CC BY
189
УДК 613. 84 : 616. 151. 5
ВЛИЯЕТ ЛИ КУРЕНИЕ НА ОБРАЗОВАНИЕ МИКРОВЕЗИКУЛ В КРОВИ?
И.Г. Мустафин, Л.Д. Зубаирова, И.А. Кузьминых, Г.Ю. Свинтенок, В.П. Коксин,
Н.П. Анисимова, И.Р. Колясова, В.Н. Ослопов, Д.М. Зубаиров
Кафедра биохимии (зав. - докт. мед. наук И.Г. Мустафин), кафедра пропедевтики внутренних болезней (зав. - проф. В.Н. Ослопов) Казанского государственного медицинского университета, Республиканский центр профилактики СПИДа ( главврач - канд. мед. наук. О.М. Романенко)
Курение коррелирует с развитием и прогрессированием коронарной болезни сердца, цереброваскулярных заболеваний, расстройств периферического кровообращения, поражения вен нижних конечностей [2, 10]. Неотъемлемым патогенетическим фактором этих расстройств является развитие гиперкоагулемии, сопровождающей курение. Повышение уровня С-реак-тивного белка, фибриногена и гомоцисте-ина у курильщиков признано устойчивым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний [6]. Генетические детерминанты и курение оказывают кооперативный эффект, определяющий склонность к тромбозам и риск развития инфаркта миокарда [3]. В то же время исследования прямых эффектов курения на отдельные компоненты системы гемостаза как непосредственной причины гиперкоагуляции выявляют разнонаправленные влияния. В исследованиях группы А. Sambola обнаружено, что через 2 часа после выкуривания 2 сигарет возрастает уровень тканевого фактора (ТФ) [21]. Однако R.S. Barua не выявил изменений уровня ТФ эндотелиальных клеток у курильщиков, но отметил низкий уровень антикоагулянта - ингибитора пути тканевого фактора-1, который обратно коррелировал с уровнем сывороточного котинина - метаболита никотина [5]. N.L. Benowitz et al., активно разрабатывающие проблему влияния курения в течение многих лет, отмечали, что хотя курение и сопровождается повышением уровня фибриногена в плазме, сам никотин напрямую не вызывает увеличения ни уровня фибриногена, ни агрегационной способности тромбоцитов. Более того, его группа определила понижение прокоагу-лянтной активности фактора VII при курении [7]. При исследовании влияний никотина на уровень фибриногена в ряде случаев эффект не обнаруживался [8] , в то время как в других он не только подтверждался, но и был определен механизм гиперфибриногенемии, обусловленный повышением синтеза этого белка в гепато-цитах [14]. При изучении эффектов ку-
рения in vitro показано, что повышенный уровень тромбина, индуцированный тромбоцитами курильщиков по сравнению с некурящими, еще более возрастал непосредственно после курения. Добавление никотина или котинина в обогащенную тромбоцитами плазму некурящих приводило к усилению тромбинообразования [13]. Инкубация эндотелиальных и гладкомышечных клеток с никотином и коти-нином вызывала экспрессию в них мРНК ТФ. Поскольку экспрессия функционально активного ТФ на поверхности этих клеток являлась дозозависимой, требовала транскрипции ДНК и синтеза белка de novo, это свидетельствовало о том, что никотин способен непосредственно формировать прокоагулянтный фенотип эндотелия [9]. Различие в получаемых результатах чаще всего объясняют отличием экспериментальных моделей, доз сигаретного дыма / никотина и продолжительностью исследования.
Таким образом, на сегодняшний день, наряду с признанием курения фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний вообще и претромботических состояний в частности, вопрос о механизмах, вовлеченных в развитие гиперкоагулемии у курильщиков, не решен.
Прокоагулянтным маркером в крови, получившим признание за последние годы, являются клеточные микровезикулы - носители анионных фосфолипидов для сборки теназного и протромбиназного комплексов свертывающей системы крови, доступного ТФ, Р-селектина и его лиганда (PSGL). Эти субклеточные образования отделяются при активации и апоптозе эндотелия кровеносных сосудов и клеток крови и могут способствовать усилению прокоагулянтного эффекта при избыточном образовании и диссеминации [17]. В наших предыдущих работах было обнаружено повышенное образование микровезикул в крови под влиянием чрезвычайных стрессоров на ранних стадиях ги-перкоагулемии при острой кровопотере, ад-реналинемии и эндотоксинемии в экспе-
рименте [1]. Повышенный уровень тром-боцитарных и эндотелиальных микровезикул выявлен при остром коронарном синдроме и артериальной гипертензии [16]. Процесс микровезикуляции у курильщиков не изучен. Для ответа на вопрос, является ли однократная экспозиция дыма сигарет достаточным стимулом для усиления микровезикуляции в крови, было предпринято настоящее исследование, цель которого состояла в определении общего количества микровезикул в периферической крови и содержания на них компонента мембранных субдоменов - липидных плотов - экто-5'-нуклеотидазы до и в динамике после курения у здоровых добровольцев. В исследовании участвовали 52 здоровых добровольца (мужчины) в возрасте 17-24 лет. Всем обследованным была предоставлена информация о сути проводимого эксперимента с подписанием информированного согласия на участие. Для работы были сформированы 2 группы: стаж курения более одного года был у 31 обследованного, не курили - 21. Критерием включения было отсутствие сердечнососудистой патологии и тромботических эпизодов в анамнезе. Исследовали пробы венозной крови, взятой до курения, а также через 30 и 60 минут после выкуривания одной сигареты, содержавшей 0,4 мг никотина. В те же сроки измеряли АД и подсчитывали частоту пульса. Подсчет микровезикул: путем венепункции иглой G21 кровь в количестве 4 мл набирали в вакуумные пробирки, стабилизировали раствором цитрата натрия (разведение 9:1). Цитратную кровь центрифугировали 15 минут при 1500 g, отделяли бесклеточную плазму, которую разводили раствором Cell Wash (Becton Dickinson) в соотношении 1:50 и исследовали методом проточной цитометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson). Абсолютное количество микровезикул в 1 мкл определяли по светорассеиванию за фиксированное время (60 с) с использованием программы Cell Quest, регистрируя количество событий за единицу времени. Регистрация прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме позволяла дискриминировать микровезикулы в отдельной зоне. Активность экто-5'-нуклеотидазы определяли кинетическим методом в сыворотке [4].
Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с применением пакетов прикладных программ "Exell". Статистичес-
Таблица 1
АД и ЧСС у некурящих (n=21) в динамике после курения
Показатели Исходный уровень Через 30 минут Через 60 минут
СД,мм Hg ДД, мм Hg ЧСС, уд/мин АД и Ч 115,6± 5,3 75,0± 2,8 72,9± 2,9 С у курящи после к 113,8± 4,7 73,1± 3,4 74,0± 2,9 ix (n=31) в ди урения 112,1± 4,9 71,6± 2,7 73,4± 2,5 Таблица 2 намике
Показатели Исходный уровень Через 30 минут Через 60 минут
СД, мм Hg ДД, мм Hg ЧСС, уд/мин 115,8± 2,2 74,2± 2,6 73,9± 2,6 112,1± 2,7 65,8± 3,8 t=1,8 80,9±4,3 t=1,3 112,5± 2,1 67,9±4,1 75,3± 4,8
кую значимость различий между средними величинами оценивали по t критерию Стьюдента.
Исследование уровня АД и частоты сердечных сокращений (ЧСС) до курения и в динамике после выкуривания одной сигареты не выявило достоверных изменений этих параметров у некурящих (табл. 1). В группе курящих отмечалась выраженная тенденция к учащению сердечных сокращений и снижению диастолического давления через 30 минут после курения, однако она не достигала достоверных значений (табл. 2). Эти результаты согласуются с данными D. Hering et al., гагласно которым кратковременная симпатоадрен-ергическая реакция, обусловленная стимуляцией никотиновых рецепторов и выделением катехоламинов у молодых курильщиков, сопровождается более выраженным учащением сердечных сокращений, в то время как у курильщиков среднего возраста - более устойчивой вазоконстрик-цией [12].
Исследование уровня микровезикуля-ции как по общему количеству этих субклеточных образований, так и по содержащейся на них экто-5'-нуклеотидазе не выявило достоверных отклонений исследованных параметров ни в группе некурящих (табл. 3), ни в группе курящих обследованных (табл. 4). Вместе с тем при детальном анализе полученных результатов нам удалось выявить различия в характере микровезикуляции между группа-
Таблица 3
Уровень микровезикул у некурящих (п=21) в динамике после курения
Показатели Исходный уровень Через 30 минут Через 60 минут
Количество
микровезикул 269517,6± 268300,5 ± 251295,2 ±
в мкл ±73429,2 ±73719,4 ±70820,3
р>0,05 р>0,05
Активность
экто-5'-нук-
леотидазы 16,5 ± 6,8 15,3 ± 5,4
(шМ-шщ-Ч-1) 16,9 ± 6,7 р>0,05 р>0,05
Таблица 4
Уровень микровезикул у курящих (п=31) в динамике после курения
Показатели Исходный уровень Через 30 минут Через 60 минут
Количество
микровезикул 267934,5± 254436,3± 260886,5±
в мкл ±74678,6 ±90397,9 ±75644,4
р>0,05 р>0,05
Активность
экто-5'-нук-
леотидазы 16,6 ± 6,2 15,2 ± 5,8
с Е М (ш 14,6 ± 7,8 р>0,05 р>0,05
ми курящих и некурящих. В обеих группах были выделены 3 подгруппы обследованных: 1-я - с тенденцией к повышению как общего числа микровезикул, так и активности экто-5'-нуклеотидазы; 2-я - с тенденцией к понижению всех параметров и 3-я - без изменения данных. При таком подходе в группе некурящих (21 человек) выявлено 4 (19%) человека с тенденцией к повышению, 5 (24%) - с тенденцией к понижению и 12 (57%) - с разнонаправ-ленностью изменений исследуемых параметров на протяжении эксперимента. В то же время в группе курящих (31 чел.) обнаружено 12 (39%) человек с тенденцией к повышению как общего числа микровезикул, так и активности экто-5'-нуклеоти-дазы, из них 6 (19%) - с достоверным ростом активности экто-5'-нуклеотидазы через 30 минут после курения (исходный уровень - 8,58±1,18 шМшш-1- I-1, через 30 минут - 15,82±3,09 шМшш-11-1; р<0,05, п=10), 7 (22%) - с тенденцией к понижению и 12 (39%) - с разнонаправлен-ностью изменений исследуемых параметров в течение эксперимента (см. рис.).
Таким образом, наряду с отсутствием изменений интенсивности микровезикуля-ции у здоровых добровольцев после выкуривания сигареты, среди обследованных, хронически подвергающих себя экспози-
1
Динамика микровезикуляции у курящих: 1 -тенденция к повышению, 2 - достоверное повышение, 3 - тенденция к понижению, 4 - без изменений.
циям сигаретного дыма, выявлена группа лиц, прореагировавшая усилением микро-везикуляции через 30 минут после курения. С учетом потенциальных прокоагу-лянтных свойств микровезикул эту группу обследованных можно рассматривать, как имеющих риск развития гиперкоагу-ляционных реакций.
Хорошо известны острые системные эффекты никотина: возрастание частоты сердечных сокращений, временное сужение артерий, незначительное повышение АД, увеличение минутного объема дыхания. Никотин действует как мягкий сим-патомиметик, взаимодействуя с никотиновыми холинорецепторами (пАСЬЮ центральной нервной системы, изобилующими в катехоламинергических ядрах [22]. Хронический эффект никотина проявляется дозозависимым повышением а1-адренерги-ческой артериальной вазоконстрикции [24]. Результаты, полученные нами на здоровых добровольцах, не выявили достоверных изменений показателей центральной гемодинамики после курения, повышение ЧСС у курильщиков проявлялось лишь в виде тенденции.
Влияние никотина на сосудистую систему многофакторное, оно отражает активность центральных и периферических никотиновых рецепторов, а также прямое влияние на синтез вазоактивных медиаторов. Эндотелиоциты и лейкоциты, обладающие полноценной вненейрональной хо-линергической системой, синтезируют аце-тилхолин и экспрессируют как никотиновые, так и мускариновые рецепторы. Никотин оказывает прямой эффект на эти клетки, опосредованные а7пАСЬИ [11, 15]. Вовлечение тромбоцитов при курении является, вероятно, опосредованным катехоламинами, медиаторами эндотелиоцитов и лейкоцитарными цитокинами.
Отвечая на стимулы специфически в соответствии со своим происхождением и самим стимулом, клетки сосудистого сектора претерпевают спонтанное нарушение
мембранной асимметрии и отделяют микровезикулы. Микровезикуляция клеток является физиологическим процессом, сопровождающим их активацию и апоптоз. Образующиеся микровезикулы, несущие в своем составе мембранные детерминанты клеточного источника, обладают рядом биологических активностей, одной из важнейших среди которых выступает проко-агулянтная [23]. При физиологических условиях основным источником микровезикул в крови служат тромбоциты (до 70%), около 20% составляют микровезикулы эндотелиоцитов. Интенсивность образования микровезикул зависит от способа активации тромбоцитов в такой же мере, как и генерация их прокоагулянт-ной активности, т. е. при воздействии ионо-форов, коллагена с тромбином или мембраноатакующего комплекса комплемента С5Ь-9 она наиболее выраженная, при действии коллагена - умеренная, тромбина, АДФ или адреналина - слабая.
Курение, согласно данным литературы, оказывает два вида эффектов на тромбоциты: выраженный острый - активирующий сразу после курения и хронический -десенситизирующий клетки к стимуляторам на фоне более высокой функциональной активности. Выкуривание сигареты сопровождается активацией тромбоцитов при ее оценке по связыванию фибриногена и экспрессии Р-селектина, при этом у хронических курильщиков тромбоциты находятся в исходно более активированном состоянии по сравнению с таковым у некурящих [18]. Уровень серотонина в тромбоцитах имеет сходную динамику, повышаясь после выкуривания сигареты у некурящих и не меняясь у курильщиков, имеющих многократно более высокий уровень медиатора [20].
В настоящей работе мы продемонстрировали, что краткосрочная однократная экспозиция сигаретного дыма не вызывает у большинства здоровых молодых субъектов усиления микровезикуляции, являясь таким образом недостаточным стимулом для активации и мембранной перестройки клеток крови. Индивидуальная реакция 19% курящих, у которых выявлено достоверное кратковременное (через 30, но не 60 минут после курения) повышение уровня экто-5'-нуклеотидаза-содержащих микровезикул, свидетельствует о возможном формировании механизмов гиперреактивности клеток крови на компоненты сигаретного дыма.
Биологические эффекты никотина обеспечиваются быстрыми ответами при акти-
вации никотиновых холинорецепторов в нервных и соматических клетках, формированием аддикции и относительно более медленными эффектами, вовлекающими индукцию экспрессии генов при хроническом воздействии. Следует предположить, что влияние курения на микровезикуля-цию клеток крови у курильщиков с большим стажем, отличается от изученной реакции у лиц молодого возраста. Этот вопрос требует дополнительного исследования, поскольку липофильный ксенобиотик никотин, проникая в клетки и перепро-граммируя их, оказывает эффект хронического клеточного стрессора и является антропогенным патогенетическим фактором сердечно-сосудистых заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зубаирова Л. Д., Зубаиров Д. М., Андрушко И. А., Свинтенок Г. Ю, Мустафин И. Г. // Бюлл. эксп. биол. -
2006. - № 11. - С. 517-520.
2. Иоффина О. Б., Харченко В. И., Акопян А. С. // Тер. арх. -1999. -№71- С. 69-73.
3. Сироткина О.В. Молекулярно-генетические основы развития предрасположенности к артериальным тромбозам: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. -Санкт-Петербург, 2003.
4. Arkesteijn C.L. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem . -1976. - Vol.14. - P.155-158.
5. Barua R.S., et al. //Circulation. - 2002. -Vol.106. -Р.905-908.
6. Bazzano L.A. et al. // Ann. Intern. Med. - 2003. -Vol.138. -Р.891-897.
7. Benowitz N.L. et al. // J. Am. Coll. Cardiol. -1993. -Vol.22. —Р.1159—1167.
8. Blann A.D., Steele C, McCollum C.N. // Thromb. Haemost. -1997. - Vol.78. -Р.1093-1096.
9. Cirillo Р. et al. // Thromb. Haemost. - 2006. -Vol.95. -Р. 453-458.
10. Gray N. et al. // Tobacco Control. 2005. - Vol.14. -P.161-165.
11. Heeschen C. et al. // J. Clin. Invest. 2002. - Vol.110. -P. 527-536.
12. Hering D. et al. // J. Hypertens. - 2006. - Vol.24. -Р.691-695.
13. Hioki H. et al. // Eur. Heart J. - 2001. - Vol.22. -Р.56-61.
14. Humphries R. et al. // Thromb. Haemost. - 1999. -Vol.82. -Р.818-825.
15. Kawashima K, Fujii T. // Front. Biosci. 2004. -Vol.9. -Р.2063-2085.
16. Mallat Z. et al. // Circulation. - 2000. - Vol. 101. -P. 841-843.
17. Morel O, Toti F., Freyssinet J.M.// Ann. Pharm. Fr. -
2007. - Vol.65. -Р.75-84.
18. Nair S. et al. // Platelets. 2001. - Vol.12. - P. 20-26.
19. Preston R. A. et al. // Hypertension. - 2003. - Vol. 41. - P. 211-217.
20. Racke K., Schw?reH, Simson G. // Clin. Investig. 1992. - Vol.70. - P. 201-204.
21. Sambola A. et al. // Circulation. - 2003. - Vol.107. -Р.973-977.
22. Sharpies C.G.V. et al. // J. Neurosci. -2000. -Vol.20. -Р. 2783-2791.
23. Sinauridze E.I. et al. // Thromb. Haemost.-2007. -Vol.97. - P.425-434.
24. Xiao D. et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007. -Vol.322. - P.180-185.
Поступила 31.10.07.
DOES SMOKING EFFECT THE FORMATION OF BLOOD MICROVESICLES?
I.G. Mustafin, L.D. Zubairova, I.A. Kuzminyh, G.U. Svintenok, V.P. Koksin, N.P. Anisimova, I.R. Kalyasova, V.N. Oslopov, D.M. Zubairov S u m m a r y
Hypercoagulation mechanisms have been studied in smoking as one of the reasons of cardiovascular
disease development and prethrombotic conditions. Cellular microvesicles are a procoagulant blood marker the level of which rises in acute coronary syndrome, in stokes and in arterial hypertension. A study of the dynamic of total quantity and specific ecto-5'-nucleotidase containing microvesicles in blood in smoking has been conducted. In most young volunteers no increase in microvesiculation was seen 30 and 60 minutes after smoking a cigarette. However in 19% of smokers a short-term significant elevation of blood microvesicle level containing ecto-5'-nucleotidase was registered.
УДК 616. 5 - 002. 525. 2 - 07 : [612. 017. 1+ 616. 151. 5
ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОГО ВОСПАЛЕНИЯ И НАРУШЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ НАЛИЧИЯ У НИХ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА
В.И. Емануйлов, А.В. Аршинов, И.В. Масина, А. С. Дешеулин
Кафедра пропедевтики внутренних болезней (зав. - проф. Н.П.Шилкина) Ярославской государственной медицинской академии
Широкая распространенность венозных и артериальных тромбозов, микро-тромбоваскулитов - признаков тромбофи-лии при системной красной волчанке ( СКВ) определяет актуальность изучения иммунных механизмов, лежащих в основе нарушений гемостаза при данном заболевании, а антифосфолипидный синдром (АФС) наиболее полно отражает взаимосвязь иммунной и свертывающей систем при диффузных заболеваниях соединительной ткани [3]. Современная концепция повреждения сосудистой стенки при СКВ базируется на представлении о ведущей роли органонеспецифических аутоантител, а также цитокинов, играющих роль в протромботической активации эндотелия [4]. С учетом преобладающего профиля синтеза цитокинов СКВ расценивается как ТЬ-2-цитокинзависимое заболевание. По данным различных исследований, СКВ сочетает повышенную продукцию цитоки-нов как ТЬ-1, так и ТЬ-2 типа, в том числе фактора некроза опухоли-альфа (ТЫГ-а) и интерлейкина-4 (1Ь-4) [6, 9].
Экспериментальные исследования свидетельствуют о важной роли ТЫГ-а в деструкции эндотелиальных клеток, гиперкоагуляции, "предактивации" нейтрофилов и индукции апоптоза [10, 11]. Воспалитель-
ные медиаторы, подобные ТЫГ-а, могут вызывать выделение тканевого фактора на моноцитах и эндотелии, индуцируя таким образом коагуляционный каскад [5, 8]. Кроме того, ТЫГ-а может снижать выделение активатора плазминогена тканевого типа (1-РА) и повышать уровень ингибитора активатора плазминогена (РА1-1), подавляя таким образом фибринолиз [8].
Целью данного исследования являлась оценка взаимодействия процессов воспаления и гемостаза на основании изучения взаимосвязи между продукцией ТОР-а, 1Р-4, С-реактивного белка (СРБ) и показателями тромбоцитарно-сосудистого и коагуляционного гемостаза у больных СКВ в зависимости от наличия или отсутствия при системной красной волчанке антифос-фолипидного синдрома.
Были обследованы 50 больных с достоверной СКВ, которых подразделили на две группы: в 1-ю вошли больные с сопутствующим АФС (п=12), во 2-ю - без АФС (п=38). Диагноз СКВ устанавливали согласно критериям АРА.Диагноз АФС верифицировали по критериям О.И. Н^Ьея и Саппоровским диагностическим алгоритмам. У всех больных СКВ с АФС имели место тромбозы в анамнезе и аКЛ были представлены в высоком титре.
