Валидация методики количественного определения схизандрина в извлечениях лимонника китайского Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Бюллетень Брянского отделения РБО, 2014. № 2(4). С. 64-68.

Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2014.

N 2(4). P. 64-68.

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 582.6/9:[615.451.16:615.074]

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СХИЗАНДРИНА В ИЗВЛЕЧЕНИЯХ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО

© В. М. Ёршик, В. И. Фадеев, А. Д. Петухова

V. M. Yorshyk, V. I. Fadeev, A. D. Petuhova

Validation of analytical method for assay of schizandrin in the extracts of magnolia vine

УО «Витебский ордена Дружбы народов государственный медицинский университет»

210000, Республика Беларусь, г. Витебск, пр-т Фрунзе, 27. Тел.: +37521-237-00-06, e-mail: admin@vsmu.by

Аннотация. Разработана и валидирована методика количественного определения схизандрина в углекислот-ном, сприртовом экстракте и водном извлечении Лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turz) Baill.). Проведена стандартизация экстрактов и водного извлечения.

Ключевые слова: лимонник китайский, ВЭЖХ, схизандрин, лигнаны, валидация.

Abstract. Method for assay of schizandrin in carbon-dioxide, ethanolic extract and aqueous recovery of magnolia vine (Schisandra chinensis (Turz) Baill.) developed and validated. Standardization of extracts and aqueous recovery carried out.

Keywords: magnolia vine, HPLC, schizandrin, lignans, validation.

Введение

Лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turz) Baill.) - древесная вьющаяся лиана из семейства лимонниковых (Schisandraceae). В народной медицине лимонник широко используется как стимулирующее и тонизирующее средство.

Основными действующими компонентами лимонника китайского являются лигнаны, такие, как схизандрин, деоксисхизандрин, схизандрол B, деоксисхизандрин, гамма-схизандрин и ряд других. Углекислотные экстракты и спиртовые экстракты имеют подобный состав.

Цель работы - валидировать методику и провести сравнительное исследование содержания активных веществ в спиртовых, водных и углекислотных экстрактах семян лимонника китайского.

Материалы и методы

Материалом исследования являлись семена лимонника китайского, заготовленные в 2013 г, углекислотный экстракт семян лимонника китайского производства НИЦ ЭР «ГО-РО», Ростов на Дону.

Водные и спиртовые извлечения лимонника китайского готовили следующим образом: в пенициллиновые флаконы помещали по 0,5 г измельченных семян, прибавляли 5,0 мл воды или 70% этанола, укупоривали под обкатку, взвешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем флаконы охлаждали, взвешивали и если масса флакона оставалась неизменной, то надосадочную жидкость использовали для дальнейших исследований.

Стандартный раствор (100 мкг/мл): Около 5,0 мг стандартного образца схизандрина (Sigma, SML0054-50MG) помещали в мерную колбу объемом 5,0 мл и растворяли в метаноле. Объем раствора доводили до метки тем же растворителем и перемешивали. 1,0 мл полученного раствора переносили в мерную колбу объемом 10,0 мл и доводили до метки метанолом Р.

Испытуемый раствор CO2 экстракта: Около 50 мкл (~50 мг) углекислотного экстракта лимонника растворяют в метаноле Р и доводят объем раствора до 10,0 мл метанолом с водой (1:1).

Испытуемый раствор спиртового экстракта: Около 1 мл спиртового извлечения лимонника взвешивают на аналитических весах и разбавляют до 5,0 мл метанолом Р с водой (1:1).

Испытуемый раствор водного извлечения: используют водное извлечение без разбавления.

Полученные растворы хроматографировали на хроматографе Waters с детектором диодная матрица в следующих условиях: хроматографическая колонка Agilent Zorbax SB C18 (150 мм х 4,6 мм, 5 мкм); расход подвижной фазы 1 мл/мин; аналитическая длина волны 215 нм; объем вводимой пробы 10 мкл; температура колонки 25оС. Режим градиентного элюирования представлен в табл. 1. Использование этанола в качестве подвижной фазы позволяет разделять трудноразрешимые хроматографические пики некоторых лигнанов.

Таблица 1

Режим градиентного элюирования

Время, мин Вода Р, % (об) Ацетонитрил, Р% (об) 96% этанол, % (об) Режим

0-15,0 50 30 20 изократический

15,0-40,0 50—»30 30 20—40 градиентный

40,0-60,0 30—»50 30 40—20 градиентный

Содержание схизандрина (W, %) в СО2 и спиртовом экстрактах рассчитывали по формуле:

т„„ • k„„ • W„„ • £,„„

W =

ст ст

Содержание схизандрина %) в водном извлечении рассчитывали по формуле:

т • к • № • 5*

рр" _ ст ст_ст исп • где

5ст

тст - масса навески стандартного образца схизандрина, мг; к„ - коэффициент разбавления стандартного образца;

- массовая доля схизандрина в стандартном образце, %; ¡З^п - площадь хроматографического пика схизандрина на хроматограмме испытуемого раствора; 8ст - площадь хроматографического пика схизандрина на хроматограме раствора сравнения.

Результаты и обсуждение На рис. 1-3 приведены хроматограммы углекислотного экстракта, спиртового и водного извлечения из семян лимонника китайского. Время удерживание схизандрина составляет около 8 минут.

Рис. 1. Хроматограмма углекислотного экстракта лимонника китайского.

Рис. 2. Хроматограмма спиртового экстракта лимонника китайского.

Рис. 3. Хроматограмма водного извлечения лимонника китайского.

Методика количественного определения валидировалась по рекомендованным параметрам.

Оценку специфичности методики проводили по спектру и чистоте хроматографического пика схизандрина на хроматограммах стандартного и испытуемых растворов. На всех хро-матограммах время удерживания хроматографического пика схизандрина не отклонялось более, чем на 2% от времени удерживания основного пика на хроматограмме стандартного раствора. Спектральная чистота хроматографических пиков находилась в пределах критериев приемлемости (Purity Angle < Purity Threshold).

Для оценки промежуточной прецизионности исследовали в разные дни экстракты и водное извлечение лимонника китайского. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты валидации методики по параметру «прецизионность»

№ п/п Содержание схизандрина, % в

CO2 экстракте спиртовом экстракте водном извлечении

1. 4,033 0,128 0,051

2. 4,048 0,123 0,051

3. 4,035 0,127 0,052

4. 4,139 0,126 0,051

5. 4,171 0,122 0,052

6. 4,042 0,126 0,051

Среднее 4,078 0,125 0,051

RSD, % 1,5 1,7 1,0

Результаты находятся в пределах критериев приемлемости. Я^Б < 5,0%. Наименьший разброс результатов наблюдается при исследовании водного извлечения, т. к. его не требуется разбавлять, и процедура разбавления не вносит вклад в погрешность результатов анализа.

Оценку линейности методики проводили путем исследования модельных растворов схи-зандрина. Методику валидировали на диапазон определяемых концентраций 19,8787,3 мкг/мл. При использовании предложенных в методике разведений углекислотного и спиртового экстракта содержание схизандрина в полученных растворах попадает в указанный диапазон концентраций, несмотря на вариабельность содержания лигнанов в исходном лекарственном растительном сырье. Водные извлечения при этом разбавлять не требуется. Градуировочный график представлен на рис. 4.

Методика обладает удовлетворительной линейностью (Я2>0,99), свободный член граду-ировочного графика составляет 9,23% от величины аналитического сигнала.

Рис. 4. Градуировочный график.

Воспроизвести исследуемые матрицы не представляется возможным, поэтому оценить правильность методики по методу введено-найдено нельзя. Оценку правильности методики проводили по методу добавок. Для этого в колбу вместимостью 10 мл помещали навеску около 50 мг углекислотного, около 1,8 г (примерно 2 мл) спиртового экстрактов или около 5 г (примерно 5 мл) водного извлечения, добавляли по 0,5 и 2,5 мл раствора схизандрина (2,079 мг/мл) и разбавляли до метки смесью метанол Р - вода (1:1 об/об). Полученные растворы анализировали. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты валидации методики по параметру «правильность»

Анализируемый объект Введено схизандрина Добавка схизандрина, мкг/мл

с экстрактами, мкг/мл Введено Найдено ^ % гаю, %

Углекислотный экстракт 199,8 104,0 103,0 99,1 1,6

(4,078% схизандрина) 519,8 533,6 102,7 1,7

Спиртовой экстракт 228,1 104,0 105,2 101,2 1,6

(0,125% схизандрина) 519,8 532,5 102,5 1,4

Водное извлечение 255,0 104,0 102,7 98,8 2,1

(0,051% схизандрина) 519,8 508,6 97,9 1,4

Методика обладает удовлетворительной правильностью, открываемость (Я, %) находится в пределах 97,0-103,0%.

Испытуемые и стандартные растворы хранятся не менее 7 суток при температуре 0.. ,+5°С.

Заключение

Проведена стандартизация углекислотного и спиртового экстрактов и водного извлечения лимонника китайского с помощью валидированной методики. Содержание схизандрина в углекислотном, спиртовом экстракте и водном извлечении составляет 4,078%, 0,125% и 0,051% соответственно.

Полученные данные будут использованы при построении модели противовирусной активности экстрактов лимонника китайского.

Хроматографические профили исследуемых растворов показывают, что углекислотный экстракт лимонника китайского, кроме схизандрина, содержит значительное количество других лигнанов, что может отражаться на фармакологической активности углекислотного экстракта.

Работа поддержана грантом БРФФИ №М13М-086.

Список литературы

Кротова И. В., Ефремов А. А. Исследование химического состава плодов лимонника китайского // Химия растительного сырья. 1999. №. 4. С. 131-133.

Avula B., Choi Y-W., Srinivas P. V., Khan I. A. Quantitative Determination of Lignan Constituents from Schisandra chinensis by Liquid Chromatography // Chromatographia. 2005. Vol. 61. P. 515-518.

Halstead C. W., Lee S., Khoo C. S., Hennell J. R., Bensoussan A. Validation of a method for the simultaneous determination of four schisandra lignans in the raw herb and commercial dried aqueous extracts of Schisandra chinensis (Wu Wei Zi) by RP-LC with DAD // Journ. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2007. Vol. 45. P. 30-37.

Hu J., Mao C., Gong X., Lu T., Chen H., Huang Z., Cai B. Simultaneous determination of eleven characteristic lignans in Schisandra chinensis by high-performance liquid chromatography // Phcog. Mag. 2013. Vol. 9, I. 34. P. 155-161.

Huyke C., EngelK., Simon-Haarhaus B., Quirin K. W., Schempp C. M. Composition and biological activity of different extracts from Schisandra sphenanthera and Schisandra chinensis // Planta med. 2007. Vol. 73, I. 10. P. 1116-1126.

ICH Q2A: text on validation of analytical procedures. 1994. 7 p.

Ёршик Вячеслав Михайлович

к. фарм. н., доцент кафедры токсикологической и аналитической химии УО «Витебский государственный медицинский университет», Витебск E-mail: SlawaVGMU@mail.ru

Сведения об авторах

Yorshik VyacheslavMikhailovich

Ph. D. in Pharmaceutical science, Ass. Prof. of the Department o;f the Toxicological andAnalitical Chemistry Vitebsk State Medical University, Vitebsk E-mail: SlawaVGMU@mail.ru

Фадеев Василий Иванович

к. фарм. н., доцент кафедры стандартизации лекарственных средств УО «Витебский государственный медицинский университет», Витебск E-mail: Fadeev_v@tut.by

&adeee Bacuauu Heanoeuy

Ph. D. in Pharmaceutical science, Ass. Prof. of the Department oof the Standardization of drugs Vitebsk State Medical University, Vitebsk E-mail: Fadeev_v@tut.by

Петухова Анастасия Дмитриевна

Студентка фармацевтического ф-та УО «Витебский государственный медицинский университет», Витебск E-mail: SlawaVGMU@mail.ru

Петухова Анастасия Дмитриевна

Student of the Pharmaceutical Faculty Vitebsk State Medical University, Vitebsk E-mail: SlawaVGMU@mail.ru