Влияние алкилоксибензолов на ферментативную активность некоторых гидролаз при различных условиях Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.15.08+606.61

*

А. Ю. Евдокименко, Э.Э. Досадина, Г.И. Эль-Регистан, А.А.Белов

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, *E-mail: ABelov2004@ yandex.ru

ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ГИДРОЛАЗ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ

Аннотация

Исследовано влияние алкилоксибензолов (АОБ) на ферментативные активности некоторых гидролаз (протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, бромелаин, лизоцим, панкреатин и трипсин) по природным и синтетическим субстратам. Показано, что при низких концентрациях АОБ происходит активация исследованных ферментов. рН среды (8,0 или 6,2) не оказывает влияния на характер взаимодействия АОБ с исследованными ферментными препаратами.

Ключевые слова: алкилоксибензолы, резорцин, гидролазы, полиферментные комплексы, инактивация

Ферменты - биологические катализаторы, широко используются в различных областях хозяйственной деятельности человека. Одной из отрицательных сторон использования ферментов является свойственная им нестабильность, обусловленная необратимым нарушением их нативной структуры физическими, химическими и биологическими воздействиями. Изучение закономерностей стабилизации структуры белков, обеспечивающей сохранение их функциональных характеристик, имеет фундаментальную и практическую значимость. Добавление

стабилизирующих веществ в растворы ферментных белков является наиболее простым и эффективным способом сохранения их активности в денатурирующих условиях, однако, во многих случаях, приводит к снижению их каталитической функции [1]. Образуя комплексы с ферментами (и другими белками), алкилированные фенолы (АОБ) изменяют конформацию биомакромолекул, что приводит к изменению стабильности последних (функции химических шаперонов) и изменению функциональной активности. Вектор изменения активности зависит от степени гидрофобности различных гомологов алкилированных фенолов и их концентраций [2].

Нами было изучено влияние АОБ на изменение ферментатативной активности некоторых гидролаз: протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК); бромелаин (Брм); лизоцим куриных яиц(Лз); трипсин (Тр) из поджелудочной крупного рогатого скота; На рис. 1,2 приведены данные о влияние на ферментативную активность (в качестве субстратов использовали либо раствор в 1/15М фосфатном буферном растворе казеин или BАpNa.

Рис. 1. Влияние количества АОБ в ФБ 8,0 на протеолитическую активность ПК и Брм (0,1 мг в пробе)

Рис. 2. Влияние количества АОБ в ФБ 8,0 и ФБ 6,2 на протеолитическую активность ПК (0,1 мг в пробе)

Резорцин, как и другие фенолы (АОБ), легко окисляется и сам является восстановителем. Восстановительная способность резорцина особенно проявляется в щелочной среде

Таблица 1. Кинетика инактивации ПК-Хт-АОБ при высушивании и хранении (при температуре 25°С) (субстрат казеин)

Образец Время высушивания (т, час)

0 4 24 17 дней 2 мес

ПК в №С1 (1мг/мл) 1 0,94 1,05 0,94 1,10

ПК в Хт(0,5%) (1мг/мл) 1 0,61 0,69 0,60 0,74

ПК в №С1 (1мг/мл)+ АОБ(2,5мг/1мг ПК) 1 0,78 0,05 0,05 0,03

ПК в Хт(0,5%) (1мг/мл)+ АОБ(2,5мг/1мг ПК) 1 0,89 0,92 0,77 0,96

(в таблице указаны значения А/Ао)

В процессе высушивания локальная концентрация АОБ по-видимому увеличивается с течением времени, что ведет к постепенной инактивации препаратов, связанной с их взаимодействием.

Таблица 2.Термоинактивация растворов ПК в присутствии АОБ С7 и Хт (субстрат казеин) при различных температурах (24 часа)

образец Ао А/Ао

25°С 37°С

ПК в №С1 (1мг/мл) 1 0,78 0,36

ПК в Хт(0,5%) (1мг/мл) 1 0,28 0,32

ПК в №С1 (1мг/мл)+ АОБ(2,5мг/1мг ПК) 1 0,62 0,07

ПК в Хт(0,5%) (1мг/мл)+ АОБ(2,5мг/1мг ПК) 1 0,35 0,24

Как видно из представленных данных, АОБ (в исследованном диапазоне концентраций) не оказывает стабилизирующего действия на фермент при термоинактивации при изученных условиях.

Различие в значениях протеолитической активности ПК, определенной по разным субстратам, может объясняться особенностями механизма связывания активного центра фермента и молекулами субстрата. Полученные данные показывают, что при взаимодействии с казеином с увеличением концентрации АОБ наблюдаются стерические затруднения для фермента, что влияет на его активность, в то время как при взаимодействии с синтетическим субстратом это проявляется в меньшей степени.

Данные работы [3] свидетельствуют об отсутствии «глубоких» нарушений структуры белков в области активного центра трипсина при контакте с АОБ. Несколько более существенные изменения претерпевает флуоресценция

триптофанов, доступных растворителю в а-химотрипсине. Таким образом, авторы считают, что наиболее вероятный механизм действия алкилоксибензолов на активность сериновых протеаз заключается в образовании устойчивых комплексов АОБ с ферментами, вследствие чего снижается каталитическая активность обоих ферментов. Однако, вследствие различий в локализации различных гомологов ряда АОБ на поверхности белка, изменения активности индивидуальны для каждого исследуемого соединения. Необходимо отметить, что ингибирование ферментативной реакции при добавлении АОБ не приводит к нарушению белковой структуры под действием

алкилоксибензолов, а определяется только «блокировкой» доступа субстрата к активному центру фермента со стороны молекул АОБ. В результате взаимодействия алкилоксибензолов (АОБ) с сериновыми протеазами не происходит нарушения белковой структуры. Ингибирование ферментативной реакции определяется

«блокировкой» молекулами АОБ доступа субстрата к активному центру фермента. По мнению авторов [3] взаимодействие обратимо, и при снятии АОБ ферментативная активность должна вернуться на прежний уровень.

Рис.3. Влияние количества АОБ на протеолитическую активность ПК (0,1 мг в пробе)

Евдокименко Анастасия Юрьевна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва

Досадина Элина Эльдаровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва

Эль-Регистан Галина Ивановна, д.б.н., профессор Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Россия, Москва

Литература

1. Петровский А.С. Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций // Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. М.: РХТУ, 2012, 160 с.

2. Дыкман Р. Л. Физико-химические закономерности окислительно-восстановительных процессов с участием алкилрезорцинов и железа(Ш) : Дисс. ... канд. хим. наук. Саратов., 2014.- 129 с.

3. Валиуллина Ю. А., Ермакова Е.А., Захарченко Н.Л. и Зуев Ю.Ф. Молекулярные механизмы регуляции алкилоксибензолами активности сериновых протеаз //Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №7.,с.80-86.

Evdokimenko Anastasiya Yurievna, Dosadina Elina Eldarovna, El-Registan Galina Ivanovna, Belov Alexey Alexeevich*

D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: abelov2004@ yandex.ru

EFFECT OF ALKYLOXYBENZENE ON THE ENZYMATIC ACTIVITY OF SOME HYDROLASES UNDER DIFFERENT CONDITIONS

Abstract

In this research we studied the effect of alkyloxybenzene (AOB) on enzymatic activity of different hydrolases (proteolytic complex from hepatopacreas of crab, bromelain, lysozyme, pancreatin and trypsin) with the natural and synthetic substrates. It was shown at low concentrations of AOB studied enzymes can be activated and pH of an environment (6,2 or 8,0) does not affect the character of interaction between AOB and studied enzymes.

Key words: alkyloxybenzene; resorcinol; hydrolases; multienzymatic complexes