 505-514.
29. Friedmann I. Structure, life-history, and sex determination of Prasiola stipitata Suhr. // Annals of Botany, New Series. - 1959. - Vol. 23. - P. 571-594.
30. Friedmann I. Geographic and environmental factors controlling life history and morphology in Prasiola stipitata Suhr. // Österreichische Botanische Zeitschrift. - 1969. - Vol. 116. - P. 203-225.
31. Friedmann I., Manton I. Gametes, fertilization and zygote development in Prasiola stipitata Suhr. I. Light Microscopy // Nova Hedwigia. - 1960. - Vol. 1. - P. 443-462.
32. Fujiyama T. On the life-history of Prasiola japonica Yatabe // Journal of the Faculty of Fisheries and Animal Husbandry, Hiroshima University. - 1955. - Vol. 1. - P. 15-37.
33. Klochkova T.A., Kim G.H. Ornamented resting spores of a green alga, Chlorella sp., collected from the stone Standing Buddha statue at Jungwon Miruksazi in Korea // Algae. - 2005. - Vol. 20. -P. 295-298.
34. Algae: nutrition, pollution control and energy sources / Ed.: Hagen K.N. Nova Science, Hauppauge. - 2009. - P. 41-56.
35. The predominant polyphenol in the leaves of the resurrection plant Myrothamnus flabellifolius, 3,4,5 tri-O-galloylquinic acid, protects membranes against desiccation and free radical-induced oxidation / Moore J.P., Westall K.L., Ravenscroft N., Farrant J.M., Lindsey G.G., Brandt W.F. // Biochemical Journal. - 2005. - Vol. 385. - P. 301-308.
36. Ecological aspects of seed desiccation sensitivity / Tweddle J.C., Dickie J.B., Baskin C.C., Baskin J.M.// Journal of Ecology. - 2003. - Vol. 91. - P. 294-304.
37. Anhydrobiosis / Eds.: Crowe J.H., Clegg J.S. Stroudsberg, PA: Dowden, Hutchinson and Ross. -1973.- P. 141-146.
38. Billi D., Potts M. Life and death of dried prokaryotes // Research in Microbiology. - 2002. -Vol. 153. - P. 7-12.
39. Alpert P. Constraints of tolerance: why are desiccation tolerant organisms so small or rare? // Journal of Experimental Biology. - 2006. - Vol. 209. - P. 1575-1584.
40. Porembski S., Barthlott W. Granitic and gneissic outcrops (inselbergs) as centers of diversity for desiccation tolerant vascular plants // Plant Ecology. - 2000. - Vol. 151. - P. 19-28.
41. Alpert P. The limits and frontiers of desiccation tolerant life // Integrative and Comparative Biology. - 2005. - Vol. 45. - P. 685-695.
42. Desiccation and survival in plants: Drying without dying / Eds.: Black M., Prichard H.W. CAB International, Wallingford, UK. - 2002. - P. 3-43.
43. Guidetti R., Jonsson K.I. Long-term anhydrobiotic survival in semi-terrestrial micrometazoans // Journal of Zoology. - 2002. - Vol. 257. - P. 181-187.
44. Genomic DNA of Nostoc commune (Cyanobacteria) becomes covalently modified during long-term (decades) desiccation but is protected from oxidative damage and degradation / Shirkey B., McMaster N.J., Smith S.C., WrightD.J., Rodriguez H., Jaruga P., Birincioglu M., Helm R.F., Potts M.// Nucleic Acids Research. - 2003. - Vol. 31. - P. 2995-3005.
45. Lewis L.A., Trainor F.R. Survival of Protosiphon botryoides (Chlorophyceae, Chlorophyta) from a Connecticut soil dried for 43 years // Phycologia. - 2012. - Vol. 51. - P. 662-665.
46. Metabolic changes of the Antarctic green alga Prasiola crispa subjected to water stress investigated by in vivo 31PNMR / Bock C., Jacob A., Kirst G.0., Leibfritz D., Mayer A. // Journal of Experimental Botany. - 1996. - Vol. 47. - P. 241-249.
47. Crowe J.H., Hoekstra F.A., Crowe L.M. Anhydrobiosis // Annual Review of Physiology. -1992. - Vol. 54. - P. 579-599.
48. Hoekstra F.A., Golovina E.A., Buitink J. Mechanisms of plant desiccation tolerance // Trends in Plant Sciences. - 2001. - Vol. 6. - P. 431-438.
49. FrangaM.B., Panek A.D., Eleutherio E.C.A. Oxidative stress and its effects during dehydration // Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. - 2007. - Vol. 146. - P. 621-631.
50. Senaratna T., McKersie B.D., Borochov A. Desiccation and free radical mediated changes in plant membranes // Journal of Experimental Botany. - 1987. - Vol. 38. - P. 2005-2014.
51. Crowe J.H., McKersie B.D., Crowe L.M. Effects of free fatty acids and transition temperature on the stability of dry liposomes // Biochemica et Biophysica Acta. - 1989. - Vol. 979. - P. 7-10.
52. Wolkers W.F., Tablin F., Crowe J.H. From anhydrobiosis to freeze-drying of eukaryotic cells // Comparative Biochemistry and Physiology Part A. - 2002. - Vol. 131. - P. 535-543.
53. Rebecchi L., Altiero T., Guidetti R. Anhydrobiosis: the extreme limit of desiccation tolerance // Invertebrate Survival Journal. - 2007. - Vol. 4. - P. 65-81.
Информация об авторах Information about authors
Клочкова Татьяна Андреевна - Камчатский государственный технический университет; 683003, Россия, Петропавловск-Камчатский; кандидат биологических наук; старший научный сотрудник; tatyana_algae@mail.ru
Klochkova Tatyana Andreevna - Kamchatka State Technical University; Petropavlovsk-Kamchatskу, Russia, 683003; Candidate of biological sciences; Senior Researcher; tatyana_algae@mail.ru
Клочкова Нина Григорьевна - Камчатский государственный технический университет; 683003, Россия, Петропавловск-Камчатский; доктор биологических наук; проректор по научной работе; ninakl@mail.ru
Klochkova Nina Grigorevna - Kamchatka State Technical University; Petropavlovsk-Kamchatskу, Russia, 683003; Doctor of biological sciences; Vice-Rector on scientific work; ninakl@mail.ru
Очеретяна Светлана Олеговна - Камчатский государственный технический университет; 683003, Россия, Петропавловск-Камчатский; научный сотрудник отдела науки и инноваций; sveta_kam_08@hotbox.ru
Ocheretyana Svetlana Olegovna - Kamchatka State Technical University; Petropavlovsk-Kamchatskу, Russia, 683003; Researcher of science and innovation department; sveta_kam_08@hotbox.ru
Ким Гван Хун - Национальный университет Конджу; 32588, Корея, Конджу; доктор философии биологии; профессор; декан колледжа естественных наук; ghkim@kongju.ac.kr
Kim Gwang Hoon - Kongju National University; Kongju, Republic of Korea, 32588; Doctor of Philosophy in Biology (Ph.D.); Professor; Dean of College of Natural Sciences; ghkim@kongju.ac.kr
