CC BY
248
^^ Элект^онне«4< нйучмо-о^рдзоблтел&ниы
В с сп^ник
2015, том 17 [5]
—--—
УДК: 582.711.71:581.47:547.973-024.17]:543.422.3
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ АНТОЦИАНОВ В ПЛОДАХ АРОНИИ ЧЕРНОПЛОДНОЙ
В.Ю. Андреева, Н.В. Исайкина
ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России Московский тракт, 2/7, Томск, Россия, 634050 эл. почта: vilival@yandex.ru
Плоды аронии черноплодной (рябины черноплодной) являются официнальным лекарственным сырьем. Свежие плоды, сок аронии и таблетки оказывают адаптогенное, спазмолитическое, гипотензивное, диуретическое, желчегонное, антиатеросклеротическое, С- и Р-витаминное действие. Для стандартизации сырья нами ранее был предложен метод количественного определения суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной сухих методом прямой спектрофотометрии в видимой области при длине волны 544 ± 2 нм в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид. В соответствии с нормативными документами, регламентирующими процессы валидации новых аналитических методов, для аттестации методики количественного определения суммы антоцианов необходимо было провести определение следующих параметров: прецизионность (повторяемость) и воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильность и линейность. Статистическая обработка полученных результатов в условиях повторяемости, показала, что они достоверны при доверительной вероятности 95%, вычисленные значения величины относительного стандартного отклонения (RSD) — 0,005% и относительного доверительного интервала среднего значения — 0,52% не превышают критериев приемлемости — 5%, Воспроизводимость методики также является удовлетворительной, так как меры прецизионности для данного метода измерений не превышают критериев приемлемости как для внутрилабораторной прецизионности 1,50% < 10%, так и для межлабораторной прецизионности 8,06% < 15%. В ходе определения линейности установлено, что график зависимости имеет линейный характер в области концентрации суммы антоцианов. Коэффициент корреляции близок к единице -0,978, что свидетельствует о сильной линейной зависимости значения оптической плотности от содержания действующих веществ. Правильность методики устанавливали на идентичных образцах плодов аронии черноплодной с добавлением известного количества стандартного образца цианидин-3-О-глюкозида. В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 98,20% до 102,63%, его средняя величина составила 100,33%, что находится в пределах 100 ± 5%. Таким образом, валидация методики количественного определения суммы антоцианов в экстракте плодов аронии черноплодной по следующим характеристикам: прецизионность (повторяемость) и воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильность и линейность показала, что данная методика является высокочувствительной, правильной и воспроизводимой и может быть использована для стандартизации сырья.
Ключевые слова: валидация, арония черноплодная, антоцианы, повторяемость, воспроизводимость, линейность, правильность.
Плоды аронии черноплодной (рябины черноплодной) являются официнальным лекарственным сырьем. Таблетки «Арония+С», свежие плоды и сок аронии, оказывающие адаптогенное, спазмолитическое, гипотензивное, диуретическое, жел-
чегонное, антиатеросклеротическое, С- и Р-вита-минное действие, назначают для профилактики Р-витаминной недостаточности, лечения гипертен-зии I и II стадий и других заболеваний, сопровождающихся повышением артериального давле-
—--—
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [5]
ния. Широкий спектр фармакологических свойств аронии черноплодной обусловлен содержанием богатого комплекса биологически активных веществ (БАВ). Для стандартизации плодов аронии черноплодной высушенных нами предложена ранее методика количественного определения суммы антоцианов методом прямой спектрофото-метрии в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид [1]. Для того чтобы аналитические методики гарантировали достоверные и точные результаты анализа, предусмотрена процедура их валидации (аттестации) [2; 3]. В связи с этим, целью настоящего исследования была валидационная оценка методики спектрофотометрического определения количественного содержания суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной сухих.
Материалы и методы. Объектами исследования служили образцы плодов аронии черноплодной, высушенные до воздушно-сухого состояния.
Количественное определение антоцианов проводили методом прямого спектрофотометриче-ского определения при длине волны 544 нм в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид в соответствии с ранее разработанной методикой [1]. При этом
принятое опорное значение содержания антоцианов составило 10,859 ± 0,056%.
Валидацию методики проводили методами математической статистики по следующим показателям: прецизионность (повторяемость), воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильность и линейность [2; 3]. Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2007».
Результаты исследования. Повторяемость методики определяли в условиях, при которых шесть независимых результатов измерений получали одним методом, в одной лаборатории, одним лаборантом-исследователем, с использованием одного спектрофотометра, в пределах короткого промежутка времени. Статистическая обработка полученных результатов, показала, что они достоверны при доверительной вероятности 95%, вычисленные значения величины относительного стандартного отклонения (RSD) — 0,005% и относительного доверительного интервала среднего значения — 0,52% не превышают критериев приемлемости — 5%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости (табл. 1).
Таблица 1
Результаты оценки повторяемости методики
№ опыта 1 2 3 4 5 6
Обьем аликвоты 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1.00
Оптическая плотность, D 0,414 0,414 0,419 0,417 0,417 0,418
Содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-гликозид, % 10,794 10,794 10,925 10,872 10,872 10,890
Метрологические характеристики
Хср S2 S S. Sr P (%) t (P, f) Ar ср £, %
10,8599 0,0029 0,0540 0,0220 0,0049 95 2,57 0,0567 0,5223
Воспроизводимость методики определяли на идентичных образцах сырья совместным оценочным экспериментом в двух различных лабораториях СибГМУ на различных приборах, разными
лаборантами-исследователями по 3 испытания образца на трех разных уровнях концентраций в интервале 80—120% от принятого опорного значения (табл. 2). Статистическое тестирование выбросов
—--—
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [5]
проводили с использованием критерия Кохрена, дисперсии и стандартного отклонения для каждого уровня и рассчитывали по ГОСТ Р ИСО [3]. При рассмотрении данных, не обнаружив, какой либо зависимости, в качестве показателей прецизионности, нами были выбраны средние значения стандартных отклонений. Данные значения стандартных отклонений могут быть применены в диапа-
зоне содержания антоцианов от 0,05 до 0,22 по массе. Меры прецизионности для данного метода измерений не превышают критериев приемлемости как для внутрилабораторной прецизионности 1,50% < 10%, так и для межлабораторной прецизионности 8,06% < 15%, что указывает на удовлетворительную воспроизводимость методики.
Таблица 2
Результаты оценки воспроизводимости методики
Лаборатория № 1 Лаборатория № 2
Уровни 1 2 3 1 2 3
Объем аликвоты раствора А, мл 0,75 1,00 1,25 0,75 1,00 1,25
Оптическая плотность 0,257 0,414 0,615 0,238 0,439 0,663
Содержание антоцианов, % 6,70 10,79 16,04 6,20 11,45 17,30
Оптическая плотность Б2 0,259 0,414 0,624 0,285 0,438 0,664
Содержание антоцианов, % 6,75 10,79 16,27 7,43 11,44 17,31
Оптическая плотность Б3 0,254 0,419 0,628 0,285 0,436 0,671
Содержание антоцианов, % 6,62 10,92 16,37 7,43 11,36 17,49
Среднее содержание 6,69 10,83 16,22 7,02 11,41 17,37
антоцианов, %, Хср
Метрологические характеристики
№ лабора- Хср £ Р, % / (Р, 1)* Ах £, %
тории
1 6,69 0,0043 0,0656 0,0378 0,0098 95 4,3 0,1629 2,43
1 10,84 0,0056 0,0301 0,1002 0,0069 95 4,3 0,1116 1,03
1 16,23 0,0301 0,1736 0,1002 0,0106 95 4,3 2,6561 0,01
2 7,02 0,5006 0,7075 0,4048 0,1007 95 4,3 1,7565 2,50
2 11,41 0,0051 0,0398 0,0225 0,0034 95 4,3 0,0590 0,52
2 17,37 0,0117 0,1085 0,0626 0,0062 95 4,3 0,2693 1,55
Линейность аналитической методики определяли на пяти уровнях концентрации от принятого опорного значения расчетной величины (10,86%). Образцы готовили путем изменения аликвоты (табл. 3) В ходе определения линейности установлено, что график зависимости имеет линейный характер в области концентрации суммы антоцианов и описывается уравнением: у = 3,7422х + 1,0463
Коэффициент корреляции близок к единице -0,978, что свидетельствует о сильной линейной
зависимости значения оптической плотности от содержания действующих веществ. График зависимости представлен на рисунке.
Правильность методики устанавливали на идентичных образцах плодов аронии черноплодной с добавлением известного количества стандартного образца (СО) цианидин-3-О-глюкозида по 3 испытания образца на трех уровнях концентраций (табл. 4).
—--—
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [5]
Результаты оценки линейности методики
Таблица 3
Номер уровня Объем аликвоты Объем % от принятого Содержание
раствора А раствора Б опорного значения антоцианов,%
Первый 0,50 50,0 50 6,27
Второй 0,75 50,0 75 7,04
Третий 1,00 50,0 100 11,14
Четвертый 1,25 50,0 125 16,78
Пятый 1,5 50,0 150 20,12
Ряд1
Линейная (Ряд1)
25 y = 3,7422х + 1,0463
R2 = 0,9561
20 15 10 5 0
0,50 0,75 1 1,25 1,5
Рис. 1. График линейной зависимости между оптической плотностью и содержанием суммы антоцианов в плодах аронии черноплодной
Результаты определения правильности методики
Таблица 4
Уровни (концентрации) 1 1 1 2 2 2 3 3 3
V — сбъем аликвоты 0,75 0,75 0,75 1,00 1,00 1,00 1,25 1,25 1,25
раствора А, мл;
Оптическая плотность, D 0,257 0,259 0,254 0,414 0,414 0,419 0,615 0,624 0,628
Содержание суммы 0,0503 0,0506 0,0497 0,1079 0,1079 0,1092 0,2005 0,2034 0,2046
антоцианов, г
Добавлено СО цианидин-3- 0,005 0,005 0,005 0,010 0,010 0,010 0,020 0,020 0,020
О-глюкозида, г
Содержание суммы 0,0553 0,0556 0,0547 0,1179 0,1179 0,1192 0,2205 0,2234 0,2246
антоцианов (ожидаемое), г
Оптическая плотность, D\ 0,283 0,285 0,280 0,452 0,452 0,457 0,676 0,685 0,689
Содержание суммы 0,0551 0,0546 0,0554 0,1193 0,121 0,1187 0,2212 0,2234 0,2249
антоцианов (полученное), г
Отношение, % 99,64 98,20 101,28 101,19 102,63 99,58 100,32 100,00 100,13
M полученное • 100%
М ожидаемое
— 4 —
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
2015, том 17 [5]
Критерий приемлемости — средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, средняя величина которого должна находиться в пределах 100 ± 5%. В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 98,20% до 102,63%, его средняя величина составила 100,33%.
Заключение. Проведена валидация методики количественного определения суммы антоцианов в экстракте плодов аронии черноплодной методом прямой спектрофотометрии по следующим характеристикам: прецизионность (повторяемость) и воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильность и линейность.
На основании полученных данных установлено, что данная методика является высокочувствитель-
ной, правильной и воспроизводимой и может быть использована для стандартизации сырья «Плоды аронии черноплодной».
ЛИТЕРАТУРА
1. Методика определения антоцианов в плодах аронии черноплодной / Андреева В.Ю., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Исайкина Н.В. // Фармация. 2013. № 3. С. 19—21.
2. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(R1); Официальные документы // Фармация. 2008. № 4. С. 7—10.
3. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. М.: ИПК Издательство стандартов, 2002. 42 с.
VALIDATION OF SPECTROPHOTOMETRIC METHODS FOR DETERMINING THE AMOUNT OF ANTHOCYANINS IN FRUITS OF CHOKEBERRY
V. Y. Andreeva, N. V. Isaykina
Siberian state medical university
Moscowski Trakt str., 2/7, Tomsk, Russia, 634050
e-mail: vilival@yandex.ru
Validation of methods of quantitative determination of the amount of anthocyanins in the extract of the fruits of chokeberry by direct spectrophotometry according to the following characteristics: the precision and reproducibility, accuracy and linearity. It is established that this technique is highly sensitive, accurate and reproducible and can be used for standardization of raw materials.
Key words: validation, chokeberry, anthocyanins, repeatability, reproducibility, linearity, accuracy.
REFERENCES
1. Andreeva V.Y., Kalinkina G.I., Kolomiec N.E., Isaykina N.V. Farmacija, 2013, no 3, pp. 19—21.
2. Rukovodstvo ICH «Validacija analiticheskih meto-dik. Soderzhanie i metodologija» Q2(R1); Oficial'nye do-kumenty. Farmacija, 2008, no 4, pp. 7—10.
3. GOST R ISO 5725-2-2002. Tochnost' (pravil'nost' i precizionnost') metodov i rezul'tatov izmerenij. Chast' 2. Osnovnoj metod opredelenija povtorjaemosti i vosproizvo-dimosti standartnogo metoda izmerenij, M.: IPK Izdatel'stvo standartov, 2002, 42 p.
—--—
— 5 —
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
