CC BY
196
УДК 581.1
М.В. Ефимова1, А.В. Мануйлова1, М.К. Малофий1, А.В. Карташов2, Вл.В. Кузнецов1,2
1Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск) 2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)
влияние брассиностероидов
НА ФОРМИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫх РЕАКЦИЙ
проростков рапса в условиях засоления
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ (12-04-31500-мол_а, 12-04-90019-Бел_а).
Изучено протекторное действие эпибрассинолида при хлоридном засолении. Ростовые показатели проростков (длина гипокотиля и корня), содержание фо-тосинтетических пигментов и пролина в растениях рапса оценивали на 7-е сут от начала прорастания в условиях засоления. Установлено, что хлоридное засоление подавляло рост осевых органов рапса, снижало накопление фотосинте-тических пигментов и в 70 раз стимулировало аккумуляцию пролина. Экзогенное применение эпибрассинолида (10-10 и 10-8М) частично снимало негативный эффект засоления и при этом вызывало падение содержания пролина. Это позволило предположить, что стресс-защитный эффект гормона обусловлен не протекторным действием пролина, а его способностью индуцировать альтернативные защитные системы.
Ключевые слова: Brassica napus L.; хлоридное засоление; проростки; ростовые показатели; фотосинтетические пигменты; пролин; брассиностероиды; эпибрассинолид.
Введение
Суша Земли составляет 13,2 109 га, среди которых только 7109 га приходится на пахотные почвы и 1,5 109 га - на целинные [1]. По состоянию на 2005 г. почти третья часть пахотных и целинных земель была засолена [2]. Причины засоления почв различны: начальное засоление материнской породы, наступление морской воды на прибрежные районы, использование соленой воды в аграрном производстве, ограниченный дренаж, низкий уровень осадков и высокая интенсивность испарения [1]. Последствия почвенного засоления проявляются в снижении продуктивности агро- и биоценозов, в падении биоразнообразия и экономических потерях, особенно серьезных для тех стран, экономика которых напрямую зависит от объема сельскохозяйственного производства [3]. Губительное воздействие засоления на растения обусловлено падением водного потенциала почвенного
раствора, что снижает доступность воды для корневой системы, увеличением внутриклеточной концентрации ионов, оказывающих токсический эффект на метаболизм растений, и изменением структуры почвы, что способствует снижению ее водопроницаемости и аэрации [1]. Одним из потенциальных способов защиты растений от хлоридного засоления может быть их обработка фитогормонами, среди которых наибольший интерес представляют брассиностероиды, обладающие рядом преимуществ перед другими гормонами. В научной литературе широко обсуждается способность брассиностероидов регулировать рост и развитие растений в процессе онтогенеза. Известно, что они изменяют активность ферментов, мембранный потенциал, активируют синтез белков и нуклеиновых кислот, регулируют метаболизм аминокислот и жирных кислот, влияют на гормональный статус растительного организма, тем самым стимулируя растяжение и деление клеток [4-9] и, как следствие, усиление роста растения и повышение его продуктивности [10-12]. Среди преимуществ брассино-стероидов можно отметить их экологическую безопасность и способность вызывать эффекты в чрезвычайно низких концентрациях, по сравнению с другими гормонами. Механизмы стресс-протекторного действия стероидных фитогормонов остаются в настоящее время практически не исследованными [13].
В данной работе проведен анализ возможной защитной роли брасси-ностероида эпибрассинолида при хлоридном засолении. Эффект гормона оценивали по его способности снижать негативное влияние высокой концентрации NaCl на прорастание семян, накопление фотосинтетических пигментов, содержание пролина и развитие проростков рапса.
Материалы и методики исследования
Исследования проводили на проростках рапса Brassica napus L. сорта Ве-стар. Изучали негативный эффект, вызываемый высокой концентрацией NaCl (175 мМ) на морфогенез, и некоторые физиологические показатели проростков на белом свету (плотность потока падающих квантов - 170 мкмоль/м2с; фотопериод 16/8 чч, температура воздуха 22±2°С). В качестве контроля использовали 7-суточные проростки, выращенные на дистиллированной воде. Ростовые показатели проростков (длина гипокотиля и корня), содержание фотосинтетических пигментов и пролина анализировали на 7-е сут от начала прорастания семян в условиях засоления.
Для изучения защитного действия брассиностероидов при хлоридном засолении семена рапса проращивали на растворе эпибрассинолида (10-10 и 10-8 М). Эпибрассинолид (ЭБЛ) был любезно предоставлен чл.-кор. НАН Беларуси В.А. Хрипачем (лаборатория химии стероидов Института биоор-ганической химии НАН Беларуси, Минск), за что авторы выражают ему искреннюю благодарность.
Экстракцию и определение свободного пролина проводили по модифицированному методу Bates et al. [14]. Растительный материал (100-200 мг сырой массы) растирали в жидком азоте, переносили в пробирку Эппендор-фа и доводили дистиллированной водой до метки 2 мл. Пробирку помещали в термостат на 30 мин при температуре 99°С. Часть вытяжки (250 мкл) переносили в мерные пробирки, доливали 750 мкл дистиллированной воды, добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл нингидринового реактива и инкубировали в течение 1 ч на кипящей водяной бане. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Genesys 20, ThermoElectron, Германия) при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывали по формуле С = Е-k- V/m 1000, где C - концентрация пролина, мкмоль/г сырой массы; E - оптическая плотность; k - коэффициент; V - объем экстракта, мл; m - масса навески, г.
Для оценки уровня фотосинтетических пигментов семядоли проростков растирали в 96%-ном этаноле и полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 8 тыс. об./мин (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия). Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре (Genesys 10, ThermoElectron, Германия). Концентрацию пигментов в спиртовой вытяжке рассчитывали согласно [15].
Длину гипокотилей и корней проростков рапса измеряли под лупой БМ-51-2 (КОМЗ, Казань). Для каждого варианта брали пробы в 2-3 биологических повторностях, каждая из которых содержала по 15 проростков. Эксперименты проводили не менее трех раз. Результаты экспериментов представлены на рисунках в виде средней арифметической со стандартной ошибкой. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Значения t-критерия находили для 95%-го уровня значимости (р < 0,05).
Результаты исследования и обсуждение
Засоление тормозит рост растений и снижает их продуктивность. Отрицательное воздействие засоления обусловлено низким водным потенциалом почвенного раствора, токсичностью ионов и дисбалансом питательных элементов [16]. Наиболее губительный эффект NaCl оказывает на ранних этапах развития растений.
Из рис. 1 видно, что число проросших семян в присутствии 175 мМ NaCl составило 30% от контрольного варианта. Внешний вид проростков также претерпевал значительные изменения. Засоление значительно подавляло рост зародышевого стебля (гипокотиля) и корня. Наибольшая чувствительность к действию NaCl на белом свету, в отличие от темноты [17, 18], была отмечена для корня, рост которого был подавлен в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 2).
, < -• * 'лЛ»1. п * Контроль * * щ * ЭБЛ-10 * * * * ж* ЭБ“-3
♦ . * * * + « МаС! *Ч«Л * 4 г МаС1 + ЭБЛ-10 Р \ У" * ** V ч ша+эвл-з
Рис. 1. 7-суточные проростки рапса. Здесь и далее ЭБЛ-10 и ЭБЛ-8 - эпибрассинолид в концентрации 10-10 и 10-8 М соответственно
120
100
2 80 г
I 60
8
Ч
^ 40 20 0
■
Контроль
■
№С1 ЭБЛ-10 ЭБЛ-8 NaCl + ЭБЛ-10 №С1 + ЭБЛ-8
Игипокотиль □ корень
*
*
*
*
Рис. 2. Влияние экзогенного эпибрассинолида на ростовые показатели проростков рапса при засолении. Звездочкой отмечены статистически значимые отличия от контроля (р < 0,05)
Экзогенный ЭБЛ (10-10 или 10-8 М) значительно снижал негативный эффект засоления на прорастание семян и рост гипокотиля. При этом его длина была в два раза больше длины гипокотиля проростков, выращенных на растворе с КаС1, но в 2 раза меньше длины гипокотилей контрольных проростков (без стрессового воздействия) (рис. 2). Протекторный эффект
гормона для зародышевого корня носил концентрационную зависимость. Наибольшее защитное действие при засолении проявлял ЭБЛ в концентрации 10-8 М. В этом случае длина корня была в 4 раза больше по сравнению с длиной корня проростков, подвергнутых действию только 175 мМ КаС1.
Содержание фотосинтетических пигментов при хлоридном засолении снижалось примерно в два раза (рис. 3), а соотношение хлорофиллов (а+Ь) к каротиноидам - в 1,5 раза, несмотря на то что соотношение хлорофиллов к каротиноидам при обработке семян ЭБЛ не изменялось. Причина такой стабильности зависела от действующей концентрации гормона. В то время как низкая концентрация ЭБЛ (10-10 М) не приводила к значительному увеличению уровней хлорофиллов и каротиноидов, высокая его концентрация способствовала повышению содержания хлорофилла а в 2 раза и других пигментов (хлорофилла Ь и каротиноидов) - в 1,5 раза. Отсутствие видимых изменений в уровнях фотосинтетических пигментов при обработке растений ЭБЛ в низкой концентрации не может свидетельствовать о том, что фотосинтетическая активность растений осталась неизменной. На данный момент показано, что в зависимости от действующей концентрации брас-синостероиды изменяют интенсивность транскрипции пластидного генома AraЬidopsis, ячменя и рапса [7, 8, 19]. При засолении выраженный протекторный эффект был показан для высокой концентрации ЭБЛ (10-8 М). Наблюдаемое частичное восстановление уровней фотосинтетических пигментов до контрольного происходило за счет повышения содержания хлорофилла а и каротиноидов (рис. 4).
Известно, что засоление вызывает водный дефицит у растений. Поддержание оптимального водного статуса и интактной структуры макромолекул при стрессе является одним из необходимых условий выживания растений. На клеточном уровне метаболизм растений изменяется таким образом, чтобы предотвратить негативные последствия повреждающего действия стрес-сорных факторов. Достигается это путем индукции синтеза макромолекул с новыми свойствами или путем оптимизации внутриклеточной среды функционирования ферментных систем за счет накопления органических совместимых осмолитов с протекторными и/или осморегуляторными свойствами [20]. В основе формирования этих механизмов адаптации лежит дифференциальная экспрессия генов, зависящая от интенсивности и продолжительности действия стрессоров, а также от онтогенетического состояния растений [21]. При адаптации растений к водному дефициту ключевая роль принадлежит совместимым низкомолекулярным органическим осмолитам - аминокислотам, сахарам, сахаро-спиртам и бетаинам [22-25]. Аминокислота пролин является универсальным совместимым осмолитом высших растений. Свободный пролин при стрессе обладает полифункциональным биологическим эффектом, который проявляется в осморегуляторной, анти-оксидантной и энергетической функциях; помимо этого, пролин выступает в качестве химического шаперона [21].
Рис. 3. Влияние экзогенного эпибрассинолида на уровень фотосинтетических пигментов при засолении
Отношение хлорофиллов к каротиноидам
Содержа ние ка ротиноидов, мг/г сырой массы
С одержание хлорофиллов, мг/г сырой массы
Влияние брассиностероидов на формирование защитных реакций
На рис. 4 показано, что на хлоридное засоление проростки рапса отвечали 70-кратным увеличением содержания пролина. Экзогенный эпибрасси-нолид в 7-10 раз снижал КаС1-индуцированную аккумуляцию пролина; при этом наибольший эффект достигался при высокой концентрации гормона (рис. 4).
Рис. 4. Влияние экзогенного эпибрассинолида на содержание пролина при засолении
При формировании защитных механизмов на фоне хлоридного засоления важным является не только быстрое обеспечение растения высокими концентрациями совместимых осмолитов, но и сохранение энергетических ресурсов за счет блокирования отдельных метаболических путей и формирования альтернативных защитных систем, направленных на выживание организма в условиях стресса. В нашем случае ЭБЛ повышал солеустойчивость проростков рапса и одновременно снижал уровень пролина при засолении. Отсюда следует, что защитный эффект гормона не мог быть опосредован протекторным эффектом пролина. Весьма вероятно, что при засолении ЭБЛ индуцировал синтез антиок-сидантных ферментов, которые в данном случае оказались эффективнее пролина как антиоксиданта, что и проявилось в снижении интенсивности его аккумуляции. Более того, в настоящее время установлено, что характер отношений между активностью антиоксидантных ферментов и уровнем низкомолекулярных антиокисдантов (например, пролина) при стрессе является реципрокным [25].
Другая возможная причина защитного эффекта ЭБЛ в условиях засоления может заключаться в гормон-зависимом изменении кальциевого го-
меостаза. Известно, что в основе устойчивости растений к хлоридному засолению лежит не только осмоустойчивость, но и способность растения исключать Na+ или проявлять резистентность тканей к Na+ [26]. Центральным процессом в этих механизмах является транспорт воды и ионов Na+, K+ и Cl-. Транспорт ионов натрия зависит от концентрации кальция внутри и вне клетки [27]. С другой стороны, натрий снижает поступление и усиливает выход кальция через мембраны, что приводит к истощению запасов этого элемента в клетке [28].
Кроме того, есть данные, согласно которым снижение внутриклеточной концентрации кальция при хлоридном засолении увеличивает уровень пролина за счет снижения активности пролин оксидазы и повышения у-глутамилкиназной активности в семядолях и зародышевой оси проростков арахиса [29]. Возможно, снижение токсического эффекта хлоридного засоления на растения брассиностероидами может быть связано с привлечением ионов кальция в цитоплазму клеток не только из внутриклеточных пулов, как это делают ауксины и гиббереллины, но и из апопласта [30]. Тем более экспериментально установлено, что введение ионов кальция в питательную среду или обработка растворами солей кальция засоленных территорий сопровождаются повышением солеу-стойчивости растений.
Заключение
Исследование влияния хлоридного засоления на развитие проростков рапса показало, что наряду с подавлением роста осевых органов солевой стресс снижает уровень фотосинетических пигментов и повышает содержание пролина. Выявлена высокая солезащитная активность эпибрассинолида на прорастание семян, рост проростков, накопление фотосинетических пигментов. Обсуждаются возможные механизмы стресс-протекторного действия эпибрассинолида при засолении.
Литература
1. Shahid S.A., Rahman K. Soil salinity development, classification, assessment, and man-
agement in irrigated agriculture // Handbook of plant and crop stress. 3rd edition / ed. by
M. Pessarakli. CRC Press Taylor & Francis Group, 2011. P. 23-38. 1194 p.
2. FAO. Global network on integrated soil management for sustainable use of salt-affected soils.
Rome, Italy : FAO Land and Plant Nutrition Management Service. 2005. URL: www.fao.
org/ag/agl/agll/spush.
3. Kuznetsov Vl.V., Shevyakova N.I. Polyamines and Plant Adaptation to Saline Environments
// Desert Plants. 2010. Heidelberg ; Dordrecht ; London ; New York : Springer-Verlag.
P. 261-298.
4. Chory J., Nagpal P., Peto C.A. Phenotypic and genetic analysis of det2, a new mutant that
affects light-regulated seedling development in Arabidopsis // Plant Cell. 1991. Vol. 3.
P. 45-459.
5. КарначукР.А., Головацкая И.Ф., ЕфимоваМ.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассиноли-
да на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 4. С. 591-595.
6. Ефимова М.В. Физиологическая роль брассиностероидов в развитии проростков Arabidopsis thaliana L. (Heynh) на селективном свету // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2010. № 4(12). С. 105-116.
7. Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К. и др. Особенности экспрессии пластидного
генома и развития растений Arabidopsis thaliana с нарушенным синтезом брассиностероидов // Физиология растений. 2012. Т. 59, № 1. С. 32-39.
8. Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К. и др. Брассиностероиды регулируют транс-
крипцию пластидных генов у растений // Доклады РАН. 2012. Т. 445, № 6. C. 693-697.
9. Kudryakova N.V., Efimova M.V., Danilova M.N. et al. Exogenous brassinosteroids activate
the expression of the genes of cytokinin signaling pathway in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Growth Regulation. 2013. DOI 10.1007/s10725-012-9778-z.
10. Хрипач В.А., Жабинский В.А., Лахвич Ф.А. Перспективы практического применения брассиностероидов - нового класса фитогормонов // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 1. С. 3-11.
11. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., de Groot A.E. Brassinosteroids - a new class of plant hormones. San Diego : Academic Press, 1999. 456 p.
12. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. 2004. M.P. Schneider. Ed. Netherlands : Kluwer Academic Publishers. Vol. 129. P. 153-167.
13. Gomes M.M.A. Physiological effects related to brassinosteroid application in plants / Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone. 2011. S. Hayat, A. Ahmad. Eds. Springer Science +Business Media B.V P. 193-242.
14. Bates, L.S., Waldran, R.P., Teare, I.D. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant Soil. 1973. Vol. 39. P. 205-208.
15. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in Enzymology. 1987. № 148. P. 350-382.
16. Munns R., Tester M. Mechanisms of salinity tolerance / Annu. Rev. Plant Biol. 2008. Vol. 59. P. 651-681.
17. Хасан Д., Ковтун И.С., Ефимова М.В. Влияние хлоридного засоления на прорастание семян и рост проростков Brassica napus L. // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2011. № 4 (16). С. 108-113.
18. Ефимова М.В., Хасан Ж., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Влияние брассиностероидов на прорастание семян и рост рапса на начальных этапах онтогенеза при хлоридном засолении // Вестник РУДН. Сер. Агрономия и животноводство. 2012. № 3. С. 12-20.
19. Efimova M.V., Hasan J., Kholodova V.P. et al. Effect of epibrassinolide on plastid genome transcription of rape plants under long-term salinity // Abstract of XVIII Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology. Germany, Freiburg, 29 July-3 August. 2012. P. 318-319.
20. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. М. : Мир, 1977. 384 с.
21. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 2. С. 321-336.
22. Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Карташов А.В. и др. Изучение индуцибельных и конститутивных механизмов устойчивости к солевому стрессу у гравилата городского // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 5. С. 692-698.
23. Стеценко Л.А., Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю., Кузнецов Вл.В. Пролин защищает растения Atropa belladonna от токсического действия солей никеля // Физиология растений. 2011. Т. 58, № 2. С. 275-282.
24. Kuznetsov V.V., Shevyakova N.I. Stress responses of tobacco cells to high temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides // Physiologia Planta-rum. 2006. Vol. 100 (2). P. 320-326.
25. Кузнецов Вл.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. Полиамины и стресс: биологическая роль, метаболизм и регуляция // Физиология растений. 2006. Т. 53, № 5. С. 658-683.
26. PlettD.C., M0ller I.S. Na+ transport in glycophytic plants: what we know and would like to know // Plant, Cell and Environment. 2010. Vol. 33. P. 612-626.
27. Demidchik V., Maathuis F.J.M. Physiological roles of nonselective cation channels in plants: from salt stress to signaling and development // New Phytologist. 2007. Vol. 175. Р. 387-404.
28. Rengel Z. The role of calcium in salt toxicity // Plant Cell Environ. 1992. Vol. 15. P. 625632.
29. HeuerB. Role of proline in plant response to drought and salinity// Handbook of plant and crop stress. 3rd edition. CRC Press Taylor & Francis Group, 2011. P. 223-239.
30. Дубовская Л.В. Метаболизм циклического гуанозин-3',5'-монофосфата в растительной клетке. Связь с процессами внутриклеточной сигнализации : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Минск, 2004. 21 с.
Поступила в редакцию 23.11.2012 г.
Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 1 (21). P 118-128
Marina V. Efimova1, Arina V. Manuylova1, Marina К. Malofiy1,
Аlexandr V. Kartashov2, Vladimir V. Kuznetsov1,2
1Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia
2 Timirjazev Institute of Plant Physiology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
INFLUENCE OF BRASSINOSTEROIDS ON FORMING PROTECTIVE REACTIONS IN RAPE SEEDLINGS UNDER SALINITY
At present time about one third of all land is affected by salinity. Plants in such conditions have serious physiological disorders. Researchers are looking for ways to prevent the negative effects of salinity on plants. Basic value for understanding the strategy of the survival of plants in extreme conditions has solutions to this problem. Using a hormone showed a decrease in the negative influence of salinity. In our research there was used a plant steroid hormone, distinguished by its physiological activity - epibrassinolide.
In the experiment there was studied a negative effect produced by a high concentration of NaCl (175 mM) on the germination of seeds, the accumulation ofphotosynthetic pigments, the content of proline and the development of rape seedlings under white light. The protective effect of brassinosteroids (10-10 and 10-8 M) was studied. Growth rates of seedlings (the length of the hypocotyl and root), the content ofphotosynthetic pigments and proline were analyzed for seven days after the beginning of germination under saline conditions.
Salinization restricts the growth of plants and reduces their productivity. The most sensitive to the action of chloride salinity under white light was the growth of the root, which was suppressed by 5 times compared with the control. The content of photosynthetic pigments in chloride salinity is reduced by about half Chloride salinity on rape seedlings responded by a 70-fold increase in proline content.
The protective effect of epibrassinolide which, regardless of the analyzed concentration, reduced the negative action of salinization on germination of seeds and growth of the hypocotyl was established. For embryonic roots in saline conditions there appeared the greatest protective effect of EBL in concentration 10-8 M. When using a high concentration of EBL, a partial restoration of level photosynthetic pigments to the control was shown. Accumulation of proline was decreased by 10 times when using a high concentration of the hormone. This suggests that stress-protective effect of the hormone is due not to a protective effect of proline but its ability to induce alternative protection systems.
Key words: Brassica napus L.; chloride salinization; seedlings; growth parameters; photosynthetic pigments; proline; brassinosteroids; epibrassinolide.
Received November 23, 2012
