CC BY
198
ПРЕПАРАТЫ
io Вакцина против геморрагической
£ лихорадки с почечным синдромом
и
Q)
Бархалева О.А.,1 Воробьева М.С.,1 Ладыженская И.П.,1 Ткаченко Е.А.,2 Дзагурова Т.К.2
U 1 ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России1, info@gisk.ru
•g 2 Учреждение Российской академии медицинских наук «Институт полиомиелита и вирусных
>в энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН», medvedkina@inbox.ru
g
! Vaccine against hemorrhagic fever
I with renal syndrome
О Barkhaleva O.A.1, Vorobieva M.S.1, Ladyzhenskaya I.P.1, Tkachenko E.A.2, Dzagurova T.K.2
1 Federal State Budgetary Institution «Tarasevich State Research Institute of Standardization and Control of Biological Medicines», Minzdravsocrazvitia RF, info@gisk.ru
2 «Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides» of the Russian Academy of Medical Sciences, medvedkina@inbox.ru
r - - -\
В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН разработана первая в России вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) «Комби-ГЛПС-Вак», которая в своем составе содержит антигены двух серотипов хантавирусов Пуумала и Добрава. «Комби-ГЛПС-Вак» — это бивалентная, цельновирионная, инактивированная, концентрированная, сорбированная вакцина. Субстратом для накопления хантавирусов является перевиваемая линия клеток Vero (культура клеток почек африканской зеленой мартышки). В ФГУН «ГИСКим. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация методов лабораторного исследования экспериментальных серий вакцины.
Библиографическое описание: Бархалева О.А., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. с соавт. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Биопрепараты. — 2011. — № 1. — С. 27-30.
In «Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides» of the Russian Academy of Medical Sciences there has been developed the first vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Russia. «Combo-HFRS-Vac» contains antigens of two hantavirus serotypes: Puumala and Dobrava. «Combo-HFRS-Vac» is a bivalent, univirion, inactivated, concentrated, sorbed vaccine. Vero finite cell line (green monkey kidney cells) serves a substrate for hantavirus accumulation. Laboratory studies methods validation of the vaccine experimental batches has been performed in Federal State Budgetary Institution «Tarasevich State Scientific Research Institute for Standardization and Quality Control of Biologicals».
Bibliographical entry: Barkhaleva O.A., Vorobieve M.S., Ladyzhenskaya I.P. et al. Vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome //Biopreparats (Biopharmaceuticals). — 2011. — № 1 — P. 27-30.
Для корреспонденции:
Воробьева М.С. — заведующая лаборатории арбовирусных инфекций, риккетсий и СПИДа ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ Адрес: ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ. 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, info@gisk.ru Статья поступила 21.10.2010 г, принята к печати 23.12.2010 г
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) распространена в различных районах земного шара. В мире ежегодно регистрируется около 200 тыс. случаев заболевания. По заболеваемости ГЛПС Россия стоит на втором месте после Китая. В нашей стране ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозов и одно из первых мест среди природных очаговых болезней человека. Наиболее высокие показатели ежегодной заболеваемости в Уральском, Приволжском и Центральном федеральном округах.
Возбудителем ГЛПС является вирус семейства Bunjaviridae (входит в состав рода Hantavirus). К настоящему времени известно около 30 генетически различ-
ных серотипов хантавирусов. На территории Российской Федерации установлена циркуляция четырех хантавирусных серотипов: Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава. Резервуаром вируса «Хантаан» на Дальнем Востоке является полевая мышь, в Европейской части Российской Федерации резервуаром вируса «Пуумала» является рыжая полевка. Человеку вирус передается чаще всего воздушно-капельным путем [1].
Наиболее эффективным и надежным методом профилактики ГЛПС является вакцинация населения, проживающего в районах, неблагополучных по геморрагической лихорадке. К настоящему времени вакцины против хантавирусов применяются для вакци-
нации населения в Южной Корее, Китае и Японии. Вакцины приготовлены на основе хантавируса сероти-па Хантаан, распространенного на Дальнем Востоке. Эти препараты не обладают защитным действием против хантавируса серотипов Пуумала и Добрава, распространены^ в Европейских регионах России. Цель данного исследования —изучение экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» на соответствие требованиям, предъявляемым к сорбированным инак-тивированным вирусным вакцинам.
Материалы и методы
«Комби-ГЛПС-Вак» — вакцина против ГЛПС бивалентная, культуральная, инактивированная формалином, концентрированная, очищенная, сорбированная. Вакцина содержит антигены двух серотипов хантави-русов Пуумала и Добрава; титр вакцинного антигена в ИФА не менее 1:128, стабилизатор — альбумин человека донорский не более 0,1 мг/мл, сорбент — алюминия гидроксид 1,0+0,5 мг/мл.
1.0. Метод определения специфической безопасности вакцины
Для изучения специфической безопасности вакцины использовали: тест-культуру Vero E6 (перевиваемая линия клеток почек африканской зеленой мартышки), которая наиболее чувствительна к хантавирусам Пуумала и Добрава. Проводили по три последовательных пассажа материала, приготовленного из смеси 5 ампул исследуемой серии вакцины, с инкубацией 7-8 сут при температуре инкубации тест-культуры. Для последующего потенциального выявления инфекционных фокусов (ФОЕ) вируса ГЛПС использовали метод ИФА, с применением конъюгата — протеин А, меченый пероксидазой хрена.
Выявление темно-серых пятен (инфекционных фокусов вируса ГЛПС) свидетельствовует о наличии не инактивированного вируса ГЛПС в вакцине. Согласно требованиям проекта НД испытуемая вакцина не должна содержать живого вируса ГЛПС — ФОЕ должны отсутствовать при просмотре тест-культуры.
2.0. Метод определения специфической активности вакцины против ГЛПС
2.1. Для определения титра хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине использовали метод ИФА. Все компоненты реакции ИФА готовили самостоятельно. Иммуносорбент получали следующим образом. На полистироловом планшете предварительно сорбировали:
ИГ+ (мышиные моноклональные антитела Н6, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Пуумала);
ИГ- (мышиные иммуноглобулины класса IgG, не содержащие антител к хантавирусам).
К+ (положительный контроль) — контрольный антиген, представляющий собой очищенный концентрат антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава, полученных на культуре клеток Vero E6.
Конъюгат — мышиные моноклональные антитела А4, специфичные к эпитопу нуклеокапсидного белка вируса Добрава, меченные пероксидазой хрена.
Результат учитывали при сравнении оптических плотностей в лунках, положительными считали те образцы, для которых показатель оптической плотности в лунке с ИГ+ превышал показатель оптической плотности в лунке с ИГ- в 2,1. Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в вакцине должен быть не менее 1:128.
2.2. Метод определения специфической активности (иммуногенности) вакцины «Комби-ГЛПС-Вак»
Для этой цели использовали:
Опытная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18-20 г, которых иммунизировали внутримышечно по 0,5 мл вакцины 3-кратно с интервалами 2 недели.
Контрольная группа — мыши линии Balb/С в количестве 8 голов массой 18-20 г, которым вводили суспензию алюминия гидроксида.
Взятие крови через 2 недели после 3-й иммунизации, с последующим приготовлением сывороток. Содержание антител в иммунных мышиных сыворотках определяли в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero E6 по снижению количества ФОЕ под воздействием специфических антител. Титр нейтрализующих антител к хантавирусам Пуумала и Добрава должен быть не менее 1:16.
3.0. Определение остаточной ДНК клеток Vero E6
Так как вакцина «Комби-ГЛПС-Вак» культуральная и субстратом для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава служит перевиваемая линия клеток Vero E6, был разработан и аттестован метод определения остаточной ДНК клеток Vero E6. Определение проводили методом ПЦР в реальном времени. В качестве контроля использовали препарат геномной ДНК клеток Vero E6. Содержание ДНК культуры клеток Vero в вакцине должно быть не более 10 нг/мл, что соответствует требованиям ВОЗ.
Помимо указанных выше тестов, лабораторные серии были изучены по всем показателям оценки качества вирусных инактивированных сорбированных вакцин: описание, бактериальная стерильность, время седиментационной устойчивости, размер частиц, извлекаемый объем, пирогенность, аномальная токсичность, бактериальные эндотоксины.
Результаты и обсуждение
Согласно требованиям ВОЗ (серия № 848 технических докладов, 1994) при создании вакцины против ГЛПС должны быть определены требования на стадиях изготовления: к культуре клеток, используемой для накопления вируса; к антигенной активности вируса и методам инактивации;стерильности.
К готовой вакцине предъявляются требования по следующим показателям: стерильность, безопасность, идентичность, содержание белка, специфическая активность, стабильность, пирогенность, бСа, безопасность, содержание адъюванта; маркировка; упаковка
Культура клеток Vero E6 (перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки) — субстрат для накопления хантавирусов Пуумала и Добрава, была исследована по всем показателям, предъявляемым ВОЗ к клеточным культурам (стерильность, туморогенность,
ПРЕПАРАТЫ
отсутствие посторонних вирусов и микоплазм), в том числе исследована на отсутствие цирковирусов свиней. На основании полученных результатов культура клеток Vero E6 была аттестована и разрешена для производства вакцины.
В ФГУН ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН получена мо-лекулярно-генетическая характеристика вакцинных штаммов вирусов Пуумала (ПУУ-ТКД/VERO) и Добрава (ДОБ-ЕАТ/VERO), адаптированных и прошедших пассирование в культуре клеток Vero E6 (10 и более пассажей), в сравнении с прототипными исходными штаммами Пуумала (ТКД/Уфа-97) и Добрава (ЕАТ/Липецк-06). В результате сравнительного анализа нуклеотидных по-
следовательностей и аминокислот S, М и L сегментов РНК штаммов вируса было установлено практически полное сходство вакцинного и исходного штаммов (всего 0,1-0,3% отличий), полные сиквенсы зарегистрированы в GenBank. Вакцинные штаммы ПУУ-ТКД, ГКВ № 1026, 12.2000 г. VERO и ДОБ-ЕАТ/VERO, ГКВ № 1027, 12.2000 г. депонированы в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.
При исследовании трех экспериментально-лабораторных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» по показателю специфическая безопасность инфекционных фокусов вирусов ГЛПС выявлено не было. Серии вакцины не содержат неи-нактивированного вируса.
Исследования экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» на соответствие требованиям, предъявляемым к сорбированным инактивированным вирусным вакцинам
Показатель Требования проекта НД Серия № 1 Серия № 2 Серия № 3
Описание Непрозрачная суспензия Соответствует Соответствует Соответствует
Подлинность По разделу «специфическая активность» Соответствует Соответствует Соответствует
Специфическая активность (титр АГ в ИФА) Не менее 1:128 1:512 1:512 1:512
рН От 7,4 до 7,8 7,68 7,69 7,68
Полнота сорбции АГ От 80 до 100% 99% 99% 99%
Бактериальные эндотоксины Пирогенность Не более 25 ЕЭ Должна быть апирогенна Менее 25 ЕЭ Апирогенна Менее 25 ЕЭ Апирогенна Менее 25 ЕЭ Апирогенна
Токсичность Должна быть не токсична Не токсична Не токсична Не токсична
Стерильность Должна быть стерильна Стерильна Стерильна Стерильна
Микоплазмы Не должна содержать микоплазм Не содержит Не содержит Не содержит
Формальдегид Не более 0,01 мг/доза Отсутствует Отсутствует Отсутствует
Алюминий От 1,0 до 1,5 мг/доза 1,13 мг/доза 1,07 мг/доза 1,06 мг/доза
Специфическая безопасность Не должна содержать живого вируса Не содержит Не содержит Не содержит
Специфическая активность Титр нейтрализующих АТ к хантавирусам в иммунных мышиных сыворотках д.б. не мене 1:16 1:16 1:16 1:16
БСА Не более 0,5 мкг/доза < 0,5 мкг/доза < 0,5 мкг/доза < 0,5 мкг/доза
Белок Не более 125 мкг/доза 23 мкг/доза 32,6 мкг/доза 43,8 мкг/доза
Остаточная ДНК Не более 10 нг/доза 0,195 нг/доза 0,195 нг/доза 0,169 нг/доза
Титр антигенов хантавирусов Пуумала и Добрава в 3 сериях вакцины составил 1:512.
Специфическая активность по титру вируснейтрали-зующих антител исследованных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» в реакции нейтрализации (РН) составила 1:16, т.е. соответствовал требованиям проекта НД. Содержание остаточной ДНК культуры клеток Vero E6 в сериях вакцины составило не более 0,195 нг/доза.
На основании исследования 3 экспериментальных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» показано соответствие
разработанной новой вакцины требованиям проекта НД (ФСП). Результаты приведены в таблице.
Вывод:
Проведенные исследования являются основанием для организации производства и выпуска экспериментально-производственных серий вакцины «Комби-ГЛПС-Вак» и решения вопроса о возможности клинических испытаний новой вакцины.
Литература:
1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. — Уфа, 2006. — С. 3-50.
2. Медуницын Н.В. Вакцинология. — М., 2010.
3. Ткаченко Е.А. и др. // Сб. тезисов Всероссийской конференции «Геморрагическая лихорадка с почечным
синдромом: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики». — Уфа, 2006. — С. 4-24.
4. WHO bank of VERO cells for the production of biological // WHO TRS, № 800. — Geneva, 1990.
