CC BY
75
Experimental articles
УДК 579.015.2
_ «_* ___ _ __
устойчивость азотфиксирующих бактерий карстовых полостей к экстремальным факторам
1Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев Национальный университет «Киево-Могилянская академия», Украина
3Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Украина
E-mail: olga.suslova11@gmail.com
Получено 22.07.2014
Целью работы было установление количественных показателей устойчивости исследованных бактерий к экстремальным факторам — токсичным металлам (Cu2+), органическим ксенобиотикам (н-нитрохлорбензол) и УФ-облучению. Протестированы шесть штаммов азотфиксирующих бактерий, выделенных из образцов глин двух карстовых полостей — Мушкарова Яма (Подолье, Украина) и Куйбышевская (Западный Кавказ, Абхазия), а также референтный штамм Azotobacter vinelandii УКМ В-6017. Для этого определяли максимально допустимые концентрации Cu2+ и н-нитрохлорбензола в концентрационном градиенте и летальные дозы УФ по кривым выживаемости. Максимально допустимые концентрации для штаммов: 10 мг/л Cu, 70-120 мг/л n-нитрохлорбензола. Максимальные дозы УФ варьируют в диапазоне 55-85 Дж/м2 (ЛД99 99). Установлено, что по показателям устойчивости к трем классам экстремальных факторов выделенные штаммы карстовых полостей схожи со штаммом наземных почвенных экосистем. Наиболее активные исследуемые штаммы снижают концентрацию н-нитрохлорбензола в среде в 13 раз. Явление деструкции n-нитрохлорбензола азотфиксирующими бактериями может быть использовано для создания новых природоохранных биотехнологий для очистки промышленных сточных вод от нитрохлорароматических ксенобиотиков. Выделенные штаммы могут быть применены в качестве деструкторов ксенобиотиков для биоремедиации почв в агробиотехнологиях, а также для оптимизации азотного питания растений наземных экосистем.
А. Б. Таширев1 О. С. Суслова1 П. В. Рокитко1 А. А. Олексенко2 К. М. Бондарь3
Ключевые слова: карстовые полости, азотфиксирующие бактерии, природоохранные биотехнологии.
Карстовые полости характеризуются полным отсутствием света и стабильностью физико-химических условий на протяжении сотен лет (постоянная температура, высокая влажность, низкая концентрация органических соединений). Эти экосистемы изолированы от таких экстремальных факторов, как электромагнитное излучение (УФ, у-радиация), а также неорганических и органических ксенобиотиков, которые адсорбируются на входе в карстовые полости мощными отложениями глин [1].
Еще в 2001 г. Northup показал, что в глинах карстовых полостей присутствуют группы микроорганизмов цикла азота [2]. Особый интерес представляют азотфиксирующие бактерии. Они трансформируют молекулярный азот в органический и способствуют его накоплению в глинах карстовых полостей.
Таким образом, азотфиксирующие бактерии подготавливают условия для последующего заселения глин карстовых полостей микробными сообществами.
Известно, что аэробные азотфикси-рующие бактерии по сравнению с другими группами цикла азота являются самыми уязвимыми к действию экстремальных факторов — токсичных металлов, органических ксенобиотиков, УФ-излучения. Поскольку азотфиксирующие микроорганизмы являются «пионерами» заселения экстремальных систем, необходимо определить количественные параметры гомеостаза (способность сохранять стабильность функционирования при воздействии экстремальных факторов) этих микроорганизмов в условиях экстремальных факторов, т. е. способность расти и функционировать при
43
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
воздействии этих факторов. Целью работы было определение количественных показателей устойчивости штаммов азотфик-сирующих бактерий, выделенных из глин карстовых полостей Мушкарова Яма и Куйбышевская, к трем классам экстремальных факторов — электромагнитному излучению (УФ), неорганическим (токсичный металл Cu2+) и органическим ксенобиотикам (п-нитрохлорбензол — НХБ).
Материалы и методы
Объектами исследования были изолированные из образцов глины карстовых полостей шесть штаммов азотфиксирующих бактерий. Один образец глины был отобран в максимально удаленной от входа точке лабиринтовой пещеры Мушкарова Яма, заложенной в гипсах неогенового возраста на Подолье Украины. Другой — в донном зале вертикальной полости Куйбышевская, образованной в юрских известняках Западного Кавказа (Абхазия), на глубине 1 км от входа. После отбора образцы хранили в холодильнике при 4 °С в герметично закрытых полиэтиленовоых пакетах. Для последующего учета количества клеток в 1 г абсолютно сухой глины определяли коэффициент влажности глины. Референтным штаммом служил Azotobacter vinelandii УКМ В-6017.
Азотфиксирующие бактерии выделяли на жидкой и агаризованной среде Эшби [3]. Состав среды, г/л: К2НРО4 — 0,2; MgS04 — 0,2; NaCl — 0,2; K2S04 — 0,1; СаСО3 — 5,0; раствор микроэлементов по Федорову — 1 мл; рН среды — 7,2-7,4. Источник углерода (сахароза) вносили как в «копиокон-центрации» — 20 г/л (8,4 г С/л), так и в «олигоконцентрации» —0,02г/л(0,084гС/л). По данным литературы, при копиокарбо-трофных условиях концентрация углерода в среде составляет не менее 0,5 г/л, а при оли-гокарботрофных — не более 0,09 г/л [4]. Для приготовления среды использовали стерильную водопроводную воду, которую предварительно кипятили (15 мин), охлаждали и фильтровали через ватный фильтр.
Для доказательства принадлежности выделенных штаммов к азотфиксирующим бактериям их трижды последовательно пересевали в жидкую среду Эшби (единственный источник азота — атмосферный азот). Колонии, выросшие после третьего пересева, рассевали на агаризованную среду для проверки чистоты культуры с получением единичных колоний.
Способность штаммов фиксировать молекулярный азот определяли высевом культур в жидкую среду (100 мл) во флаконы (500 мл) с герметичным затвором. В закрытых инокулированных флаконах создавали избыточное давление воздуха во избежание разряжения атмосферы при потреблении кислорода штаммами. Избыточное давление создавали, вводя шприцем стерильный воздух (100 мл). Далее культуры выращивали на качалке (145 об/мин, 7 сут) и ежедневно определяли количественный состав газовой фазы (O2, N2, CO2) по стандартной методике по теплопроводности катарометра на газовом хроматографе ЛХМ-8-МД [3]. Использовали две стальные колонки — одна (І) для анализа Н2, О2, N2 и СН4, другая (ІІ) — для СО2. Параметры колонок: І — l = 3 м, d = 3 мм, сорбент 13Х (NaX); ІІ — l = 2 м, d = 3 мм, сорбент Porapak-Q. Температура колонок — 60 °С, испарителя — 75 °С, детектора — 60 °С; ток детектора — 50 мА. Газ-носитель — аргон; скорость подачи газа — 30 мл/мин. Содержание газов О2, N2 и СО2 (%) рассчитывали по площади их пиков, которые регистрировались самописцем полярографа.
Устойчивость к Cu2+ определяли на агаризованной среде Эшби в концентрационном диапазоне 10-50 мг/л Cu2+ с шагом 10 мг/л. Для этого в расплавленную и охлажденную до 50 °С среду вносили соответствующую аликвоту раствора хлорида Cu2+ (исходная концентрация 20 г/л Си2+). Среду с медью разливали в чашки Петри и выдерживали 2 сут при 22 °С для проверки стерильности. В качестве контроля роста штаммов использовали среду без Cu2+.
Устойчивость к НХБ. В расплавленную и охлажденную до 50 °С агаризованную среду вносили спиртовой раствор НХБ (исходная концентрация 10 мг/мл) для получения концентрационного ряда 25-100 мг/л НХБ с шагом 25 мг/л. Среду с НХБ разливали в чашки Петри и выдерживали 2 сут для проверки стерильности.
Биомассу штаммов, выросших на агаризованной среде, суспендировали в стерильном физиологическом растворе до появления слабоопалесцирующей суспензии. Затем из этой суспензии в подготовленные чашки высевали штрихом микробные суспензии культур. Рост по штриху в присутствии Cu2+ или НХБ свидетельствовал об устойчивости культур к данным концентрациям ксенобиотика.
Устойчивость к УФ-облучению определяли по способности штаммов к росту после облучения (дальний ультрафиолет, X = 100-
44
Experimental articles
280 нм). Для этого последовательные десятикратные разведения микробных суспензий (0,1 мл, 10-2-10-8) высевали на предварительно подсушенную поверхность среды и облучали дозами УФ в диапазоне 20-200 Дж/м2. Облученные чашки и контрольные (без облучения) культивировали при 25 °С в течение 3-6 сут в зависимости от длительности лаг-фазы роста штамма. Устойчивость азотфиксирующих бактерий к облучению оценивали по процентному содержанию выживших после указанных доз клеток. На дозовых кривых выживания, представляющих собой зависимость количества выживших клеток от доз УФ, вычисляли ЛД90 и ЛД99,99 — дозы УФ, при которых погибает 90% и 99,99% клеток, соответственно.
Все исследования проводили в трехкратной повторяемости. Статистический анализ экспериментальных данных осуществляли с помощью программы Excel, уровень достоверности Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В глинах исследуемых карстовых полостей на протяжении сотен лет сохраняются полностью афотические условия. Также эти экосистемы не загрязнены токсичными металлами. Например, концентрация Cu2+ — не выше 0,25 мг/м3 глины [1].
Из образцов глин горизонтальной (Муш-карова Яма) и вертикальной (Куйбышевская) карстовых полостей выделены шесть штаммов азотфиксирующих бактерий. Штаммы образуют непигментированные или слабо пигментированные круглые колонии; подавляющее большинство — слизистые, выпуклые, блестящие. Морфология клеток большинства изолятов — палочки, некоторые образуют слизистые капсулы. Один изолят (N6) — диплококки (табл. 1).
Все исследуемые штаммы чувствительны к УФ-излучению, что согласуется с данными литературы [5]. Показатель ЛД90 варьировал в диапазоне 20-35 Дж/м2, а ЛД99 99 — 55-85 Дж/м2 (рис. 1; табл. 2).
Таблица 1. Морфологическая характеристика штаммов азотфиксирующих бактерий
карстовых полостей
Штамм Морфология колоний Условия Морфология клеток
N1 Круглые, d1 = 0,01-1,5 мм, край тонкий неровный широкий полупрозрачный белый, центр плотный непрозрачный розовато-беловатый; плоские, сухие, врастают в агар Копиокарботрофные Г+ палочки 0,65x1,45 дм, слегка изогнутые, располагаются одиночно, иногда в коротких цепочках
N2 Круглые, d = 0,2-2 мм, край ровный; полупрозрачные, бесцветные, слизистые Олигокарботрофные Г+ палочки 0,9x1,7 дм, в больших слизистых капсулах
N6 Круглые, слегка растекающиеся, d = 0,5-3 мм, край четкий, ровный; слизистые, полупрозрачные, слегка выпуклые Копио-, олигокарботрофные Г+ кокки, одиночные и диплококки
N7 Круглые, d = 2-4 мм, край ровный, серо-белые, непрозрачные, блестящие, выпуклые; старые колонии слегка розоватые Копио-, олигокарботрофные Г+ короткие палочки 0,9x1,7 дм, с закругленными концами
N8 Круглые, d = 1-4 мм, край ровный; бледно-белые, полупрозрачные, сильновыпуклые, блестящие Копио-, олигокарботрофные Г+ палочки 1,02x1,85 дм, слегка изогнутые
N10 Круглые, d = 1,5-4,0 мм, край ровный; прозрачные, блестящие, сильновыпуклые Копио-, олигокарботрофные Г+ короткие палочки 0,8x1,65 дм в слизистых капсулах
Примечания: 1d — диаметр колоний; 2 — данные атомно-адсорбционного анализа глин карстовых полостей, проведенного в Институте общей и неорганической химии НАН Украины.
45
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
Таблица 2. Устойчивость штаммов азотфиксирующих бактерий карстовых полостєй к ксенобиотикам
Штамм УФ, (ЛД9о), Дж/м2 УФ, (ЛД99,99), Дж/м ПДК, мг/л ПДК* НХБ, мг/л
копиокарботрофные условия олигокарботрофные условия
N1 20±3**** 70±2 < 10*** 100 100
N2 30±3 70±2 < 10 70 100
N6 35±5 85±5 < 10 100 120
N7 32±2 78±2 < 10 100 100
N8 20±3 65±2 < 10 100 100
N10 20±2 55±2 10 100 90
56** 10±2 60±2 < 10 100 100
Примечания: * — на агаризованной среде Эшби с сахарозой;
** — референтный штамм Azotobacter vinelandii УКМ В-6017; *** — при 10 мг/л Cu2+ рост отсутствовал;
ПДК — предельно допустимая концетрация;
**** — р < о,05 (для ЛД9о и ЛД99 99).
А — Мушкарова Яма, Б — Куйбышевская
Количественные параметры устойчивости (ЛД90 и ЛД99 99) исследуемых штаммов к УФ представлены на дозовых кривых (рис. 1).
По количественным показателям устойчивости к трем классам экстремальных факторов исследуемые штаммы карстовых полостей схожи с референтным штаммом Azotobacter vinelandii УКМ В-6017. Уровень устойчивости азотфиксирующих бактерий наземных экосистем и глин карстовых
полостей практически идентичен. Так, все исследуемые штаммы неустойчивы к воздействию Cu2+. Только для штамма N10 максимально допустимая концентрация Cu2+ составляла 10 мг/л. Такие результаты согласуются с данными литературы о высокой чувствительности азотфиксирующих бактерий к воздействию токсичных металлов [6]. Медь относится к металлам «комбинированного» действия, сочетая в себе одновременное негативное действие метал-
46
Experimental articles
лов-окислителей и металлов-заместителей. Токсичность Cu2+ как окислителя связана с его высоким редокс-потенциалом [7]. Катион Cu2+ также способен к замещению металлов в активных центрах энзимов энергетического метаболизма, что приводит к их инактивации и гибели микроорганизмов [8].
Штаммы оказались устойчивы к п-нитро-хлорбензолу (табл. 2). Он представляет собой персистентный синтетический нитрохлорароматический ксенобиотик. Его токсичность определяют ароматическое кольцо и присоединенные к нему нитрогруппа и хлор в параположении. Бактерицидная концентрация для большинства почвенных и водных хемоорганотрофных микроорганизмов — 10 мг/л [9]. Максимально допустимая концентрация НХБ для исследуемых штаммов колебалась в пределах 70-120 мг/л. Рост штаммов в концентрационном градиенте НХБ на агаризованной среде отмечали как в копиокарботрофных, так и в олигокар-ботрофных условиях. Концентрация органических соединений в среде существенно не влияла на устойчивость штаммов к НХБ (табл. 2). Предельно допустимая концентрация для штаммов N1, N7, N8 составляла 100 мг/л как в копио-, так и в олигокарбо-трофных условиях.
Ранее были получены данные по устойчивости микроорганизмов наземных экосистем (антарктические клифы, почвы пустыни Негев, черноземы заповедника Аскания-Нова, почвы вокруг Мертвого моря и т. д.) к экстремальным факторам. Было показано существование двух типов ответов на данное воздействие [2, 3]. Ответ первого типа, так называемый «коррелятивный», представляет собой ингибирование роста при повы-
шении концентрации ксенобиотика в исследуемом концентрационном диапазоне. При ответе второго типа в исследуемом концентрационном диапазоне ингибирование роста отсутствует. Аналогичные типы ответа были получены при культивировании штаммов азотфиксирующих бактерий в концентрационном градиенте НХБ (рис. 2).
На примере штамма N6 показан ответ первого типа, а на штамме N1 — второго. Однако в обоих случаях наблюдали снижение количества выживших клеток культур в присутствии органического ксенобиотика даже при его незначительной концентрации (30 мг/л). Таким образом, в границах исследуемого концентрационного диапазона штамм N6 более устойчив к НХБ по сравнению со штаммом N1, несмотря на то, что предельно допустимые концентрации НХБ у них одинаковы.
Проявление устойчивости к НХБ можно объяснить существованием защитных механизмов у азотфиксирующих бактерий, а также способностью взаимодействовать с ним. Известны две группы механизмов взаимодействия микроорганизмов с ароматическими соединениями: восстановительная деструкция и окисление. Так, ароматические соединения могут служить источниками углерода и энергии для азотфиксирующих бактерий [1]. Механизм восстановительной трансформации на примере азобензола был показан для азотфиксирующего штамма Ochrobactrum intermedium ANKI. Способность такой трансформации может быть связана с Мо-зависимой нитрогеназной активностью штамма [10].
Нами установлено, что исследуемые штаммы не только устойчивы к высоким концентрациям НХБ, но и взаимодействуют
Рис. 2. Типы ответа штаммами азотфиксирующих бактерий карстовых полостєй
на действие НХБ:
А — ответ первого типа, **г = -0,89, Р < 0,05;
Б — ответ второго типа, *г = -0,76, Р < 0,05
47
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 5, 2014
с ним, разрушая ароматическое кольцо. Об этом свидетельствует отсутствие поглощения в ультрафиолетовой области при 230 нм. Поглощение в этой области определяется наличием ненасыщенных связей в ароматическом кольце. Концентрация НХБ в среде снижалась в 2-13 раз в зависимости от штамма.
Способность азотфиксирующих штаммов использовать атмосферный азот и расти при малых концентрациях органических соединений в сочетании со способностью разрушать НХБ может быть использована для создания новых природоохранных биотехнологий для очистки промышленных сточных вод от органических ксенобиотиков.
Количественные параметры устойчивости к трем классам экстремальных факторов штаммов азотфиксирующих бактерий карстовых полостей сходны с параметрами для азотфиксирующих бактерий почвенных наземных экосистем. Исследуемые азот-фиксирующие бактерии чувствительны к действию УФ-облучения и неорганических ксенобиотиков, в частности Cu2+. Штаммы
references
1. Maltsev V. A., Korshunov V. V., Semikolen-nykh A. A. Cave chemolithotrophic soils. Proceedings of 12th Congress of Speleology. La-Chaux-de-Fonds. Switzerland. 1997, V. 1, P.29-32.
2. Northup D. E., Lavoie K. H. Geomicrobiology of caves. A review. Geomicrob. J. 2001, 18 (3), 199-220.
3. Netrusov A. I., Egorova M. A., Zaharchuk L. M., Kolotilova N. N. Practicum on Microbiology. Handbook. Moscow: AkademUa. 2005, 608 p. (In Russian).
4. Zavarzin G. A. Lectures on natural science of microbiology. Moscow: Nauka. 2003, 348 p. (In Russian).
5. Zap R. G., Callaghan T. V., Erickson D. J. Effects of enhanced solar ultraviolet radiation on biogeochemical cycles. J. Photochem. Photo-biol. B: Biology. 1998, V. 46, P. 69-82.
6. Dobrovol’skij V. V. Soils geography with bases of soil science. Moscow: Vlados. 2001, 246 p. (In Russian).
высокоустойчивы к органическому ксенобиотику НХБ в сверхвысоких концентрациях и взаимодействуют с ним, снижая его концентрацию в среде.
Принимая во внимание то, что азотфикси-рующие микроорганизмы являются ключевой группой цикла азота, а также их высокую устойчивость к НХБ, можно предположить возможность автобиоремедиации глин карстовых полостей микробными сообществами при загрязнении этих экосистем органическими ксенобиотиками. Возможно использование выделенных штаммов в качестве деструкторов ксенобиотиков для биоремедиации почв в агробиотехнологиях, а также для улучшения азотного питания растений наземных экосистем.
Выражаем благодарность группе спелеологов и лично Ольге Ткачевой (Украинская спелеологическая ассоциация) за сотрудничество и помощь в отборе образцов глин в карстовых полостях Мушкарова Яма и Куйбышевская.
7. Tashyrev O. B., Tashyreva G. O. Vojcic’kij V. M. Studying the impact of heavy metals on Antarctic soil-substrate microbial communities. V^NYK Kyiv nats. un-ty imeni Tarasa Shevchenka. 2004, N 42, P. 17-19. (In Ukrainian).
8. Tashyrev A. B., Romanovskaya V. A., Rokit-ko P. V., Tashyreva. Multiple resistance to toxic metals of Antarctic cliffs microorganisms (Galindez Island). Ukr. antarktychnyi zh. 2011-2012, N 11-12, P. 212-221. (In Russian).
9. Tashyrev O. B., Prekrasna Ie. P., Tashyreva G. O. Method of thermodynamic prognosis for new environmental biotechnologies development.
J. Int. Sci. Publ.: Agriculture&Food. 2013, 1 (2), 92-110.
10. Vakerov-Kouzona N. D. Nitrogen-fixing bacteria Ochrobactrum intermedium ANKI transformed azobenzene. Prikladnaia biohimiia i mikrobiologiia. 2007, V. 43, P. 450-454. (In Russian).
48
Experimental articles
стійкість азотфіксуючих бактерій карстових порожнин до екстремальних факторів
О. Б. Таширев1 О. С. Суслова1,
П. В. Рокитко1 Г. О. Олексенко2
К. М. Бондарь3
інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ Національний університет «Києво-Могилянська академія», Україна 3Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна
E-mail: olga.suslova11@gmail.com
Метою роботи було встановлення кількісних показників стійкості досліджених бактерій до екстремальних факторів — токсичних металів (Cu2+), органічних ксенобіотиків (л-ні-трохлорбензол) та УФ-опромінення. Протесто-вано шість штамів азотфіксуючих бактерій, що їх було виділено зі зразків глин двох карстових порожнин — Мушкарова Яма (Поділля, Україна) та Куйбишевська (Західний Кавказ, Абхазія), а також референтний штам Azotobacter vinelandii УКМ В-6017. Для цього визначали максимально допустимі концентрації Cu2+ та л-нітрохлорбензолу в концентраційному градієнті й летальні дози УФ за кривими виживаності. Максимально припустимі концентрації для штамів: 10 мг/л Cu2+, 70-120 мг/л л-нітро-хлорбензолу. Максимальні дози УФ варіюють у діапазоні 55-85 Дж/м2 (ЛД99,99). Показано, що за показниками стійкості до трьох класів екстремальних факторів виділені штами карстових порожнин подібні до штаму наземних ґрунтових екосистем. Найбільш активні досліджувані штами здатні знижувати концентрацію л-нітрохлорбензолу в середовищі в 13 разів. Явище деструкції л-нітрохлорбен-золу азотфіксуючими бактеріями може бути використано для створення нових природоохоронних біотехнологій для очищення промислових стічних вод від нітрохлорароматичних ксенобіотиків. Виділені штами можуть бути застосовані як деструктори для біоремедіа-ції ґрунтів в агробіотехнологіях, а також для оптимізації азотного живлення рослин наземних екосистем.
Ключові слова: карстові порожнини, азотфіксуючі бактерії, природоохоронні біотехнології.
resistance of karst caverns nitrogen-fixing bacteria to extreme factors
O. B. Tashyrev1
O. S. Suslova1
P. V. Rokitko1 H. O. Oleksenko2
K. M. Bondar3
1Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine 2National University of «Kiyv-Mohyla Academy», Ukraine
3National Taras Schevchenko University, Kyiv, Ukraine
E-mail: olga.suslova11@gmail.com
To determine the studied bacteria resistance quantitative parameters of extreme factors such as toxic metals (Cu2+), organic xenobiotics (^-nitrochlorobenzene) and UV-irradiation were the aim of the research. Six strains of nitrogenfixing bacteria isolated from clays of two caverns Mushkarova Yama (Podolia, Ukraine) and Kuybyshevskaya (Western Caucasus, Abkhazia) and Azotobacter vinelandii УКМ В-6017 as a reference strain have been tested. For this purpose the maximum permissible concentration of Cu2+ and ^-nitrochlorobenzene in the concentration gradient and lethal doses of UV by the survival caverns have been determined. Maximum permissible concentrations for strains were as 10 ppm Cu2+, 70-120 ppm of ^-nitrochloroben-zene. The maximum doses of UV-irradiation varied in the range of 55-85 J/m2 (LD99 99). It is shown that three classes of extreme factors resistance parameters of karst caverns strains are similar to the strain of terrestrial soil ecosystems. The most active studied strains reduce the concentration of _p-nitrochlorobenzene in the medium in 13 times. The ability of nitrogen-fixing bacteria to degrade _p-nitrochlorobenzene could be used in creation new environmental biotechnology for industrial wastewater treatment from nitrochlo-roaromatic xenobiotics. Isolated strains could be used as destructors for soils bioremediation in agrobiotechnologies and to optimize plants nitrogen nutrition in terrestrial ecosystems.
Key words: karst caverns, nitrogen-fixing bacteria, environmental biotechnology.
49
