CC BY
145
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.438-02:614.876]-092:612.017.1.06]-092.9
А.Д. Донецкова, Н.И. Шарова, М.Ф. Никонова, А.Н. Митин, М.М. Литвина, В.В. Комогорова, А.А. Ярилин
ВКЛАД ТИМУСА В ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИИ Т-КЛЕТОК ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ
различных повреждающих агентов
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г Москва
Работа посвящена выяснению зависимости вклада тимуса в восстановление популяции Т-лимфоцитов от особенностей восстановительных процессов в самом тимусе. Лимфопению индуцировали двумя способами: введением гидрокортизона в дозе 125 мг/кг и Y-облучением в дозе 4 Гр. Гидрокортизон вызывал опустошение тимуса без признаков регенерации в течение 20 сут, в то время как после облучения в этот временной период в тимусе происходила экстренная регенерация органа (пик - 12 сут), завершающаяся его вторичной атрофией. Вклад тимуса в восстановление периферических Т-клеток оценивали по поступлению во вторичные лимфоидные органы клеток, содержащих Т-рецепторные эксцизионные кольца (TREC - T-receptor excision circles), которые формируются в тимусе при перестройке Т-клеточного рецептора (TCR) и свидетельствуют о недавней эмиграции клеток из тимуса. На протяжении первых 20 сут после действия гидрококортизона не обнаружено признаков поступления Т-клеток из тимуса на периферию. После облучения регистрируются значительные волны эмиграции тимоцитов в лимфатические узлы и селезенку с максимумом на 12-е сутки, что соответствует периоду экстренного восстановления тимуса. Этот результат может трактоваться не только как проявление «помощи» со стороны тимуса в восстановлении популяции периферических Т-лимфоцитов, но и как реакция тимуса, которая направлена на освобождение от Т-клеток, испытавших прямое действие радиации и поэтому потенциально опасных.
Ключевые слова: эмиграция тимоцитов, Т-рецепторные эксцизионные кольца, облучение, введение гидрокортизона
A.D. Donetskova, N.I. Sharova, M.F. Nikonova, A.N. Mitin, M.M. Litvina, V.V Komogorova, \A.A. Yarilin
ROLE OF THYMUS IN RECOVERY OF T-CELLS POPULATION AFTER INFLUENCE OF VARIOUS DAMAGING AGENTS
National Research Center «Institute of Immunology» FMBA of Russia, 115478, Moscow, Russian Federation Our work is devoted to the analysis of dependency of thymus role in restoration of T-lymphocytes population from specificity of recovery processes in the thymus itself. Lymphopenia was induced by two ways: intraperitoneal hydrocortisone injections (125 mg/kg) and Y-irradiation (4 Gy). Hydrocortisone injections caused thymus depletion without signs of regeneration during 20 days whereas after the radiation there was an emergency thymic regeneration (with the maximum on the 12th day) during the same period of time followed by the secondary thimic atrophy. The thymus role in recovery of peripheral T-cells was evaluated by arrival of cells containing T-cell receptor excision circles (TRECs) to the secondary lymphoid organs. TRECs were generated in the thymus during rearrangement of TCR genes and indicated recent emigration of cells from the thymus. For the first 20 days after hydrocortisone injections there wasn't indication of T-cells migration from the thymus to the periphery. After radiation there were considerable waves of thymocytes emigration to the lymph nodes and to the spleen, the maximum was on the 12th days which is period of emergency thymic regeneration. The findings can be thought of not only as thimic “help” in restoration of peripheral T-lymphocytes population but also as reaction of the thymus directed to release from the T-cells which were exposed to the radiation and therefore could potentially be dangerous.
Key words: emigration of thymocytes, T-cell receptor excision circles. radiation, hydrocortisone injection
Восстановление постоянной численности Т-лимфоцитов осуществляется с помощью двух механизмов - притока новообразованных Т-клеток из тимуса и гомеостатической пролиферации в периферическом отделе иммунной системы. Второй механизм считается основным, особенно у взрослых [1]. Те же два механизма обеспечивают восстановление численности Т-клеток при действии на иммунную систему повреждающих агентов различной природы.
Учитывая, что различные повреждающие агенты отличаются по характеру повреждающего действия на тимус и вызывают в нем различные по механизму репаративные изменения, в данной работе мы исследовали зависимость вклада
Донецкова Альмира Дмитриевна (Donetskova Almira Dmitrievna), almira donetskova@yahoo.com;
тимуса в восстановление популяции Т-клеток от характера изменений в этом органе (при равной степени его исходного повреждения).
Материалы и методы. Объектом исследования служили мыши линии C57BL/6, самки массой 18-20 г, полученные из питомника РАМН «Столбовая». 1-ю группу мышей (n = 6) подвергали общему воздействию у-излучения 137Cs на установке «Стебель» (Россия) в дозе 4 Гр. Забой мышей и исследование лимфоидных органов проводили через 4, 8, 10, 12, 20, 30 и 60 сут после облучения. 2-й группе мышей (n = 6) вводили гидрокортизона ацетат в дозе 125 мг/кг внутрибрюшинно однократно. Забой мышей 2-й группы проводили через 5, 10, 20 и 30 сут после введения гидрокортизона. Контролем к каждому сроку наблюдения служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и опытные.
Тимус, селезенку и четыре лимфатических узла (два под-
- 309 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
мышечных и два подколенных) извлекали, освобождали от соединительной ткани, суспензировали в PBS с добавлением 1% BSA и 0,1% NaN3, удаляли эритроциты с помощью лизирующего буфера, дважды отмывали физиологическим раствором. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева.
Суспензии обрабатывали моноклональными анти-cDS-антителами, меченными APc (аллофикоцианин) (eBiosci-ence, США). Клетки инкубировали с моноклональными антителами в присутствии 0,1% NaN3 в течение 30 мин при 4оС. Трижды отмытые клетки фиксировали параформальдегидом. Проточную лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FAcScanto™ II (Becton Dickinson, США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FAcSDiva и FCS Express.
1 • 106 клеток в 100 мкл физиологического раствора использовали для выделения ДНК с помощью набора «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия). Содержание Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC - T-receptor excision circles) определяли с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) по общепринятым методикам [2, 3] с некоторыми модификациями. В качестве стандарта использовали разведения синтезированных плазмид с известными концентрациями ДНК TREC и константный ген a-цепи Т-клеточного рецептора (TCR) - TCRA.
Для количественного определения кольцевой ДНК, содержащей сигнальные соединительные последовательности sjTREC (signal-joint TREC, в дальнейшем TREC), методом ПЦР в режиме реального времени синтезировали праймеры TREC: прямой 5’-CCAAGCTGACGGCAGGTTT-3’, обратный 5’-AGCATGGCAAGCAGCACC-3’, зонд FAM-5’-TGCTGTGTGCCCTGCCCTGCC-3’-RTQ-1 (Broers).
a
Рис. 1. Изменение количества клеток в лимфоидных органах мышей в процессе восстановления после действия повреждающих факторов.
По оси абсцисс здесь и на рис. 2, 3: сутки после облучения; по оси ординат - количество клеток, (в •106) в тимусе (а) и в лимфатических узлах (б).
В качестве нормировочного гена выбрали TCRA, праймеры к нему следующие: прямой 5-TGACTCcCAAATCAATGTG-3, обратный 5’-GCAGGTGAAGCTTGTCTG-3’, зонд FAM-5’-TGCTGGACATGAAAGCTATGGA-3’-RTQ-1 [2].
ПЦР ставили в объеме 25 мкл по следующей программе: 1 цикл - 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 45 циклов - 95°С 15 с, 60°С 1 мин, использовали прибор “7300 Real-Time PCR System” (Applied Biosystems).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали Н-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica.
Результаты и обсуждение. Для того чтобы облегчить понимание работы, мы предваряем описание результатов двумя разъяснениями. Первое из них касается методического аспекта. Мы оценивали вклад тимуса в восстановление популяции периферических Т-лимфоцитов, определяя в последних количество TREC. Эти эписомальные структуры формируются в процессе перестройки генов TCR при созревании Т-клеток в тимусе [3]. В периферический отдел иммунной системы они могут попасть только в составе эмигрирующих из тимуса Т-лимфоцитов и, таким образом, могут служить мерой эмиграции Т-клеток из тимуса на периферию [4]. Для характеристики этого процесса использовали два индекса. Один из них - соотношение (по количеству копий) TREC/TCRA (TCRA - константный ген a-цепи TCR, который присутствует во всех клетках организма), характеризующее долю TREC-содержащих клеток от всех клеток органа. Второй индекс - количество копий TREC, пересчитан-
Рис. 2. Изменение индекса TREC/TCRA в тимусе мышей в процессе восстановления после действия повреждающих факторов.
По оси ординат - индекс sjTREC/TCRA (в •10-3) после общего у-облучения в дозе 4 Гр (а) и после воздействия гидрокортизона (б).
- 310 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 1
Изменение в динамике индекса sjTREC/TCRA в лимфоидных органах мышей после общего у-облучения в дозе 4 Гр
Срок, сут sjTREC/TCRA, • 10-3
тимус лимфоузлы селезенка
Контроль 41,74 (34,49-47,80) 13,29 (10,05-15,73) 6,18 (5,25-6,69)
4 9,75* (5,89-13,47) 0,21* (0,09-0,45) 12,89 (8,07-13,83)
8 54,83 (27,89-84,58) 16,68 (6,96-26,40) 1,81* (1,41-2,62)
12 38,04 (28,94-41,97) 39,91* (29,30-50,52) 4,14 (3,42-4,87)
20 29,37 (18,35-33,26) 5,51* (4,99-7,09) 1,83* (1,39-2,29)
30 31,85 (23,43-37,34) 6,63* (2,80-8,46) 1,31* (0,54-1,53)
60 38,42 (19,48-51,47) 7,70* (4,59-8,73) 3,86* (1,90-4,20)
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - p < 0,05.
Таблица 2
Изменение в динамике индекса sjTREC/TCRA в лимфоидных органах мышей после введения гидрокортизона
Срок, сут sjTREC/TCRA, • 10-3
тимус лимфоузлы селезенка
Контроль 58,44 (46,18-73,43) 14,42 (10,49-19,00) 6,32 (2,88-8,36)
5 13,26* (11,29-19,34) 10,70 (4,65-12,82) 13,73* (9,98-17,81)
10 16,35* (7,46-35,55) 23,86 (16,55-31,17) 6,13 (4,74-8,42)
20 45,51 (29,72-46,85) 28,87 (12,00-48,36) 7,06 (3,62-7,58)
30 51,89 (38,10-61,96) 15,05 (4,71-34,15) 6,68 (2,86-9,50)
ное на количество CDS+Т-клеток, - отражает долю недавних эмигрантов из тимуса в популяции Т-лимфоцитов.
Второе разъяснение касается различий в ситуациях в тимусе, которые могут сложиться после действия различных повреждающих факторов (в нашем случае ионизирующей радиации и гидрокортизона). Ионизирующие облучения являются генотоксическим фактором, что обусловливает важность радикального освобождения организма от поврежденных клеток. В случае тимуса это достигается следующим образом: на срок около 20 сут блокируется развитие клеток-предшественников, поступающих в орган после облучения, а клетки, пережившие облучение, синхронизируются и завершают свое развитие, в свой черед эмигрируя из органа. Нормальные процессы тимопоэза восстанавливаются после 20 сут уже в отсутствие клеток, испытавших прямое действие радиации. За этот период на периферии оказывается определенное количество Т-клеток, эмигрировавших в конкретные временные промежутки. Гидрокортизон не является генотоксическим агеном. Его действие не приводит к столь серьезным изменениям в тимусе: орган, как обычно, принимает клетки-предшественники, которые равномерно развиваются в нем, и в конечном счете так же равномерно созревшие Т-клетки покидают орган. В задачи статьи входило установить особенности участия клеток тимуса в зависимости от условий состояния самого этого органа в восстановлении периферической популяции Т-лимфоцитов.
Облучение мышей в дозе 4 Гр и введение гидрокортизона в дозе 125 мкг вызывает сходный уровень опустошения лимфоидных органов. Клеточность тимуса у мышей на 4-е сутки после обучения (максимум опустошения) составляет 1,8% исходного, в тот же срок после введения гидрокортизона -0,8%. В лимфатических узлах соответствующие значения составляют 3,1 и 4,8%, в селезенке - 6,2 и 12,1%. Таким образом, исходный уровень повреждения лимфоидных органов облучением и гидрокортизоном в указанных условиях оказывается сопоставимым.
Последующие события в тимусе обученных и обработанных гидрокортизоном мышей оказываются кардинально различными (рис. 1, а). Численность клеток в тимусе облученных мышей после 4 сут быстро возрастает, достигая исходного уровня к 10-12-м суткам, а затем снижается к 20-м суткам почти до минимума. Эти фазы пострадиационных процессов в тимусе описаны как экстренное восстановление и вторичная атрофия [5, 6]. У мышей, получивших инъекцию гидрокортизона, полностью отсутствует пик экстренного восстановления: содержание клеток до 20-х суток практически не возрастает. При действии обоих агентов практически полное восстановление численности клеток в тимусе наблюдали между 20ми и 30-ми сутками. Таким образом, хотя конечные результаты восстановительных процессов после опустошения тимуса двумя разными агентами практически одинаковы, промежуточные события процесса регенерации очень сильно различаются, что является необходимым условием проведения эксперимента.
Параллельная оценка повреждения и последующего восстановления численности лимфоцитов в периферическом отделе иммунной системы после действия облучения и гидрокортизона проиллюстрирована на примере лимфатических узлов на рис. 1, б. Кривые восстановления демонстрируют его постепенный и равномерный характер, причем до 20-х суток кривые восстановления после действия облучения и гидрокортизона практически совпадают, а позже пострадиационная регенерация Т-клеток несколько опережает (не принципиально) темп их восстановления после действия гидрокортизона.
Однако задача данной работы состояла не в изучении восстановления клеточности лимфоидных органов после индуцированной лимфопении, а в установлении роли тимуса в восстановлении периферических Т-клеток, которую можно зарегистирировать по перемещению TREC-содержащих Т-клеток из тимуса на периферию.
В суммированном виде численные данные о динамике содержания TREC (соотношение TREC/TCRA) в лимфоидных органах мышей при восстановлении после облучения и действия гидрокортизона представлены в табл.1, 2.
Прежде всего мы оценили потенциал тимуса при двух вариантах его восстановления с точки зрения содержания в нем TREC-содержащих клеток, т. е. тимоцитов, в которых осуществился процесс перестройки генов TcR (рис. 2 ) и которые участвуют в заселении вторичных лимфоидных органов. Значительный дефицит TREC зарегистровали в тимусе облученных мышей только на 5-е сутки, а после обработки гидрокортизоном - на 5-10-е сутки после воздействия. В то же время мы видим значительный всплеск численности TREc у облученных мышей в период, предшествующий экстренной регенерации тимуса (8-10-е сутки). В это время индекс TREC/TCRA в тимусе в 1,5 раза превышает его исходное (до облучения) значение. После 10-х суток значения индекса возвращаются к норме. У мышей, обработанных гидрокортизоном, индекс TREc/ TcRA соответствует норме. Таким образом, можно заключить, что при действии обоих агентов содержание TREC-содержащих клеток в процессе регенерации достаточно велико за исключением самых ранних этапов восстановления.
Наиболее важным показателем с точки зрения задач, решаемых в данной работе, является оценка эмиграции TREC-содержащих клеток во вторичные лимфоидные органы на фоне восстановления популяции периферических Т-лимфоцитов. В случае периферических лимфоидных органов мы рассчитывали содержание недавних эмигратнов
- 311 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
Процент TREC-содержащих Т-клеток в лимфоузлах Процент TREC-содержащих Т-клеток в селезенке
V//A Без облучения
1Ш1 Первичная атрофия(4 сут)
К&Я Экстренное восстановление ___ (10 сут)
Вторичная атрофия(20 сут) Окончательное восстановление (30 сут)
ШШ 4-20 сут 5-60 сут
80
70 -605040 -302010 -0-
е
Л
V//A Без облучения СЕЯ 2-5 сут ВШ! 3-10 сут
4- 20 сут
5- 30 сут
I;::;::;! 4-20 сут 5-30 сут
Рис. 3. Изменение процента TREC-содержащих Т-клеток (недавних эмигрантов из тимуса) во вторичных лимфоидных органах мышей в процессе восстановления после действия повреждающих факторов. По оси ординат - показатели, которые нормированы по контролю, принятому за единицу.
а - общего у-облучения в дозе 4 Гр; б - гидрокортизона.
из тимуса, т. е. процент TREC-содержащих клеток на содержание CD3+-клеток. Таким образом, мы рассчитывали содержание на периферии недавних эмигрантов из тимуса. Измерение вклада тимуса в восстановительные процессы по уровню TREC-содержащих Т-клеток (недавних эмигрантов из тимуса) показало следующее (рис. 3). В случае пострадиационного восстановления в лимфатических узлах зарегистрировали единственный четко выраженный пик TREC-содежащих Т-клеток на 12-е сутки после облучения. В этот срок количество этих клеток в лимфатических узлах соответствует их содержанию у необлученных мышей. Позже численность TREC-содержащих Т-клеток значительно снижается и сохраняется на сниженном уровне до 60-х суток. В селезенке отметили аналогичный, хотя и менее выраженный и не столь четко локализованный во
Пути и сроки развития тимоцитов, переживших облучение
Рис. 4. Изменение содержания TREC в лимфоидных органах мышей в процессе восстановления после общего у-облучения в дозе 4 Гр (а, б) и введения гидрокортизона (в, г).
По оси абсцисс - события в тимусе на клеточном уровне, по оси ординат - индекс TREC/TCRA (Т0'3): а, в - в тимусе; б, г - в лимфатических узлах; * -р < 0,05.
времени подъем количества TREC-содержащих клеток на 12-20-е сутки.
После действия гидрокортизона усиленные выбросы TREC-содержащих Т-клеток на периферию отсутствуют. При этом кривые, отражающие численность недавних эмигрантов из тимуса в лимфатических узлах и селезенке, практически совпадают: после спада на 5-10-е сутки они достигают нормы и остаются на этом уровне до конца наблюдения.
На рис. 4 отражено изменение в динамике содержания TREC в тимусе и лимфатических узлах мышей с лимфо-пенией, индуцированной облучением и гидрокортизоном (TREC/TCRA), в соответствии с этапами восстановления клеточности тимуса. После действия радиации весьма четко прослеживается соответствие уровня TREC уровню клеточности тимуса: и в тимусе, и в лимфатических узлах подъем количества копий TREC соответствует периодам возрастания клеточности, а его снижение - периодам атрофии. После действия гидрокортизона, когда экстренное восстановление и вторичная атрофия тимуса отсутствуют, не наблюдали и соответствующих колебаний содержания TREC ни в тимусе, ни лимфатических узлах; вместо этого зарегистрировали его постепенный подъем.
Таким образом, мы получили вполне четкий ответ на исходно поставленный вопрос: вклад тимуса в восстановление популяции
Т аблица 3
Стадия развития тимоцитов на 4-5-е сутки Последующие события Статус на 10-12-е сутки (пик экстренного восстановления) Срок эмиграции из тимуса, сут
DN3, DN4 Перестройка генов TCR, переход в DP DP (основная часть клеток в тимусе при экстренной регенерации) 15-17
DP Селекция, созревание в SP SP 10-12 (в составе главного пика клеток, эмигрирующих на периферию)
SP Эмиграция - 4-5
- 312 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Т-лимфоцитов в значительной степени определяется процессами, происходящими в регенерирующем тимусе. При условии наличия фазы экстренной регенерации тимуса (при пострадиационном восстановлении) на ее высоте зарегистрировали выход значительной части TREC-содержащих тимоцитов во вторичные лимфоидные органы в виде четко сформированного пика, соответствующего 10-12 сут после облучения. После обработки гидрокорти-озоном экстренное восстановление тимуса отсутствует, и эмиграция тимоцитов на периферию сильно задерживается во времени, проявляясь лишь к 20-м суткам после действия фактора. Два описанных варианта восстановления тимуса и его взаимодействия с периферическим отделом иммунной системы можно обозначить как пассивный и активный.
Пассивный вариант характерен для случаев с действием агентов, не обладающих генотоксичностью (гидрокортизон, облучение в дозах 2 Гр и менее [5]). Активный вариант характерен для действия таких генотоксических агентов, как сублетальное облучение. От пассивного варианта он отличается наличием выраженной восстановительной реакции в тимусе на протяжении 20-суточного периода после облучения. Эта реакция неэффективна, поскольку завершается вторичной атрофией вследствие истощения внутритимусных ресурсов, однако она сопровождается достаточно интенсивной эмиграцией тимоцитов во вторичные лимфоидные органы.
Исчерпывающего объяснения механизмов запуска и биологической значимости реакции экстренного восстановления тимуса не существует. Мы трактуем эти события как защитную реакцию на действие облучения (обладающего, как сказано выше, генотоксичностью): на протяжении 20 сут в тимусе разворачиваются события, направленные на ускоренное удаление клеток, испытавших прямое действие радиации и потенциально содержащих генетические повреждения. Известно, что облучение способно индуцировать синхронизированную пролиферацию выживших клеток [6]. В результате клетки, относящиеся к стадиям развития DN (двойные негативные), DP (двойные позитивные) и SP (одинарно позитивные), начиная с пика первичной атрофии (4-5-е сутки), развиваются независимо в соответствии со своей дифференцировочной программой, что отражено в табл. 3. Таким образом, описанные нами пики эмиграции тимоцитов в лимфатические узлы и селезенку, регистрируемые на 10-12-е сутки и (менее четкий) на 15-17-е сутки, являются результатом дозревания клеток, оказавшихся в тимусе в период его пострадиационной изоляции.
Описанная гипотетическая картина ставит вопрос о
том, направлено ли усиление миграции тимоцитов на периферию в пострадиационный период на предотвращение развития Т-лимфопении на периферии, т. е. является ли защитным актом или это результат процессов, направленных всего лишь на освобождение тимуса от опасного клеточного балласта. В любом случае эти процессы завершаются к 20-м суткам, после чего снимается блокада с клеток-предшественников, поступивших в тимус, и восстановление тимуса идет тем же путем, каким происходит обновление в тимоцитов в норме. Неясно, в какой степени Т-клеткам, эмигрирующим из тимуса после облучения, присуща биологическая активность. То, что на кривых их численности на периферии присутствуют пики, а не плато, свидетельствует о быстрой элиминации самих клеток или быстрой утрате ими TREc (вероятно, в ходе пролиферации). В любом случае судьба Т-клеток, эмигрировавших во вторичные лимфоидные органы на протяжении 20 сут после облучения, и проявление их биологической активности на периферии представляют специальный интерес.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований; грант 11-04-01741-а.
REFERENCES
1. WilliamsK.M., Hakim F.T., GressR.E. T cell immune reconstitution following lymphodepletion. Semin. Immunol. 2007; 19 (5): 318-30.
2. Broers A., Meijerink J., van Dongen J. et al. Quantification of newly developed T cells in mice by real-time quantitative PCR of T-cell receptor rearrangement excision circles. Exp. Hematol. 2002; 30 (7): 745-50.
3. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F. et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396 (6712): 690-5.
4. Hazenberg M.D., Verschuren M.C., Hamann D. et al. T cell receptor excision circles as markers for recent thymic emigrants: basic aspects, technical approach, and guidelines for interpretation. J. Mol. Med. 2001; 79 (11): 631-40.
5. Takada A., Takada Y., Ghestner C.H., Ambrus J.L. Biphasic pattern of thymus regeneration after whole-body irradiation. J. Exp. Med. 1969; 129 (3): 445-57.
6. Yarilin A.A. Radiation-induced damage of thymocytes and thymic stromal cells. Manifestations and after-effects. Physiol. Gen. Biol. Rev. 1995; 10: 1-58.
Поступила 11.06.13
- 313 -
