CC BY
31
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 57.044; 631.46 DOI 10.18522/0321-3005-2016-1-39-44
УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРОБОЦЕНОЗА ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО СЕВЕРОПРИАЗОВСКОГО К ЗАГРЯЗНЕНИЮ АНТИБИОТИКАМИ*
© 2016 г. Ю.В. Акименко, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников
Акименко Юлия Викторовна - ассистент, кафедра экологии и природопользования, Академия биологии и биотехнологий Южного федерального университета, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов-на-Дону, 344006, e-mail: akimenkojuliya@mail.ru
Казеев Камиль Шагидуллович - доктор географических наук, профессор, кафедра экологии и природопользования, Академия биологии и биотехнологий Южного федерального университета, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов-на-Дону, 344006.
Колесников Сергей Ильич - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, завкафедрой экологии и природопользования, Академия биологии и биотехнологий Южного федерального университета, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов-на-Дону, 344006, e-mail: kolesnikov@sfedu.ru
Akimenko Yuliya Viktorovna - Assistant, Ecology and Natural Management Department, Academy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, Russia, e-mail: akimenkojuliya@mail.ru
Kazeev Kamil Shagidullovich - Doctor of Geographical Science, Professor, Ecology and Natural Management Department Academy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, Russia.
Kolesnikov Sergei Il'ich - Doctor of Agricultural Science, Professor, Head of Ecology and Natural Management Department, Academy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal University, B. Sadovaya, St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, Russia, e-mail: kolesnikov@sfedu.ru
Установлено негативное воздействие антибиотиков и их сочетаний на микробоценоз чернозема обыкновенного североприазовского. Наблюдается прямая зависимость между содержанием антибиотиков в почве и степенью снижения численности микроорганизмов. Достоверное ингибирование численности микроорганизмов происходит при концентрации антибиотиков 100 мг/кг почвы. По степени устойчивости к антибиотикам исследованные группы микроорганизмов чернозема образовали следующий ряд: бактерии р. Azotobacter > микромицеты > амилолитические бактерии > аммонифицирующие бактерии.
Ключевые слова: антибиотики, загрязнение, микроорганизмы, устойчивость, чернозем обыкновенный.
It was found a negative effect of antibiotics and their combinations on the chernozem ordinary. There is a direct correlation between the content of antibiotics in the soil and the degree of reduction in the number of microorganisms. Significant inhibition occurs when the number of microorganisms antibiotic concentrations of 100 mg/kg soil. According to the degree of resistance to antibiotics the group studied microorganisms formed following series: p. Azotobacter> micromycetes> amylolytic bacteria> ammonifying bacteria.
Keywords: antibiotics, pollution, microorganisms, resistance, chernozem ordinary.
В почве происходят разнообразные химические превращения. Главную роль в этих процессах играют почвенные микроорганизмы, жизнедеятельность которых является хорошим диагностическим показателем плодородия почв и его изменения в результате воздействия разных антропогенных факторов.
В связи с интенсификацией использования антибиотиков в растениеводстве и животноводстве обостряется проблема загрязнения этими веществами и их производными почв агроценозов. На
сегодняшний день экотоксичность антибиотиков в окружающей среде не изучена [1, 2]. Устойчивость микроорганизмов к разным классам антибиотиков относится к числу наиболее острых проблем современности. По мере углубления знаний об антибиотиках стали накапливаться данные о неблагоприятных последствиях бесконтрольного применения этих препаратов [3].
В основном антибиотики попадают в почву благодаря применению навоза и сточных вод на сельскохозяйственных землях в качестве удобрения [4].
*Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (6.345.2014/К).
С каждым годом все чаще разные концентрации антибиотиков регистрируются в сточных водах, почвах, грунтовой и питьевой воде [5, 6]. Локально в почвах обнаруживаются антибиотики группы тетрациклинов в концентрациях 1-900 мг/кг, группы макролидов - 1^800 мг/кг [7].
Центральное ведомство по охране окружающей среды Германии исследовало масштаб применения антибиотиков в странах Евросоюза (ЕС). Оказалось, что основными потребителями антибиотиков являются отрасли животноводства. Одной из первых стран, выступивших с инициативой запрета использования антибиотиков в животноводстве, была Швеция, затем Швейцария, Нидерланды и ряд других европейских стран. В России же кормовые антибиотики не запрещены. В отношении тетрациклинов и сульфаниламидов в странах ЕС до сих пор нет никаких экологических стандартов. Множество попыток сегодня предпринимается с целью заполнить пробелы в научных знаниях о поведении и распространении антибиотиков в окружающей среде и в соответствии с этими знаниями внести изменения в законодательство [8].
Сейчас работников сельскохозяйственной сферы обвиняют в том, что антибиотики из сельхозугодий попадают в окружающие водоемы. Муниципальные системы очистки воды не в состоянии их отфильтровывать. Поэтому сейчас очень важно изучить, как такое загрязнение влияет на состояние экосистем и почвенного покрова в частности.
Цель настоящего исследования - оценка устойчивости микробоценоза чернозема обыкновенного североприазовского к загрязнению антибиотиками.
Объектом исследования являлся чернозем обыкновенный южноевропейской фации. Отбор почвы для лабораторных модельных исследований производили из пахотного слоя (0-25 см) в Ботаническом саду Южного федерального университета (г. Ростов н/Д). Черноземы обыкновенные южноевропейской фации (североприазовские) на территории сада являются преобладающими почвами.
В качестве токсикантов были выбраны антибиотики, широко использующиеся в медицине и сельском хозяйстве. Воздушно-сухие образцы почвы обрабатывали растворами медицинского антибиотика - бензилпенициллина, ветеринарного -фармазина и их смесью с фунгицидным антибиотиком нистатином в широком диапазоне концентраций 1^1000 мг/кг почвы. Биологические свойства изучали на 10, 60, 120-е сут инкубации. Использованные концентрации были выбраны по литературным данным, согласно остаточным количествам антибиотиков в окружающей среде [9].
Далее изучали воздействие медицинских (ампициллина, стрептомицина) и ветеринарных антибиотиков (тилозина, тромексина, ализерила и их смесей с фунгицидом инпут) в концентрации 500 мг/кг почвы, которая была выбрана по результатам ранее проведенных рекогносцировочных опытов [10, 11]. Исследования биологических показателей проводили на 3, 30 и 90-е сут инкубации. Все образцы почв инкубировали при температуре 20^25 °С и оптимальном увлажнении (60 % от полевой влагоемкости). Контролем служила почва, не загрязненная антибиотиком.
Лабораторно-аналитические работы выполнены с использованием методов, общепринятых в экологии и биологии почв [12]. Комплексное исследование микробоценоза чернозема включало определение численности микроорганизмов методом глубинного посева соответствующих разведений на плотные питательные среды: аммонифицирующих бактерий - на МПА, амилолитических - на КАА, микромицетов - на подкисленной среде Чапека, бактерий р. Azotobacter - на среде Эшби (метод комочков обрастания). Общую численность бактерий определяли методом люминесцентной микроскопии с окрашиванием проб акридиновым оранжевым. Проводили подсчет светящихся зеленым цветом клеток бактерий на инвертированном микроскопе фирмы ZEISS модель AXIO Vert. A1 со светофильтром 450^490 нм. При подсчете клеток просматривали по 20 полей зрения для каждого предметного стекла.
Внесение антибиотиков в почву приводило к изменению численности основных групп почвенных микроорганизмов, которые отличались по их устойчивости к вносимым антибиотикам (рис. 1). Из диапазона выбранных концентраций 1^1000 мг/кг минимальный статистически достоверный эффект ин-гибирующего воздействия антибиотиков наблюдался при концентрации 100 мг/кг почвы. В большинстве случаев обнаружилась прямая зависимость между содержанием антибиотиков в почве и степенью снижения численности микроорганизмов (r = -0,68-0,86). Максимальное ингибирующее действие антибиотиков проявляется в первые 10 сут с момента загрязнения. На последующих сроках исследования наблюдается тенденция восстановления численности микроорганизмов. Аммонифицирующие бактерии оказались более чувствительными к вносимым антибиотиками в отличие от амилолитических бактерий и микромицетов. Иммонифицирующие бактерии проявляют высокую чувствительность и к другим видам загрязнения [13].
300 мг/кг
450 мг/кг
600 мг/кг
□ фармазин В фармазин+нистатин
бензилпенициллин бензилпенициллин+нистатин
120 100
100 мг/кг 300 мг/кг
фармазин
фармазин+нистатин
600 мг/кг
бензилпенициллин и бензилпеницил-
100 мг/кг
300 мг/кг
450 мг/кг
600 мг/кг
□ фармазин ® фармазин+нистатин
Ш бензилпенициллин ES бензилпенициллин+нистатин
Рис. 1. Изменение численности основных групп микроорганизмов чернозема при загрязнении антибиотиками: а - аммонифицирующих бактерий; б - амилолитических бактерий; в - микромицетов, % от контроля
Бактерии р. Azotobacter оказались менее чувствительными к вносимым веществам (рис. 2). Изменение обилия бактерий наблюдали лишь на 10-е сут инкубации в опыте с антибиотиками (снижение на 10 % от контроля при воздействии фармазина; на 20 % - смеси фармазин + нистатин); на 3-и сут в опыте со смесями антибиотиков и фунгицида (снижение на 30^40 % от контроля при воздействии ампициллина и стрептомицина соответственно; на 50-60 % - смеси ампициллин+инпут и стрептоми-цин+инпут соответственно). На дальнейших сроках исследования не наблюдали изменений обилия данного рода бактерий. При этом азотфиксирующие бактерии были чувствительнее к загрязнению тяжелыми металлами, нефтью, ионизирующему излучению, чем другие группы бактерий [14, 15].
120
Контр ОЛЬ
О 20
ампициллин тромексин
стрептомицин+инпут
40 60
Сроки инкубации, сут стрептомицин ализерил тилозин+инпут
80 100 тилозин
ампициллин+инпут инпут
Рис. 2. Изменение обилия бактерий р. Azotobacter при загрязнении чернозема антибиотиками
и их комплексами с фунгицидом
Методом люминесцентной микроскопии уста- рий в контрольном образце чернозема составляет новили (таблица), что общее количество бакте- 11,4 млрд/г почвы. Согласно шкале для оценки
б
степени обогащенности почв микроорганизмами (люминесцентно -микроскопический метод) (по Звягинцеву, 1978), чернозем Ботанического сада относится к очень богатой по степени обогащенности почве (> 10 млрд/г). При загрязнении чернозема антибиотиком тилозином наблюдается снижение общей численности бактерий. Между концентрацией антибиотика и численностью бактерий наблюдается тесная обратная корреляция (г = -0,85). Наибольшее снижение общей численности бактерий происходит в первые 10 сут с момента загрязнения. Согласно шкале для оценки степени обогащенности почв микроорганизмами
(по Звягинцеву, 1978), в первые 10 сут с момента загрязнения степень обогащенности почвы изменяется до среднеобогащенной. На дальнейших сроках наблюдается тенденция восстановления общей численности бактерий. Но, несмотря на наблюдаемую тенденцию, и на 120-е сут после загрязнения снижение численности бактерий составляет 23 % от контроля (концентрация 1000 мг/кг) (р<0,01). Таким образом, при загрязнении чернозема тилозином наблюдается изменение степени обогащенности микроорганизмами: очень богатая (10 сут) > среднеобогащенная (60 сут) > богатая (120 сут).
Динамика изменения общей численности бактерий чернозема при загрязнении антибиотиком тилозином, млрд/г
10-е сут
Контроль Концентрация, мг/кг
10 100 1000
M+m 11,40+0,01 10,1+0,08 6,60+0,22** 3,90+0,05**
s 0,02 0,30 0,90 0,20
CV, % 0,31 3,38 13,46 0,21
% от контроля 89 58 35
60-е сут
M+m 11,72+0,14 10,59+0,11 8,63+0,17* 6,63+0,13**
s 0,50 0,40 0,70 0,50
CV, % 4,65 4,01 8,03 8,11
% от контроля 90 74 57
120-е сут
M+m 11,89+0,04 11,02+0,05 9,60+0,07* 9,12+0,12**
s 0,20 0,20 0,30 0,50
CV, % 1,31 1,67 2,95 5,12
% от контроля 93 81 77
Примечание. M±m - среднее + среднего; 5 - стандартное отклонение; ^ - коэффициент вариации, %. Достоверные отличия по отношению к контролю: * - p<0,05; ** - р<0,01.
Следует отметить, что окрашивание красителем акридиновым оранжевым позволяет определить лишь общую численность бактерий в почвенном образце, но не физиологическое состояние клеток. Для более подробного анализа микробного сообщества требуется окрашивание двухкомпонентным флуоресцентным красителем (LIVE/DEAD). Его применение позволит определить как общую численность бактерий, так и физиологическое состояние клеток. Таким образом, применение подобного красителя позволит более точно определить общую численность интактных «живых» клеток в почвенном образце, способных выполнять те или иные функции в почве.
Выводы
1. Установлено негативное воздействие антибиотиков и их сочетаний на микробоценоз чернозема обыкновенного североприазовского. Наблюдается прямая зависимость между содержанием антибиотиков в почве и степенью снижения численности микроорганизмов.
2. Степень влияния антибиотиков определяется их природой, концентрацией и сроками воздействия. Достоверное ингибирование численности микроорганизмов происходит при концентрации антибиотиков 100 мг/кг почвы.
3. Максимальное воздействие антибиотиков проявляется в первые 10 сут с момента загрязнения чернозема. После наблюдается тенденция к восстановлению численности почвенных микроорганизмов.
4. По степени устойчивости к антибиотикам исследованные группы микроорганизмов чернозема образовали следующий ряд: бактерии р. Azotobacter > > микромицеты > амилолитические бактерии > аммонифицирующие бактерии.
5. Динамика восстановления численности микроорганизмов носит нелинейный характер.
Литература
1. Radjenovic' J., Petrovic' M., Barcelo D. Fate and distribu-
tion of pharmaceuticals in wastewater and sewage sludge of the conventional activated sludge (CAS) and advanced membrane bioreactor (MBR) treatment // Water Res. 2009. Vol. 43. Р. 831-841.
2. Du L.F., Liu W.K. Occurrence, fate, and ecotoxicity of anti-
biotics in agro-ecosystems. A review // Agron. Sustain. Dev. 2012. Vol. 32. P. 309-327.
3. Черкашина Н.В., Дроздова Л.И., Махортов В.Л., Васильев П.Г., Щербаков М.Г., Демина Л.В., Ильязов А.А., СирикМ.С. Анализ современного состояния проблемы использования антибиотиков в качестве кормовой добавки // Аграрный вестник Урала. 2011. № 3 (82). С. 39-43.
4. Kemper N. Veterinary antibiotics in the aquatic and terres-
trial environment a review // Ecological Indicators. 2008. № 8. P. 1-13.
5. Zhou L.-J., Ying G.-G., Zhao J.-L., Yang J.-F., Wang L.,
Yang B. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hoi River and Liao River in northern China // Environ. Pollut. 2011. Vol. 159. P. 1877.
6. Yang J.-F., Ying G.-G., Zhao J.-L., Tao R., Su H.-C., Liu Y.-S.
Spatial and seasonal distribution of selected antibiotics in surface waters of the Pearl Rivers, China // Environ. Sci. Health. 2011. Vol. 46. P. 272.
7. Höper H., Kues J., Nau H., Hamscher G. Eintrag und Ber-
bleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Boden // Bodenschutz. 2002. Vol. 4. Р. 141-148.
8. World Health Organization (2014). Antimicrobial Re-
sistance: Global Report on Surveillance 2014, WHO.
9. Sun P., Cabrera M.L., Huang C.-H., Pavlostathis S.G. Bio-
degradation of veterinary ionophore antibiotics in broiler litter and soil microcosms. // Environ. Sci. Technol. 2014. Vol. 48. P. 2724-2731.
10. Акименко Ю.В. Влияние фармацевтических антибиоти-
ков на динамику численности почвенных микроорганизмов // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Естеств. науки. 2014. № 5 (183). С. 63-68.
11. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Изменение
биохимических свойств чернозема обыкновенного при загрязнении биоцидами // Агрохимия. 2015. № 3. С. 81-87.
12. Казеев К.Ш., Колесников С.И. Биодиагностика почв:
методология и методы исследований. Ростов н/Д., 2012. 380 с.
13. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Влияние
разных способов стерилизации на биологические свойства чернозема обыкновенного // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6. С. 721.
14. Kolesnikov S.I., ZharkovaM.G., Kazeev K.S., Kutuzova I.V.,
Samokhvalova L.S., Naleta E.V., Zubkov D.A. Ecotoxicity assessment of heavy metals and crude oil based on biological characteristics of chernozem // Russian J. of Ecology. 2014. Vol. 45, № 3. P. 157-166.
15. Denisova T.V., Kazeev K.Sh. Sensitivity of some groups of
ordinary chernozem soil microorganisms to у irradiation // Russian J. of Ecology. 2008. Vol. 39, № 2. P. 99-104.
References
1. Radjenovic' J., Petrovic' M., Barcelo D. Fate and distribu-
tion of pharmaceuticals in wastewater and sewage sludge of the conventional activated sludge (CAS) and advanced membrane bioreactor (MBR) treatment. Water Res., 2009, vol. 43, pp. 831-841.
2. Du L.F., Liu W.K. Occurrence, fate, and ecotoxicity of anti-
biotics in agro-ecosystems. A review. Agron. Sustain. Dev., 2012, vol. 32, pp. 309-327.
3. Cherkashina N.V., Drozdova L.I., Makhortov V.L., Vasil'ev
P.G., Shcherbakov M.G., Demina L.V., Il'yazov A.A., Sirik M.S. Analiz sovremennogo sostoyaniya problemy ispol'zovaniya antibiotikov v kachestve kormovoi dobavki [Analysis of the current state of the problem of the use of antibiotics as a feed additive]. Agrarnyi vestnik Urala, 2011, no 3 (82), pp. 39-43.
4. Kemper N. Veterinary antibiotics in the aquatic and terres-
trial environment a review. Ecological Indicators, 2008, no 8, pp. 1-13.
5. Zhou L.-J., Ying G.-G., Zhao J.-L., Yang J.-F., Wang L.,
Yang B. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hoi River and Liao River in northern China. Environ. Pollut., 2011, vol. 159, p. 1877.
6. Yang J.-F., Ying G.-G., Zhao J.-L., Tao R., Su H.-C., Liu
Y.-S. Spatial and seasonal distribution of selected antibiotics in surface waters of the Pearl Rivers, China. Environ. Sci. Health, 2011, vol. 46, p. 272.
7. Hoper H., Kues J., Nau H., Hamscher G. Eintrag und Ber-
bleib von Tierarzneimittelwirkstoffen in Boden. Bodenschutz., 2002, vol. 4, S. 141-148.
8. World Health Organization (2014) Antimicrobial Re-
sistance: Global Report on Surveillance 2014, WHO.
9. Sun P., Cabrera M.L., Huang C.-H., Pavlostathis S.G. Bio-
degradation of veterinary ionophore antibiotics in broiler litter and soil microcosms. Environ. Sci. Technol., 2014, vol. 48, pp. 2724-2731.
10. Akimenko Yu.V. Vliyanie farmatsevticheskikh antibiotikov
na dinamiku chislennosti pochvennykh mikroorganizmov [Influence of pharmaceutical antibiotics on the population dynamics of soil microorganisms]. Izv. vuzov. Sev.-Kavk. region. Estestv. nauki, 2014, № 5 (183), pp. 63-68.
11. Akimenko Yu.V., Kazeev K.Sh., Kolesnikov S.I. Izmenenie
biokhimicheskikh svoistv chernozema obyknovennogo pri zagryaznenii biotsidami [Change of biochemical properties of the chernozem ordinary at pollution by biocides]. Agrokhimiya, 2015, no 3, pp. 81-87.
12. Kazeev K.Sh., Kolesnikov S.I. Biodiagnostika pochv:
metodologiya i metody issledovanii [Soil biodiagnostics:
methodology and research methods]. Rostov-on-Don, 2012, 380 p.
13. Akimenko Yu.V., Kazeev K.Sh., Kolesnikov S.I. Vliyanie raznykh sposobov sterilizatsii na biologicheskie svoistva chernozema obyknovennogo [Influence of different ways of sterilization on biological properties of the chernozem ordinary]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya, 2013, no 6, p. 721.
Поступила в редакцию
14. Kolesnikov S.I., Zharkova M.G., Kazeev K.S., Kutuzova
I.V., Samokhvalova L.S., Naleta E.V., Zubkov D.A. Eco-toxicity assessment of heavy metals and crude oil based on biological characteristics of chernozem. Russian J. of Ecology, 2014, vol. 45, no 3, pp. 157-166.
15. Denisova T.V., Kazeev K.Sh. Sensitivity of some groups of
ordinary chernozem soil microorganisms to y irradiation. Russian J. of Ecology, 2008, vol. 39, no 2, pp. 99-104.
3 февраля 2016 г.
